煙酰胺單核苷酸醇沉干燥工藝研究及微觀結構觀察

史玉龍，陳 洋，王本超，谷 平，濮夢華

（江西海文生物科技有限公司，江西 贛州 342400）

煙酰胺單核苷酸（Nicotinamide Mononucleotide，NMN），是一種自然存在的生物活性核苷酸[1]。在人體細胞能量生成中扮演重要角色，是細胞能量的重要來源之一，其廣泛參與人體多項生化反應，與免疫、代謝息息相關[1]。近年研究發現，人為補充NMN 能夠修復腦損傷、改善胰島功能、保護心臟免于缺血再灌注損傷、修復腦線粒體呼吸缺陷，對老年退行性疾病、視網膜退行性疾病、Ⅱ型糖尿病、腦出血等均具有一定治療作用[2]。NMN廣泛存在于毛豆、西蘭花、真菌、蝦等天然食物中，但是食用天然食物攝入NMN 的量，遠不能達到人體健康所需要的量[3]。因此將其應用于加工食品中，將對改善人體健康、預防疾病等起到重要的作用。

分離提純是NMN 工業化生產的關鍵工序之一，直接決定NMN 產品的質量。由于干燥對產品的顏色、結構和成分均有不同程度的影響，因而對NMN 生產成本和產品質量也有重要影響。目前熱風干燥[4]、噴霧干燥[5]、真空冷凍干燥[6]和微波干燥[7]等干燥方式雖已廣泛應用于各種產品干燥中，但上述幾種干燥方式應用于NMN 干燥中均存在難以解決的弊端：熱風干燥是目前最常用的干燥方式，具有操作簡單、便于控制的特點，但對于熱敏性產品具有較大局限性[8]；真空冷凍干燥雖然對產品的顏色、結構和成分保持較好，但該方法獲得產品水分不易達標，且極易吸潮[6]；噴霧干燥雖然具有較高的干燥速率，但對于熱敏性產品需要嚴格控制溫度的變化，進風溫度過高易導致有效成分降解，過低可能導致產品含水量過高[9]；微波干燥雖然速度快，但是在干燥過程中加熱不均勻，會導致物料部位焦化[10]。而當前文獻報道獲得NMN 成品的可行方法有醇沉后真空干燥[11]、冷凍干燥法[12]，其中醇沉法的原理是利用某些成分在水和醇中的溶解度差異，加入醇以后使其溶解度變小而沉淀[13-16]，得到晶體后進行真空干燥，繼而獲得NMN 成品。該方法是析晶得到煙酰胺單核苷酸相對簡單的方法。

本文鑒于煙酰胺單核苷酸易溶于水，微溶于醇類的性質，對醇沉分離純化煙酰胺單核苷酸的工藝操作條件進行優化，結合真空干燥方式獲得NMN成品，并利用掃描電鏡觀察醇沉得到的煙酰胺單核苷酸的微觀結構，分析該工藝的可靠性，為工業化分離純化煙酰胺單核苷酸提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

高效液相色譜儀，Agilent 1260，安捷倫；電子天平，梅特勒-托利多測量技術有限公司；真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；水浴鍋，常州高德儀器制造有限公司；20 L 結晶釜；掃描電鏡，臺式TM3030 型，日立高新技術公司；噴霧干燥機，上海繼譜電子科技有限公司；卡爾費休水分測定儀，泰州市銀河儀器廠。

煙酰胺單核苷酸，純度≥99.5% ，批號BT05H122L115，邦泰生物工程（深圳）有限公司；煙酰胺單核苷酸，自制，安徽瑞邦生物科技有限公司；乙醇；無水磷酸氫二鈉；二水磷酸二氫鈉；超純水；甲醇；卡爾費休試劑（含吡啶）。

1.2 煙酰胺單核苷酸的制備

1.2.1 對照品溶液的制備

稱取0.2 g（精確至0.1 mg）購買的NMN 樣品于100 mL容量瓶中，待進樣。

1.2.2 供試品溶液的制備

采用本公司生物酶催化法得到NMN 反應溶液，經離子交換樹脂過濾提純，得到NMN粗產物，再利用納濾（100 D）進行濃縮，最終經電滲析脫鹽和活性炭脫色后獲得NMN溶液。

1.3 醇沉工藝研究

1.3.1 醇沉體積分數考查

取3 份15 g/L 的NMN 供試品，分別加入乙醇，使乙醇終體積分數分別達到50%、60%、70%，50 r/mim 室溫攪拌1 h，離心，NMN 濕料在-0.08 MPa、50℃下干燥后檢測。

1.3.2 醇沉時間考查

取3 份15 g/L 的NMN 供試品，分別加入乙醇，使乙醇終體積分數70%，50 r/min 室溫攪拌1 h、2 h、3 h，離心，NMN濕料在-0.08 MPa、50℃下干燥后檢測。

1.3.3 醇沉溫度考查

取3 份15 g/L 的NMN 供試品，分別加入乙醇，使乙醇終體積分數70%，50 r/min 在4℃、10℃、25℃下攪拌1 h，離心，NMN濕料在-0.08 MPa、50℃下干燥后檢測。

1.3.4 醇沉溶液回收

為了減少乙醇的使用量和回收底液中的NMN，減輕危廢溶劑處理壓力和提升NMN 的收率，采用減壓蒸餾回收乙醇。42℃，轉速40 r/min，-0.1 MPa 開始減壓蒸餾。

1.4 干燥工藝研究

1.4.1 噴霧干燥

利用15 g/L 的NMN 供試品直接進行噴霧干燥，風機速度60%，進料速度設為10 mL·min-1，進風溫度為120℃，收集罐溫度梯度設置為90℃、95℃、100℃，結束后收集樣品檢測水分、NMN純度和含量等指標，確定該干燥方式的效果。

1.4.2 真空干燥

將上述離心得到的醇沉濕品于真空度為-0.08 MPa 的條件下，分別控制干燥溫度為40℃、50℃、60℃，干燥6 h 結束后，收集樣品檢測水分、NMN 純度和含量等指標，確定該干燥方式的效果。

1.5 掃描電鏡樣品的制備

取約10 mg 上述兩種樣品粘在樣品臺上，用吸耳球輕輕將散落在樣品臺上的細小粉粒吹除。將切好的樣品用導電膠粘在金屬平臺上鍍膜，用臺式掃描電鏡在15.0 kV加速電壓下觀察。

1.6 檢測方法

1.6.1 HPLC檢測

參考文獻[17]確定NMN 的HPLC 檢測方法。稱取0.02～0.03 g（精確到0.01 mg）樣品于100 mL 容量瓶中，準確記錄稱樣質量m1，并用超純水定容至刻度線，充分搖勻。稱取0.02～0.03 g（精確至0.01 mg）標樣于100 mL容量瓶中，準確記錄稱樣質量，并用超純水定容至刻度線，充分搖勻。迅速進樣計算其含量。稱取0.2 g（精確至0.1 mg）樣品于100 mL 容量瓶中，待進樣，采用液相色譜法，依據記錄的色譜圖，按峰面積歸一化法計算其純度。色譜條件：色譜柱：Eclipse plus C18 4.6*250 mm*5 μm；流動相：無水磷酸氫二鈉+二水磷酸二氫鈉+水=8 g+8 g+4 L；檢測波長：254 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

1.6.2 卡爾費休水分測定法

參照GB 8571—2002的測定方法[18]處理。

2 結果與分析

2.1 煙酰胺單核苷酸的醇沉

2.1.1 醇沉體積分數考查

由表1可見，隨著乙醇含量的增加，NMN純度、含量和收率逐漸增加。根據NMN的純度指標和市場價格確定生產效益，最終確定乙醇終濃度為70%。

表1 醇沉體積分數考查

2.1.2 醇沉時間考查

表2表明，隨著攪拌時間的延長，NMN純度、含量和收率逐漸增加，結合工業生產實際以及能耗等因素綜合考慮，最終確定醇沉攪拌時間為1 h。

表2 醇沉時間考查

2.1.3 醇沉溫度考查

表3 表明，隨著溫度的降低，NMN 的含量和純度并無較大差異，但收率有所提高，結合生產效益確定最終醇沉溫度為4℃。

表3 醇沉溫度考查

2.1.4 驗證實驗

綜合單因素實驗結果，確定最佳醇沉工藝為乙醇終濃度70%，4℃靜置1 h，離心得醇沉物，在-0.08 MPa和50℃的條件下干燥得到NMN成品，3 次驗證實驗結果見表4。

表4 驗證實驗結果

結果表明，NMN醇沉后平均純度為99.58%，平均收率為97.05%，結果較為穩定，說明該醇沉工藝穩定可行。

2.1.5 醇沉溶液回收（表5）

表5 醇沉溶液回收結果

經過醇沉析晶后，醇沉廢液中還含有3%的NMN。為增加收率，在-0.1 MPa 和溫度42℃條件下進行NMN和酒精的回收，發現蒸餾出的酒精含量可達90%，NMN含量可濃縮到12%，且并未出現明顯分解，因此確定醇沉溶液蒸餾回收條件可行。

2.2 煙酰胺單核苷酸的干燥

2.2.1 噴霧干燥

由表6 可見，隨著噴霧干燥收集罐溫度的升高，NMN 純度和含量逐漸降低，證明干燥過程中NMN 分解，且水分并未隨著溫度的升高而減少。

表6 噴霧干燥結果

2.2.2 真空干燥

通過NMN 醇沉濕品在不同溫度條件下干燥發現，在40℃下NMN 純度較高，但水分含量也較高；60℃下NMN雖然水分達標，但純度和含量降低。表7中50℃條件下NMN 的含量、純度和水分都達到了團體標準T/CASME 011—2021 中優品的要求。因此確定該干燥工藝可與醇沉工藝結合，可穩定得到NMN優品。

表7 醇沉樣品真空干燥結果

2.3 醇沉樣品的微觀結構

由圖1（a）（c）可知，醇沉后真空干燥的NMN 成品結構為針狀，水分更易干燥。噴霧干燥的單個NMN表面光滑平整呈球狀，大量細碎小顆粒附著在其表面，NMN成品顆粒大小分布極其不均勻，且顆粒表面未出現氣孔，見圖1（b）（d），可能由于過低的噴霧溫度未能使得內部受熱，最終導致液滴中的水分不能充分蒸發所致。

圖1 NMN成品掃描電鏡圖

3 結論與討論

（1）通過研究醇沉法析晶制備NMN，實驗考查了多種因素對其制備的影響，探究了不同醇沉時間、乙醇體積分數和醇沉溫度并對該單因素實驗結果進行驗證。以15 g/L NMN 溶液經過醇沉法和干燥得到NMN成品，最佳反應條件：乙醇終濃度70%，4℃攪拌1 h。

（2）通過醇沉溶液減壓蒸餾回收乙醇和NMN，回收的乙醇含量可達90%，反復套用可減少乙醇用量，且濃縮得到乙醇廢液中的NMN，提高了收率。最終醇沉析晶干燥工段NMN 純度和收率分別達到了99.93%和99.92%。

（3）本研究發現噴霧干燥并不適用于NMN 的干燥。最終確定通過醇沉析晶與真空干燥結合可獲得水分為0.26%，含量為99.68%，純度為99.90%的NMN優品。

（4）利用掃描電鏡觀察，發現噴霧干燥可能由于過低的溫度未能使得NMN 內部充分受熱，水分不能完全蒸發；而醇沉后NMN 的結構較易將水分蒸發，經過真空干燥可使其水分、含量和純度都符合標準。