基于網絡藥理學及分子對接技術探討仙靈骨葆膠囊治療骨質疏松癥的潛在機制※

趙燦斌,郭超,李曉陽,閆小龍,管東輝

(1.山東中醫藥大學,山東 濟南 250014;2.山東中醫藥大學附屬醫院,山東 濟南 250000)

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨小梁減少、骨量降低、骨皮質變薄為主要特征,易致骨脆性增加的全身性代謝性骨病[1]。隨著社會經濟的不斷發展,我國OP患者的數量逐漸上升,該人群因骨密度下降、骨強度降低,更易在損傷中發生骨折。西醫治療OP包括降鈣素、甲狀旁腺素、維生素D等藥物[2]。然而對于特定西藥治療OP的實驗結論的普適性有待商榷。相比西藥,中藥尤其是中藥復方有多層次、寬領域的治療及調節作用,在防治OP的過程中具有較大的優勢。

OP在中醫中歸屬“骨痿”(《素問·痿論》)、“骨枯”(《素問·玉機真臟論》)、“骨痹”(《素問·長刺節論》)之類。中醫認為,五臟中的腎與骨的生長發育及生理功能密切相關。腎藏精,精生髓,髓實則骨壯,故腎中精氣的盛衰在骨骼生長發育過程中起到重要的作用。OP患者的骨代謝指標與脾腎陽虛證、腎陽虛證等中醫證候密切相關[3]。傳統中醫理論與現代醫學理論相結合,對“補腎壯骨”“補益肝腎”“調補脾腎”等中醫理論指導下的中藥防治OP的研究提供新的思路[4]。仙靈骨葆膠囊成分包括淫羊藿、續斷、丹參、知母、補骨脂、地黃,治療OP療效較好。臨床試驗證明,仙靈骨葆膠囊對原發性OP、絕經后女性OP等有安全且全面的作用,可有效改善L2～4、股骨頸及股骨粗隆等部位的骨密度[5-6]。本文運用網絡藥理學與分子對接技術,通過探究仙靈骨葆膠囊的藥物成分及核心蛋白、靶點、信號通路等,進一步揭示仙靈骨葆膠囊治療OP的機制。

1 資料與方法

1.1 藥物化合物、作用靶點及靶點基因的篩選 仙靈骨葆膠囊由淫羊藿、續斷、丹參、知母、補骨脂、地黃組成。本文藥物化合物通過TCMSP數據庫(http://tcmsp-e.com)及TCMID數據庫(http://47.100.169. 139:8000/tcmid)獲取。將獲得的化合物導入PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中獲取其2D結構的SDF文件。將收集好的化合物SDF文件導入SwissTargetADME(http://www.swissadme.ch/)進行藥物代謝動力學篩選,以胃腸道吸收率(GI absorption)為高(high),且藥物類似性(Druglikeness)中Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 5個指標中“yes”的數量≥2為篩選標準。將符合篩選標準的化合物SDF文件導入SwissTargetPrediction(www. swisstargetprediction.ch)中進行靶點預測,以Probability≥0.4為篩選條件獲得符合條件的靶點信息,然后將所得靶點輸入Uniprot(https://www.uniprot. org)數據庫,選擇人類(Homo sapiens)為物種獲取靶點對應的基因。經過篩選獲得淫羊藿、續斷、丹參、知母、補骨脂、地黃的有效化合物、作用靶點及靶點基因,并記錄該數據信息。

1.2 OP相關疾病的靶點及靶點基因的篩選 在DrugBank數據庫(https://go.drugbank.com)、DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org)以“osteoporosis”為關鍵詞進行檢索,記錄其靶點的名稱,并將所得靶點導入Uniprot數據庫,選擇人類(Homo sapiens)為物種獲取靶點基因。

1.3 藥物靶點與OP靶點的Venn分析 將仙靈骨葆膠囊藥物化合物的作用靶點與OP的疾病基因靶點導入DrawVennDiagram(bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/Venn/)進行Venn分析,得到兩者共有的靶點,即為仙靈骨葆膠囊治療OP的有效靶點。

1.4 構建蛋白質相互作用關系網絡(PPI) 將上述1.3步驟中得到的交集靶點導入String數據庫(https://www.string-db.org),構建PPI網絡,將其結果導入Cytoscape 3.7.0進行拓撲計算,根據節點度值分布(node degreedistribution)、介度中心度(betweenness centrality)和接近中心度(closeness centrality)3個參數進行遴選,選取三者同時在中位數之上的靶點作為仙靈骨葆膠囊治療OP的關鍵核心靶點,導出計算后數據進行蛋白質篩選,得到核心蛋白,并再次構建核心蛋白的PPI網絡。

1.5 獲取核心有效化合物 通過1.4中得到的核心靶點,篩選出核心靶點所對應的化合物為核心有效化合物,剔除與核心靶點不對應的化合物。通過對比1.1中所記錄的數據信息,得到與核心靶點對應的核心有效化合物,得到其對應的核心靶點數目的排名。

1.6 GO功能富集及KEGG通路富集分析 將1.4所得到的核心靶點信息導入OmicShare Tools分析工具,選擇GO功能富集及KEGG通路富集分析,得到結果圖像并將其導出。

1.7 分子對接驗證 選取1.5中所對應的核心靶點數目排名前4位的化合物,從TCMSP及TCMID數據庫中取得化合物的分子結構,并導入PubChem中獲得化合物的SDF文件,通過Open Babel3.1.1轉化為mol2格式。從核心靶點PPI網絡中篩選Degree值排名前3位的靶點,由PDB數據庫(https://www.rcsb.org)獲取化合物的3D蛋白結構的pdb格式文件,上述兩者的分子結構文件使用Auto Dock Tools 1.5.6軟件轉換為pdbqt格式文件,利用Auto Dock 4.2.6軟件進行分子對接。通過Pymol 2.4.0 軟件將分子對接最穩定的化合物與基因靶點蛋白進行可視化分析。

2 結果

2.1 仙靈骨葆膠囊化合物成分的篩選 在TCMSP數據庫與TCMID中獲得的化合物通過SwissTargetADME篩選,共得到127種化合物成分,其中藥物獨有的成分如下:補骨脂27種、丹參57種、地黃5種、續斷5種、淫羊藿18種、知母9種;藥物共有的成分如下:丹參與淫羊藿共有2種,知母與淫羊藿共有2種,續斷、淫羊藿、地黃共有1種,知母與地黃共有1種。根據127種化合物成分的SDF文件導入SwissTargetPrediction進行靶點預測,找到其對應的作用靶點蛋白并與Uniprot數據庫選擇人類(Homo sapiens)進行基因靶點對比,剔除重復、無效的靶點,共得到360個靶點。

2.2 疾病靶點獲取結果 通過DrugBank及DisGeNET數據庫中檢索到與OP相關的基因靶點分別為340、1 098個,通過相關性評價得分遴選,剔除重復疾病基因靶點,共得到1 234個OP相關基因靶點。

2.3 藥物與疾病靶點的Venn圖建立 將2.1及2.2得到的1 234個疾病相關的基因靶點與360個有效藥物的作用靶點導入DrawVennDiagram進行Venn分析,共得到仙靈骨葆膠囊潛在作用于OP的118個靶點。見圖1(掃描題目右側二維碼查看)。

2.4 PPI的構建 將2.3得到的藥物與疾病的交集靶點基因導入String數據庫,物種設置為人類(Homo sapiens),運行后得到PPI網絡,并隱藏3個未參與蛋白相互作用的靶點,共有115個靶點蛋白參與PPI網絡構建。見圖2(掃描題目右側二維碼查看)。

2.5 核心靶點篩選 從String數據庫平臺下載PPI網絡文件,經Cytoscape 3.7.0軟件渲染后,導出經過網絡拓撲屬性分析計算后的Excel文件,利用Excel函數公式篩選仙靈骨葆膠囊的核心靶點。計算后可知115個靶點度值中位數為28,介度中心度的中位數為2.569×10-3,接近中心度的中位數約為0.558。經過篩選,3個數值在中位數以上的靶點共有47個,度值較高的前6位分別為TP53(83)、TNF(83)、AKT1(80)、IL6(79)、HIF1A(72),JUN(72),這些靶點在PPI網絡中處于關鍵位置,可能在仙靈骨葆膠囊治療OP的過程中起到關鍵作用,將此47個靶點同上操作,導入String數據平臺構建PPI網絡,見圖3(掃描題目右側二維碼查看)。在2.1記錄的信息文件中尋找將47個核心靶點及所映射的化合物及中藥數據,通過數據對比得到與核心靶點對應的化合物。其中對應靶點數目排名前4位的是木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)和脫水淫羊藿素(anhydroicaritin),這4種化合物對應的靶點數目從高到低依次是26、24、14、6。

2.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 將仙靈骨葆膠囊治療OP的47個核心靶點導入g:Profiler(https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost),將靶點基因ID轉化為ENSG ID,然后將轉換好ID的靶點導入OmicShare Tools進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,經過校正P值,P<0.05后,得到10個分子功能類別,其中包括核受體活性(nuclear receptor activity)、雙鏈DNA結合(double-stranded DNAbinding)等;得到10個生物學過程,其中包括對含氧化物的反應(responseto oxygen-containing compound)、對細胞因子的反應(response to cytokine)、細胞增殖調控(regulationof cell proliferation)等;得到10個細胞成分,其中包括膜筏(membrane raft)、轉錄因子復合物(transcription factor complex)等。P值越小代表富集程度越高,遴選出每個類別富集程度最高的10個結果,使用OmicShare Tools工具建立氣泡圖,見圖4-1、4-2、4-3(掃描題目右側二維碼查看)。KEGG通路富集分析得到127條信號通路,其中根據閾值P<0.01進行篩選,取排名前20位的通路,包括腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)等,建立氣泡圖,見圖5(掃描題目右側二維碼查看)。

2.7 藥物化合物與核心靶點的分子對接 核心靶點數目排名前4位的化合物是木犀草素、山柰酚、槲皮素和脫水淫羊藿素,核心靶點PPI網絡中度值前3位的靶點分別是TP53、TNF、AKT1,見表1。核心靶點的蛋白運用PDB數據庫(https://www1.rcsb.org/)獲得PDB文件,Pymol 2.4.0 軟件打開,進行脫水等一系列處理;化合物從TCMSP與TCMID數據庫中找到對應的PubChem ID,并導入PubChem數據庫獲得SDF文件,使用Open Babel 3.1.1軟件將文件從SDF格式轉化為mol2格式,并用 Auto Dock 4.2.6 軟件打開處理后的化合物及蛋白質文件,并進行進一步處理,處理完成后將化合物與蛋白質兩兩進行分子對接處理。就分子對接而言,結合能(bindingenergy,kcal/mol)越小,表明化合物與蛋白質之間結合得越牢固,其數值小于-4.25 kcal/mol時,表示化合物與蛋白質之間有一定結合活性。由表1可知,所有對接能都小于-4.25 kcal/mol,說明化合物與靶蛋白之間均有結合活性[7]。通過Pymol 2.4.0 軟件對上述化合物與蛋白質進行分子對接可視化分析,見圖6-1～圖6-12(掃描題目右側二維碼查看)。通過分子對接發現,脫水淫羊藿素與活性位點附近的GLU-40、LYS-39、LEU-52這3個氨基酸形成氫鍵結合到AKT1,與活性位點附近的ALA-134、ILE-136、ASN-46這3個氨基酸形成氫鍵結合到TNF,與活性位點附近的LSY-132、GLU-271、ARG-248、GLN-165這4個氨基酸形成氫鍵結合到TP53。山柰酚與活性位點附近的GLN-47、GLU-40、LYS-39這3個氨基酸形成氫鍵結合到AKT1,與活性位點附近的TRP-28、ASN-46、ALA-134、ILE-136這4個氨基酸形成氫鍵結合到TNF,與活性位點附近的GLN-144、CYS-229、GLU-224、PRO-222、GLU-198這5個氨基酸形成氫鍵結合到TP53。木犀草素與活性位點附近的LEU-78、GLN-61、ARG-76這3個氨基酸形成氫鍵結合到AKT1,與活性位點附近的ASN-34、PHE-144、GLN-149、VAL-150這4個氨基酸形成氫鍵結合到TNF,與活性位點附近的GLU-285、ARG-248、GLN-165、LYS-132這4個氨基酸形成氫鍵結合到TP53。槲皮素與活性位點附近的LYS-8、GLU-98、GLU-9這3個氨基酸形成氫鍵結合到AKT1,與活性位點附近的ALA-33、PHE-144、GLN-149、VAL-150這4個氨基酸形成氫鍵結合到TNF,與活性位點附近的ARG-248、LYS-132、GLU-285、ARG-273、GLN-165這5個氨基酸形成氫鍵結合到TP53。

表1 仙靈骨葆膠囊藥物化合物與核心靶點的分子對接表(kcal/mol)

3 討論

本研究結果顯示,仙靈骨葆膠囊發揮療效的主要化合物包括木犀草素、山柰酚、槲皮素和脫水淫羊藿素等。研究表明,RA NLRP3炎性小體過表達可被木犀草素潛在抑制,且后者可降低血管內皮生長因子(VEGF)等蛋白的表達,增強骨保護素(OPG)蛋白表達,進而對骨關節起到保護作用[8]。木犀草素可有效減輕氧化損傷,其作用機制可能與潛在保護MC3T3-E1類成骨細胞氧化應激反應有關[9]。骨丟失過程可被糖皮質激素誘導,山柰酚可以通過保護成骨細胞存活以抑制此過程的發生[10]。槲皮素能通過增加骨小梁的結構和數量、增加骨密度以預防及治療失用性OP,其作用途徑可能與抑制ERK1/2、MAPK mRNA和蛋白的表達,進而抑制ERK1/2-MAPK信號通路有關[11]。此外,有實驗證明,槲皮素可通過升高BMP2和Smad4的表達水平,進而促進成骨細胞分化以緩解OP[12]。脫水淫羊藿素具有抗氧化活性的作用,研究表明,1×10-5mol-1濃度的脫水淫羊藿素能提高成骨細胞中堿性磷酸酶的活性,增強成骨細胞的生理功能,可以提高BMP-2、OSX和Runx-2等與成骨細胞成熟礦化相關因子的mRNA表達,進而增加能促進骨基質礦化的鈣鹽[13-14]。綜上所述,仙靈骨葆膠囊中一些潛在分子活性成分通過抑制破骨細胞的生成、促進骨細胞成熟礦化作用等對OP起到預防及治療的作用。

然而當前利用網絡藥理學方法研究中藥、中藥方劑的作用機制尚存在諸多不足。網絡藥理學基于現代生物藥劑學分類系統,適用于單一化學成分的預測,但不適合中藥復雜系統的研究,中藥不同于化學成分單一的化學藥,中藥方劑更不是化學成分的簡單加和[15]。在篩選所謂有效成分的參數設置中,除口服生物利用度(OB)和/或類藥性(DL)外,其他諸多性質也會影響藥物活性,在確定有效成分時需全面考慮這些影響因素,而網絡數據庫基于吸收、分布、代謝、排泄(ADME)等數據處理方式的篩選,忽略了成分含量對藥效的影響,忽略了中藥成分間的相互作用,包括相互調節體內吸收和體內過程等作用,忽略了藥物成分可能通過調節腸道菌群而發揮間接治療作用,尤其體現于忽略了滋補類中藥的多糖類成分的菌群調節作用等。基于以上不足,導致網絡藥理學推測出的所謂活性成分與基礎研究已經證實的重要活性成分有很大出入,導致所得結果與真實情況不符。仙靈骨葆膠囊由淫羊藿、續斷、丹參、知母、補骨脂、地黃組成。研究表明,0．10 μmol/L濃度的異補骨脂素可有效促進成骨細胞的增殖分化[16];中藥地黃中梓醇、桃葉珊瑚苷、毛蕊花糖苷可增強成骨細胞中堿性磷酸酶活性,在一定程度上可加速破骨細胞的凋亡[17];淫羊藿的活性成分淫羊藿總黃酮可促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化,提高骨修復,促進骨形成[18]。此外,大鼠體外細胞實驗研究表明,續斷皂苷可促進骨鈣素升高,提高成骨細胞堿性磷酸酶活性[19];知母皂苷元能促進骨形成,抑制骨吸收,調節骨代謝[20];丹參素可以增加成骨細胞分化相關基因、堿性磷酸酶及骨鈣素的表達,阻止OP的發生[21]。以上藥物化合物都已經被證實對OP的防治有明顯的作用。本文通過網絡藥理學推測出的有效成分主要是一些黃酮類成分,如槲皮素、山柰酚、木犀草素等,與已經研究證實的藥物化合物相差甚遠。由此而見,依托于網絡藥理學技術手段進行藥物的理論分析仍存在較大的局限性,更加精確的藥物作用機制還需進一步實驗證明。