消渴健脾膠囊對(duì)脾虛濕盛型2型糖尿病大鼠生化指標(biāo)及病理組織學(xué)的影響※

馬美玲,楊明霞,丁然然

(1.新疆醫(yī)科大學(xué),新疆 烏魯木齊 830000;2.新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830000)

糖尿病是常見的內(nèi)分泌代謝疾病,以體內(nèi)胰島素缺乏或抵抗引起的葡萄糖水平升高、蛋白質(zhì)與脂質(zhì)代謝紊亂為主要特征[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù),預(yù)測到2030年,全球糖尿病人數(shù)約為5.78億人,到2045年,全球患糖尿病人數(shù)約為7億人,其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)占90%以上[2]。T2DM常伴有肝、脾、肺等多器官損傷,嚴(yán)重危害患者的身心健康,帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。消渴健脾膠囊是烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院創(chuàng)制的院內(nèi)制劑,該藥物由蒼術(shù)、茵陳、葛根、白術(shù)等多味藥物組成,具有健脾燥濕、行氣和胃、祛濁化郁的功效,在治療脾失健運(yùn)、濕阻中焦、腑氣不通所致的口干口苦、乏力汗多、大便干燥、肥胖、糖脂代謝紊亂等方面療效較好[4]。本研究主要研究消渴健脾膠囊對(duì)脾虛濕盛型2型糖尿病大鼠生化指標(biāo)及病理組織學(xué)的影響,進(jìn)一步明確消渴健脾膠囊治療脾虛濕盛型2型糖尿病的作用機(jī)制,為該藥的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 選取SPF級(jí)雄性SD大鼠50只,6～8周齡,體質(zhì)量(200±20)g,購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,生產(chǎn)許可證SYXK(新)2018-0001。基礎(chǔ)飼料由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;高脂高糖飼料購于北京愛博港生物有限公司,成分重量百分比組成為基礎(chǔ)飼料67.7%、蔗糖20%、豬油10%、膽固醇2.0%、膽酸鹽0.3%。

1.2 藥物 消渴健脾膠囊藥物組成:蒼術(shù)15 g,白術(shù)15 g,大黃10 g,厚樸10 g,茵陳10 g,茯苓10 g,梔子6 g,土茯苓6 g,車前子6 g,萊菔子6 g,丹參6 g,木瓜6 g。由烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供,使用時(shí)用0.9%氯化鈉注射液配制成含藥量1 g/mL的藥液。

1.3 主要試劑 鏈脲佐菌素(批號(hào)010-83004443),購自美國Sigma公司;檸檬酸鈉(批號(hào)CA8號(hào)6132-04-3),購自成都市科龍化工試劑廠;檸檬酸(批號(hào)20200107),購自上海青浦群力化工廠;0.9%氯化鈉注射液(批號(hào)19022701),購自新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司;無水乙醇(批號(hào)XK20-0123-006)、二甲苯(批號(hào)XK13-001-00031),購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司;伊紅染液(批號(hào)ML5641)、蘇木素染液(批號(hào)C210903),購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.4 主要器材 邁瑞 BS-240VET全自動(dòng)生化儀;拜安進(jìn)血糖儀、血糖試紙(安晟信糖尿病保健股份公司);無菌注射器(國安醫(yī)械科技有限公司);多管架離心機(jī)(新疆醫(yī)科大學(xué));自動(dòng)真空組織脫水機(jī)、石蠟切片機(jī)、包埋機(jī)(德國徠卡,RM2245)。

2 方法

2.1 造模 將50只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,采用隨機(jī)數(shù)字法取10只作為空白組,其余40只大鼠給予高脂飼料飼養(yǎng)8周,腹腔注射STZ(35 mg/kg)溶液2次,注射間隔7 d。T2DM大鼠造模成功標(biāo)準(zhǔn)為隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L。將T2DM大鼠采用過勞+飲食不節(jié)+濕熱環(huán)境法進(jìn)行脾虛濕盛型造模:大鼠每天在水迷宮游泳30 min,單日喂食高脂飼料,雙日喂食大白菜(大白菜喂食量不限,自由進(jìn)水),3周后將大鼠放入人工氣候艙1周[溫度(32±0.5)℃、濕度(65±0.5)%],大鼠出現(xiàn)倦怠扎堆取暖、懶動(dòng)、毛色晦暗、糞便稀溏或帶黏液表明造模成功。

2.2 分組及給藥 將造模成功的脾虛濕盛型T2DM大鼠隨機(jī)分為模型組和消渴健脾膠囊低、中、高劑量組,每組10只。空白組、模型組給予0.9%氯化鈉注射液5 mL/kg灌胃;消渴健脾膠囊低、中、高劑量組分別給予消渴健脾膠囊溶液50、100、200 mg/kg濃度灌胃。給藥劑量參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[5]。每日灌胃1次,連續(xù)4周,平時(shí)給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。

2.3 標(biāo)本收集 末次給藥24 h后,剪取大鼠尾部靜脈血檢測空腹血糖(FBG)。采用1%戊巴比妥溶液(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,解剖后于腹主動(dòng)脈取血,4 ℃冰箱保存。采血后摘取大鼠胰腺、脾臟、心臟、肺臟,用0.9%氯化鈉注射液沖洗后,保存至4%多聚甲醛中固定24 h。

2.4 生理指標(biāo) 各組大鼠在造模前、造模后、干預(yù)治療后測定體質(zhì)量。

2.5 生化指標(biāo) FBG:大鼠禁食12 h斷尾采血,用血糖儀測定血糖。糖化血清蛋白(GSP):大鼠禁食12 h,腹主動(dòng)脈采血5 mL,用離心機(jī)27 ℃恒溫離心15 min(2 500 r/min,離心半徑=10 cm),取血清,采用酶聯(lián)免疫吸附法測定(ELISA)。

2.6 標(biāo)本制備 將經(jīng)4%多聚甲醛固定液浸泡固定的大鼠組織標(biāo)本切成2 mm×3 mm×4 mm大小的組織塊。①脫水:將大鼠組織固定于4%多聚甲醛24 h以上,取出后用潔凈的水沖洗4 h,然后進(jìn)行梯度洗脫,順序?yàn)?0%(1 h)、80%(1 h)、90%(1 h)、95%(1 h)、100% Ⅰ(0.5 h)、100% Ⅱ(0.5 h)。②將洗脫后的組織放入石蠟內(nèi),置于包埋機(jī)上冷卻,用鉛筆做好標(biāo)記。③樣本完全冷卻后,切成5 μm的薄片,放于45 ℃水浴鍋中展開,轉(zhuǎn)移到載玻片上,在60 ℃溫箱中烘干2 h。④依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇15 min、無水乙醇25 min、75%酒精5 min,自來水沖洗10 min。切片烘干。⑤蘇木素浸染3 min,蒸餾水洗后,用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒。水洗30 s后烘干。⑥伊紅液染色6 s、水洗3 s 后,切片依次放入95%酒精Ⅰ 5 min、95%酒精Ⅱ 5 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min中脫水透明,拿出烘干。⑦烘干后用中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡鏡檢,觀察采集圖像并分析結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 消渴健脾膠囊對(duì)各組大鼠體質(zhì)量的影響 與空白組比較,其余各組大鼠造模后體質(zhì)量均明顯下降(P<0.05)。干預(yù)后,與模型組比較,消渴健脾膠囊低、中、高劑量組體質(zhì)量均有增加,其中高、中劑量組增加明顯(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠造模前、造模后、藥物干預(yù)后體質(zhì)量比較

3.2 消渴健脾膠囊對(duì)各組大鼠FBG、GSP水平的影響 給藥4周后,與空白組比較,模型組FBG水平升高(P<0.05);低、中、高劑量組FBG水平較模型組明顯降低(P<0.05)。與空白組比較,模型組GSP水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,消渴健脾膠囊中、高劑量組GSP水平明顯降低(P<0.05);低劑量組GSP水平與模型組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠給藥4周后空腹血糖、糖化血清蛋白水平比較[M(P25,P75)]

3.3 消渴健脾膠囊對(duì)各組大鼠病理組織形態(tài)學(xué)的影響 如圖1(掃描題目右側(cè)二維碼查看)所示,空白組大鼠心肌細(xì)胞染色均勻,心肌纖維排列整齊,結(jié)構(gòu)紋理清晰,形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,分界清晰,未見明顯炎癥。模型組組織中可見較多心肌纖維斷裂,空泡變性,呈波浪狀排列,胞質(zhì)中可見較小的圓形空泡,少量心肌纖維水腫,胞質(zhì)疏松淡染,有炎癥細(xì)胞浸潤。中、高劑量組組織染色均勻,心肌纖維排列整齊,形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,分界清晰,未見明顯炎癥。

如圖1(掃描題目右側(cè)二維碼查看)所示,空白組大鼠脾小體組織結(jié)構(gòu)正常,紅髓和白髓比例正常。模型組大鼠脾小體動(dòng)脈壁增厚,管腔變小,紅髓和白髓比例異常,生發(fā)中心不明顯。中、高劑量組大鼠脾臟在干預(yù)后,脾小體被膜皺縮逐漸緩解,紅髓和白髓比例正常,結(jié)構(gòu)清晰,可觀察到明顯的生發(fā)中心。

如圖1(掃描題目右側(cè)二維碼查看)所示,空白組大鼠肺臟組織正常,肺泡內(nèi)無出血現(xiàn)象,結(jié)構(gòu)完整清晰,肺泡壁薄。模型組大鼠肺泡內(nèi)有出血現(xiàn)象,肺泡壁厚度增加,肺泡面積減小,肺泡腔可見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤。低劑量組與模型組無太大差異。中、高劑量組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰,肺泡無破裂、塌陷現(xiàn)象,無明顯淤血,肺泡壁增厚減輕,肺間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤減少。

如圖1(掃描題目右側(cè)二維碼查看)所示,空白組大鼠胰腺內(nèi)胰島結(jié)構(gòu)清晰,數(shù)量較多,胰島細(xì)胞排列有序,形態(tài)清晰且規(guī)則,胞漿豐富,邊界分明。模型組胰島數(shù)量減少,細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞萎縮或塌陷較多,胰島形態(tài)不規(guī)則。中、高劑量組胰島體積均有不同程度的減少,胰島細(xì)胞萎縮現(xiàn)象較模型組減少明顯,胰島細(xì)胞排列優(yōu)于模型組。

4 討論

T2DM屬于中醫(yī)“消渴”“脾癉”“消癉”等范疇。《素問·奇病論》云:“此人必?cái)?shù)食甘美而多肥也,肥者令人生熱,甘者令人中滿,故其氣上益,轉(zhuǎn)為消渴。”長期過食肥甘厚味是發(fā)生T2DM的重要因素,飲食不節(jié)、過食肥甘厚味損傷脾胃,脾虛運(yùn)化無力是其關(guān)鍵,中焦升降失司,水谷精微不能輸布濡養(yǎng)周身,因此產(chǎn)生痰、濕、瘀等病理產(chǎn)物,導(dǎo)致高血糖、高血脂、肥胖、胰島素抵抗等證[6]。這說明脾臟的功能失司是T2DM發(fā)生的重要因素。脾為后天之本,脾虛濕盛是T2DM的主要病機(jī),益氣燥濕健脾為T2DM的主要治法。

消渴健脾膠囊具有健脾化濕、消脹泄?jié)M、行氣止渴、泄熱祛煩的功效,用于T2DM及其并發(fā)癥的臨床療效較好[7-8]。臨床研究表明,消渴健脾膠囊能降低T2DM患者血清瘦素、血糖水平,改善胰島功能,增加胰島素敏感性[8-9]。本研究結(jié)果顯示,相較于模型組,消渴健脾膠囊中、高劑量組FBG、GSP水平均明顯降低,說明消渴健脾膠囊可降低大鼠血糖。研究發(fā)現(xiàn),蒼術(shù)具有降低血糖、血尿酸、血壓及保護(hù)心肌的作用[10];白術(shù)中的有效成分可與前蛋白轉(zhuǎn)化酶結(jié)合,在T2DM中發(fā)揮著重要作用[11];茯苓味甘入脾經(jīng),功效補(bǔ)益和中,與白術(shù)合用,增強(qiáng)茯苓健脾之效;葛根可減輕胰島素抵抗的程度,保護(hù)胰島β細(xì)胞[12]。本研究結(jié)果顯示,干預(yù)后消渴健脾膠囊中、高劑量組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,排列規(guī)則,分界清晰,細(xì)胞間質(zhì)未見明顯炎癥及異常;脾臟組織結(jié)構(gòu)正常且清晰;肺泡結(jié)構(gòu)完整清晰,無出血,肺間質(zhì)炎癥浸潤減少;胰腺組織胰島結(jié)構(gòu)清晰,體積減小,胰島細(xì)胞萎縮現(xiàn)象較模型組明顯減少。

綜上所述,消渴健脾膠囊可顯著降低脾虛濕盛型T2DM大鼠血糖水平,改善大鼠心臟、脾臟、肺臟、胰腺等組織的病理改變,提示消渴健脾膠囊在治療脾虛濕盛型T2DM方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值;同時(shí),本研究初步探討消渴健脾膠囊具有改善大鼠病理組織的作用,為消渴健脾膠囊在脾虛濕盛型T2DM中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。