表達SmERF1 調節煙草種子大小及耐鹽性

化文平,孔維維,韓立敏,曹曉燕

(1 陜西學前師范學院 生命科學與食品工程學院,西安 710061;2 陜西師范大學 生命科學學院,西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室,藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室,西安 710062)

乙烯響應因子(ethylene-responsive factor,ERF)是植物特有的一大類轉錄因子,越來越多的研究表明,ERF家族成員參與植物的各類生物或非生物的脅迫反應[1]。在擬南芥中AtORA59和AtERF1能激活PDF1.2基因表達從而提高對脅迫的抗性[2];過表達GmERF113可以激活抗性基因PR1和PR10-1,增強大豆對大豆疫霉菌的抗性[3];過表達MnERF2可以顯著提高桑樹對干旱脅迫的耐受性[4];MsERF40和MsERF05在新疆野蘋果抗腐爛病過程中發揮重要作用[5]。

藥用植物丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)以干燥根莖入藥,被廣泛應用于心腦血管疾病的治療。目前已從丹參基因組數據庫中鑒定得到79個ERF轉錄因子[6],但僅SmERF6、SmERF1L1、SmERF73、SmERF128和SmERF115的功能被探明與丹參酮和丹酚酸的合成調控相關[7-10],SmORA1主要與植物的抗病性相關[11]。前期研究發現SmERF1(Gen-Bank No.KC405081.1)在丹參中可以調節丹參的抗性[12],為進一步探究SmERF1功能,該研究在模式植物煙草中過表達SmERF1,發現它不僅調節植物激素合成,調節轉基因煙草的抗性,而且還影響植物種子大小,預示在植物農藝學性狀改良方面存在一定潛能。

1 材料和方法

1.1 植物材料培養

把煙草(Nicotianatabacum)種子種植于含有蛭石、草木灰的花盆中,每周澆水1次,培養室內保持濕度60%,溫度22 ℃,每日光照16 h。1月齡的煙草幼苗用于轉基因操作。鑒定得到的轉基因煙草在MS培養基上繼代培養6周后,進行煉苗,移栽在含腐殖質土的花盆中,在人工氣候箱培養直至種子成熟。培養條件:24 ℃,濕度60%,每日光照14 h。收集種子(T0)在花盆中種植,幼苗經PCR 鑒定后直至種子成熟獲得T1代種子;T1代煙草種子同樣條件種植,并再次進行PCR 鑒定,成熟后獲得T2代煙草種子。

1.2 轉基因煙草種子分析和轉基因株系獲得

用體式顯微鏡觀察比較T2代煙草種子大小,并稱量T2代種子的千粒重。以同批種植收獲的未轉基因的煙草種子為對照,分析轉基因煙草種子變化。

用Gateway的方法構建表達SmERF1的植物表達載體pO-ERF[12]。將其以凍融法轉入農桿菌GV3101[13],用葉脈注射法轉化煙草[14],在含0.5 mg/L有IBA和10 mg/mL草胺磷(Basta)的1/2 MS培養基上進行篩選培養。通過PCR 方法檢測隨同轉入的質粒載體上CaMV35S啟動子序列片段(上游引物:5′-AATCTTCGTCAACATGGTGGAGC-3′,下游引物:5′-GCTGTCGTCGCCGGAGAATA-3′),鑒定轉基因煙草植株[12]。

1.3 基因表達檢測

植物總RNA 提取、cDNA 合成及實時定量分析方法參見課題組之前研究[11]。用Primer premier 5軟件設計實時定量PCR 引物,以NtActin基因(U60495.1)為內參,用實時熒光定量PCR 方法進行基因檢測[11]。檢測引物見表1。

表1 實時定量PCR 引物Table 1 Primers used for the real time quantitative PCR

1.4 T2 代轉基因煙草中激素和葉綠素含量檢測

T2代轉基因煙草種子萌發1個月后的幼苗用于檢測ABA 和GA 濃度。取轉基因植株及對照株系的新鮮葉片,按照植物脫落酸(ABA)酶聯免疫分析試劑盒、植物赤霉素(GA)酶聯免疫分析試劑盒(均購自陜西脈元生物技術公司)說明書要求檢測相應激素含量。

用T2代煙草種子萌發后2周齡的幼苗進行生物量統計和葉綠素含量測定。葉綠素含量檢測參照Frank等的方法[15]:取200 mg新鮮幼苗植株,研磨成粉末狀,然后轉到10 mL 離心管,加入10 mL 80%丙酮溶液,充分混合后4 ℃提取24 h。4 ℃下12 000g離心3 min,得到的上清液用紫外分光光度計(SHIMADZU UV-2450,Japan)在665 nm 和649 nm 波長下檢測OD 值。總葉綠素(a和b)計算按照Ren等[16]的方法進行。

1.5 轉基因煙草抗性分析

T2代煙草種子(即野生對照煙草種子)在無菌濾紙上萌發至約1 cm,進行移栽至含有腐殖土的花盆中,在人工氣候箱中按照上述條件培養。移栽后2個月的植株用于抗性處理分析。用400 mmol/L NaCl溶液進行鹽脅迫處理(約50 mL NaCl溶液/盆),每3 d處理1次。開始處理后第7天觀察煙草植株狀態,并收集新鮮葉片(5株煙草植株為1個樣品),液氮速凍后-80 ℃保存,用于抗性生理指標測定。

分別用南京建成生物科技有限公司的CAT Assay Kit(A007-1)、植物POD Assay Kit(A084-3)和SOD Assay Kit(S0102)檢測轉基因煙草中過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,檢測方法按照試劑盒說明書進行。轉基因煙草中MDA 含量用硫代巴比妥酸試劑提取,通過測定上清液在450 nm、532 nm 和600 nm處的吸光度進行定量[17]。

1.6 數據分析

所有數據用SPSS 19.0 中一維方差分析,用Turkey-Kramer test(P＜0.05)分析樣品間顯著性差異,顯著性結果分別用*(P＜0.05)、**(P＜0.01)和***(P＜0.001)表示。

2 結果與分析

2.1 轉化株系鑒定及形態觀察

將Gateway的方法構建的植物表達載體pOERF用農桿菌葉脈注射法轉入煙草后,以草胺磷為抗性篩選條件,篩選得到轉基因的煙草株系(T0代)。以過表達載體啟動子CaMV 35S序列為檢測片段,篩選鑒定得到陽性轉基因株系;陽性株系種子成熟后再次種植的T1代植株進行PCR 鑒定,共得到15個確切的陽性轉基因株系。經實時定量PCR檢測發現,在OE-3、OE-4、OE-7和OE-10 4個轉基因煙草株系中,SmERF1表達量比較高(圖1)。

圖1 轉基因煙草株系中SmERF1 表達量WT 為未轉基因煙草株系;OE-3,OE-4,OE-5,OE-6,OE-7,OE-10為過表達SmERF1 的煙草株系。Fig.1 The expression levels of SmERF1 in transgenict obacco plantsWTi ndicates wild type tobacco.OE-3,OE-4,OE-5,OE-6,OE-7,OE-10 indicate the overexpression lines of SmERF1.

在萌發階段,野生對照煙草種子在播種第7天開始露白,但轉基因煙草種子(T2代)在第9天才露白。在發芽后2周內,轉基因煙草幼苗的生長速度低于野生對照株系(圖2,A),幼苗的生物總量是對照株系的48%～53%(表2)。轉基因煙草的幼苗葉片偏黃(圖2,A),葉綠素含量是野生型對照的82%～84%,但正常情況下,轉基因煙草的種子萌發率與野生對照種子間沒有差異(表2)。在其他生長階段,轉基因煙草與對照植株間沒有明顯的差異。

圖2 轉基因煙草幼苗的形態(A)和種子大小(B)Fig.2 Growth morphology (A) and seed size (B)of transgenic tobacco

表2 轉基因煙草幼苗的形態指標分析Table 2 Analysis of morphological indicators of transgenic tobacco seedlings

2.2 表達SmERF1 影響煙草種子大小分析

在顯微鏡下可以明顯觀察到,轉基因煙草種子(T2代)比野生型種子小(圖2,B)。OE-3、OE-4、OE-7和OE-10 4個轉基因煙草株系的T2代種子的千粒重分別是對照的59%、63%、56%和58%(表2)。

2.3 轉基因株系耐鹽性增強

400 mmol/L NaCl溶液處理7 d后,野生型煙草對照株系的葉片卷曲、萎蔫,老葉變黃,而轉基因植株僅部分老葉變黃,表現出較好的抗鹽脅迫特性(圖3,A)。在正常和鹽脅迫處理情況下,對轉基因煙草植株中過氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、脯氨酸(Pro)含量和丙二醛(MDA)含量等抗性指標進行檢測(圖3,B)。發現,鹽脅迫下煙草轉基因株系中POD 活性顯著高于對照株系,非脅迫狀態轉基因株系中POD 活性高于對照株系,但不顯著。轉基因株系中SOD 活性在正常狀態下與對照沒有差異,但在鹽脅迫下顯著高于對照株系。轉基因株系中脯氨酸的含量在正常情況下與對照株系相比也沒有明顯差異,但在鹽脅迫下脯氨酸含量是對照的1.35～1.48倍。MDA 含量則在2種情況下都顯著低于對照株系。

圖3 鹽脅迫下煙草株系形態和抗性生理指標Fig.3 Morphology and physiological indicators of resistance of tobacco lines under salt stress

2.4 表達SmERF1 影響煙草激素含量

ABA 和GA 是一對相互拮抗的植物激素,參與到植物種子萌發、種子成熟、根的發育、開花時間控制等多個生理過程。在轉基因的煙草株系中ABA的濃度高于對照株系,為對照株系的1.53～2.51倍;而GA 濃度明顯下降,是對照的0.60～0.74倍(圖4)。

圖4 煙草株系中ABA 和GA 含量及相關基因表達檢測Fig.4 ABA and GA contents and related gene expressions in tobacco lines

進一步用實時熒光定量PCR 分析發現,在轉基因株系中ABA 合成途徑中的關鍵酶編碼基因NtSDR(short-chain dehydrogenase/reductase,Gen-Bank Accession No.AJ223177.1)的表達顯著高于對照株系,而煙草中GA 合成途徑的關鍵酶編碼基因NtGA20ox(GenBank Accession No.JQ413251)的表達量則明顯低于對照株系(圖4)。

以上結果表明,在煙草中表達SmERF1調節了植物激素ABA 和GA 表達;同時還發現,乙烯合成途徑的關鍵酶編碼基因NtACS(GenBank Accession No.NM_001326220.1)和NtACO(GenBank Accession No.NM_001325967)的表達量在轉基因株系中也明顯高于對照株系。

3 討論

隨著當今世界極端天氣頻發,藥用植物中抗性基因的研究越來越受重視。因其在植物抗性脅迫中的重要作用,ERF轉錄家族成員在抗性方面的研究逐漸成為研究的熱點[1]。如煙草中NtERF5、TaERF3[18]、GmERF3[19]和GmERF113[3]等在過表達后都能增強對多種病害的抵抗能力,提升轉基因植株抗旱、抗鹽或抗凍等方面的抗性。前期研究顯示,過表達SmERF1可以提高丹參的抗鹽性[12]。本研究中,鹽脅迫下表達SmERF1的煙草株系的長勢明顯好于野生型煙草,脯氨酸含量、SOD 活性和POD活性都高于野生型對照,MDA 含量低于對照株系,這些都顯示表達SmERF1增強了煙草的抗鹽性。

已有研究表明,ERF 蛋白能調節植物激素水平。如蘋果MdERF2通過抑制乙烯合成途徑關鍵酶編碼基因MdACS1的轉錄,抑制乙烯的合成[20]。水稻TSRF1激活ABA 合成途徑關鍵酶編碼基因SDR的表達,提高ABA 含量[21]。過表達AtERF11可通過激活GA3ox1和GA20ox的表達上調擬南芥中GA 合成[22]。植物激素ABA、GA 和乙烯都在介導植物生物或非生物脅迫的抗性反應中發揮著重要作用[23]。轉基因煙草中ABA 合成途徑的關鍵酶編碼基因NtSDR表達上調,GA 合成途徑關鍵酶編碼基因NtGA20ox的表達下調。進一步分析也顯示,轉基因煙草中ABA 含量上升而GA 含量下降。這與在丹參中表達SmERF1的結果一致,也與ABA和GA 兩者具有相互拮抗作用的結果[23]吻合。推測SmERF1可能通過上調ABA 含量增加植物抗鹽性。植物中ABA 含量上升還會刺激乙烯合成[24],在本研究中轉基因煙草中乙烯合成途徑的關鍵酶編碼基因表達也高于對照植株,預示轉基因株系中乙烯含量也呈上升趨勢。ABA 在植物幼苗發育期具有一定的抑制功能[25],這也可能是表達SmERF1的煙草幼苗生長緩慢、生物量低的原因。

種子大小是一項重要的農藝性狀,解析種子大小的調控機制對糧食生成具有重要意義。雖然研究表明,AP2超家族中的AfAP2-2和SMOS1等轉錄因子都可以調控種子大小[26-27],但AfAP2-2、SMOS含有2個AP2 結構域,SmERF1 僅含有1 個AP2結構域[12],屬于不同的亞家族成員。研究也表明,植物激素ABA[27]和GA[28]的含量變化也影響種子大小,所以SmERF1可能是通過影響上述激素水平而使種子變小、變輕。

綜上所述,在煙草中表達SmERF1調節了ABA 和GA 等植物激素合成途徑的關鍵酶基因表達,轉基因煙草中ABA 含量升高,而GA 含量降低。正是ABA 含量上升導致煙草幼苗發育緩慢,植株抗鹽性增強,而且植物激素含量變化進一步影響了煙草種子發育,導致種子變小、變輕。該研究進一步闡釋了SmERF1的功能,為藥用植物抗性研究及種子發育奠定了基礎。