人參發酵產物中總皂苷的純化研究

楊林錦,杜麗霞,宋國強,郭遠達,金宇昕,姜麗嬌,田 健

(1.長春中醫藥大學,吉林 長春 130117;2.吉林省一汽總醫院,吉林 長春 130013)

人參(PanaxginsengC.A.Mey.),是吉林省道地藥材,五加科人參的干燥根和根莖[1],可補元氣,安神,益脾,益肺,益智,生津[2]。人參發酵產物是采用人參根為君藥,經過發酵后而得到的一種藥物。經發酵,人參有效成分中的稀有皂苷含量大大增加[3-5]。稀有皂苷對腫瘤、不同種類的癌癥有明顯的治療和抑制作用[6-9],對腫瘤術后復發和轉移預防有借鑒作用,可用于輔助治療腫瘤。本實驗以人參發酵產物為研究對象研究人參總皂苷成分的提純過程。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

標準品(人參皂苷Re),中國藥品生物制品鑒定所;人參藥材購于長春市宏檢大藥房,經翁麗麗教授(長春中醫藥大學)鑒定;D101、AB-8、DM130、X-5、HPD100、HP20型大孔吸附樹脂(河北滄州寶恩化工有限公司);實驗所用液體試劑全部為分析純、固體試劑為化學純、水為純凈水。

萬分之一電子天平EL204,METTLER TOLEDO;十萬分之一電子天平AB135-S,METTLER TOLEDO;TU-1810系列紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;SORVALL Evolution離心機,Kendro Laboratory 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人參總皂苷的含量測定

1.2.1.1 對照品人參總皂苷Re溶液的制備

精密稱取人參皂苷Re 5 mg,置于25 mL容量瓶中,加入適量甲醇溶化后,稀釋定容至刻度線,搖勻即得0.200 4 mg/mL的Re溶液。

1.2.1.2 供試品溶液制備

精密稱取研細的人參發酵產物提取物1 g,置于25 mL容量瓶中,加入適量蒸餾水后,超聲后放置陰涼處冷卻,再加入蒸餾水,定容至刻度,搖勻,以等量水飽和正丁醇溶液,分4次萃取,干燥,即得。取干燥后的供試品置于50 mL的量瓶內,加入適量甲醇溶液至刻線,搖勻。再從中精密吸取1 mL的續濾液置于10 mL容量瓶中,用甲醇將濾液定容到刻線上,并搖勻。

1.2.1.3 最大吸收波長的選擇

分別精密地吸取1 mL對照物溶液和0.1 mL供試品溶液,置于具塞試管內,低溫揮發溶劑,加入5%香草醛高氯酸溶液0.5 mL,立即搖晃,即成。在60 ℃水浴中加熱15 min,然后放入冰水中立即冷卻,加入77%的5 mL硫酸溶液,搖晃均勻即可。使用相應試劑作為空白溶液。

波長300～700 nm范圍內光譜掃描。人參皂苷Re對照品和供試品在540 nm處吸收峰最大,因此選擇其作為測定波長。

1.2.2 大孔樹脂純化工藝優選

根據《中國藥典》人參總皂苷項下的提純方法及文獻報道,人參中的有效成分主要是人參皂苷類成分,而人參皂苷成分提純大多采用的是大孔樹脂吸附。大孔樹脂吸附性能各型號不同[10-15]。本文選取了D101、HP20、AB-8、X-5、DM130、HPD100的樹脂進行考察。

1.2.2.1 大孔樹脂預處理方法

在適量的95%乙醇中分別加入6種不同型號未經處理的大孔樹脂,浸泡24 h,使之充分溶脹。濕法裝柱,用95%乙醇沖洗。向蒸餾水中加入待流出的95%乙醇溶液,當蒸餾水中不再呈現白色混濁液后,用蒸餾水將其沖至沒有乙醇味的狀態。用5%的鹽酸溶液浸泡4 h,以5 BV/h的流速經大孔樹脂,用蒸餾水沖至中性;然后再用2%氫氧化鈉溶液浸泡4 h,以同樣的流速通過樹脂,用蒸餾水沖至中性后,在水中浸泡。最后將以上處理過的樹脂保存在95%的乙醇溶液中備后續使用。

1.2.2.2 最大吸附量和靜態解析率

用濾紙吸干其大孔樹脂表面的水分,分別稱取10.0 g預處理后不同型號的樹脂各兩份。其中一份放置有塞的錐形瓶中,精密地加入質量濃度為20.31 mg/mL的人參發酵產物提取液25 mL。浸泡6 h,每隔30 min左右振蕩一次,攪拌60 s,再靜置吸附24 h。過濾后,按總皂苷含量測定方法,測定其吸光度。另一份樹脂自然晾干后稱重,求濾液中皂苷的總含量及其飽和吸附量Qe。

Qe=(c0-c1)V/m,

其中,c0、c1為分析物的初始濃度和平衡濃度,V為吸附體積,m為樹脂質量。

將100 mL 70%乙醇,加入水洗后的飽和吸附樹脂中,在常溫條件下,浸泡2 h,每隔10 min搖動60 s,濾過。按總皂苷含量測定靜態解析率D。

D=(cdVd/Qe)×100%,

其中,cd為解析液濃度,Vd為解析液體積。

1.2.2.3 提取液上樣濃度選擇

取3份處理妥當的樹脂。另取3份不同濃度發酵產物提取液,分別上柱。先用上樣速度2 BV/h,吸附1 h。然后將雜質用蒸餾水洗去,再將有效成分用5 BV的70%乙醇溶液洗去,最后以4 BV/h的速度洗去。旋蒸回收后測定。

1.2.2.4 提取液上樣pH值(酸堿度)選擇

取D101型號25 g的大孔樹脂,采用濕法填充后,取4份相同濃度的人參發酵產物提取液,將其酸堿度分別調整為3.5(原液酸堿度)、5、7,9,先用2 BV/h的上樣速度吸附1 h。按前面方法洗去雜質,洗去有效成分。乙醇回收后測定。

1.2.2.5 上樣液上樣速度考察

取處理妥當的D101大孔樹脂25 g。濕法裝柱。取質量濃度0.8 g/mL的人參發酵產物提取液3份,采用不同速度上樣,吸附1 h。按前面方法洗去雜質,洗去有效成分。乙醇回收后測定。

1.2.2.6 樣液吸附時間考察

取處理妥當的D101大孔樹脂25 g,濕法填裝。取質量濃度0.8 g/mL的人參發酵產物提取液3份,上樣速度為2 BV/h。上樣后,分別靜置不同時間,再按前面方法洗去雜質,洗去有效成分。乙醇回收后測定。

1.2.2.7 洗脫劑種類考察

取處理妥當的D101大孔樹脂25 g,濕法填裝。取質量濃度0.8 g/mL的人參發酵產物提取液3份,上樣速度為2 BV/h上樣,靜置吸附1 h,按前面方法洗去雜質,再分別用不同濃度乙醇,洗去有效成分。再進行乙醇回收,然后進行測定。

1.3 工藝驗證

采用濕法裝柱的25 g D101大孔樹脂進行適當處理,取質量濃度0.8 g/mL的人參發酵產物提取液3份,上樣速度為2 BV/h,靜置吸附1 h,用蒸餾水洗去未吸附雜質,再用75%乙醇溶液洗去有效成分,將乙醇浸出液分別收集后測定。

2 結果分析

2.1 標準曲線繪制

精準量取人參皂苷Re對照品0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mL溶液,在540 nm處測定吸光度,同上法顯色。取對照品人參皂苷Re溶液的質量濃度為橫坐標,以其吸光度的值為縱坐標求得回歸方程:Y=0.011 32X-0.002 9,r=0.999 9。在7.287～80.160 μg/mL的范圍內,人參皂苷Re的線性關系較好。

2.2 最大吸附量和靜態解析率

6種不同型號的大孔樹脂的飽和吸附量和靜態解析率考察結果見表1。

表1 6種不同型號的大孔樹脂的飽和吸附量和靜態解析率結果

從表1可以看出,在解析率上,雖然DM130型和HPD100型樹脂比D101型稍大一些,但是三者之間并沒有太大的差別。但在靜態吸附量上,D101的大孔樹脂明顯高于其他型號,因此在人參總皂苷提取物的純化樹脂中選用了D101的大孔樹脂。

2.3 提取液上樣濃度選擇

選用不同濃度的人參發酵產物提取液上樣的結果見表2。

表2 提取液的上柱濃度考察結果表

根據表2,選擇上樣液質量濃度定為0.8 g/L時,測得洗脫液中總皂苷的含量最高。選擇0.8 g/mL為最優的上樣質量濃度。

2.4 提取液上樣pH值選擇

對人參發酵產物提取液的pH值進行調節后上樣,結果見表3。

表3 提取液上柱pH考察結果

根據表3,原液與pH呈中性時的提取液比較,兩者的總皂苷含量相似,而更適合大生產的是不用調節酸堿度的原液。

2.5 上樣液上樣速度考察

在人參發酵產物提取液上樣時采用不同的上樣速度,結果見表4。根據表4看出,上樣速度為2 BV/h,洗脫液中皂苷的含量最佳。

表4 提取液上樣速度考察結果表

2.6 上樣液吸附時間考察

人參發酵產物提取液上樣后,分別靜置不同時間進行吸附,結果見表5。根據表5,總皂苷在不同吸附時間內的吸附量相差不大,最好的條件是選短1 h的上樣吸附時間。

表5 提取液上樣液吸附時間的考察結果

2.7 洗脫劑種類考察

經前期實驗確定乙醇為最適洗脫溶劑,不同體積分數的乙醇溶液洗脫人參發酵產物提取物中總皂苷的結果見表6。根據表6,有效成分從75%的乙醇中洗脫得到的皂苷的量是最高的。

表6 洗脫劑的種類的考察結果

2.8 驗證實驗

在上述優選的工藝條件下,采用D101型大孔樹脂對人參發酵產物提取物,分別進行平行實驗3次,結果見表7。根據表7,人參發酵產物總皂苷經過D101型大孔樹脂純化,其工藝具有穩定性和可行性。

表7 大孔樹脂純化總皂苷驗證實驗結果

3 結論

本研究將6種大孔吸附樹脂對人參發酵產物總皂苷的吸附和解吸性能進行比較,考察上樣液質量濃度、上樣速度、吸附時間等因素對提純效果的影響。顯示D101樹脂分離純化效果最佳。取處理妥當的D101大孔樹脂,濕法填裝,0.8 g/mL的人參發酵產物提取原液上樣,上樣速度為2 BV/h,吸附1 h,水溶性雜質先用蒸餾水洗去,再用5BV的75%乙醇溶液洗去,收集洗脫液,回收乙醇,干燥并粉碎。純化工藝穩定可靠,為后續人參發酵產物不同劑型的制備工藝研究提供理論參考。