一株貓皰疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的分離鑒定及攻毒模型建立

王璐瑤,謝紅玲,閔娟娟,李晶梅,劉項(xiàng)羽,王明哲,王碧群,李婷婷,馮 釗,石寶蘭,漆世華,張棟梁

(國(guó)藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司,武漢 430075)

貓皰疹病毒1型(Feline herpesvirus typeⅠ, FHV-1)屬于皰疹病毒科的皰疹病毒亞科[1]。自1958年Crandell和Maurer從患有上呼吸道疾病的貓中首次分離出FHV-1以來(lái)[2],FHV-1分布于世界各地,在臨床上是最重要的貓呼吸道感染病原體[3]。由FHV-1引起的貓病毒性鼻氣管炎是一種典型的急性、發(fā)熱、傳染性疾病,其特征在于打噴嚏并伴有眼和鼻分泌物。通常的潛伏期為2～4 d,有時(shí)更長(zhǎng)。這種感染對(duì)于小貓或存在免疫系統(tǒng)疾病的貓死亡率較高,成年健康貓大多數(shù)在7～10 d內(nèi)恢復(fù),但會(huì)表現(xiàn)出終生潛伏期[4-5]。迄今為止開(kāi)發(fā)的疫苗都沒(méi)有能夠在防止再次感染時(shí)病毒復(fù)制方面提供完全保護(hù)[6-8]。本研究將患急性上呼吸道疾病的貓鼻分泌物接種貓腎細(xì)胞,并進(jìn)行連續(xù)傳代,將獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)分子生物學(xué)的方法、透射電鏡觀察和貓攻毒實(shí)驗(yàn)的鑒定,證實(shí)該分離株為FHV-1,為開(kāi)展貓病毒性鼻氣管炎的診斷及疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病料、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 眼、鼻拭子樣品取自武漢市某貓舍病貓,經(jīng)臨床診斷和RT-PCR檢測(cè)貓皰疹病毒陽(yáng)性。同時(shí)該病貓經(jīng)試紙條和RT-PCR檢測(cè)貓杯狀病毒(FCV)和貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(FPV)陰性。貓腎細(xì)胞系(F81)由國(guó)藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司保存。2～3月齡健康藍(lán)貓購(gòu)自北京偉特博瑞鼎生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、0.25%Trypsin-EDTA購(gòu)自Gibco公司、胎牛血清(FBS)購(gòu)自內(nèi)蒙古奧普賽公司;2×Taq Plus Master MixⅡ (Dye Plus)購(gòu)自Vazyme公司;FHV-1貓?jiān)搓?yáng)性樣品由國(guó)藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司保存;PCR儀購(gòu)自博日科技有限公司;DYY-7C 電泳儀電源購(gòu)自北京六一生物科技有限公司;倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)蔡司ZEISS公司。

1.3 病毒的分離純化與病變觀察 將患病貓的眼鼻分泌物病料浸泡在PBS溶液中并通過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后,按照5%體積比接種于F81細(xì)胞中,并使用2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3～6 d,逐日觀察有無(wú)細(xì)胞病變。培養(yǎng)物在細(xì)胞單層上連續(xù)盲傳3代,如不出現(xiàn)病變則棄去。若出現(xiàn)細(xì)胞病變則分離結(jié)果為陽(yáng)性,將有80% CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物按常規(guī)方法進(jìn)行空斑純化3次。收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物凍融2次,-70 ℃保存。

1.4 病毒的PCR鑒定 使用Multisource Genomic DNA/RNA Miniprep Kit (Axygen, Hangzhou, China)從1.3項(xiàng)獲得的純化后病毒液提取病毒基因組DNA,選擇FHV-1 gD基因的保守區(qū)域[9-10],利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)1對(duì)檢測(cè)FHV-1的特異性引物。上游引物: 5’- TCCGTCTAATGATGACACGTC-3’;下游引物: 5’-GAATGTGGACTTAAGGATG-3’。PCR反應(yīng)采用50 μL反應(yīng)體系,提取的DNA產(chǎn)物2 μL,10×Taq酶buffer(Mg2+plus)(20 mmol/L) 5 μL、引物F(10 μmol/L)1 μL、引物R(10 μmol/L)1 μL及dNTP Mix(2.5 mmol/L)4 μL,加無(wú)菌水36.75 μL,加TaKaRa Taq DNA聚合酶0.25 μL(5 U/μL)混勻,反應(yīng)條件為98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min,反應(yīng)結(jié)束。以1%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.5 PCR產(chǎn)物的克隆和序列測(cè)定 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,使用大連寶生物公司的膠回收試劑盒進(jìn)行回收,回收的片段在武漢擎科生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果提交GenBank進(jìn)行比對(duì)分析。使用MEGA-5軟件進(jìn)行同源性分析。

1.6 病毒的形態(tài)學(xué)觀察 將1.3項(xiàng)收獲的純化后病毒液上清30000 r/min在4 ℃條件下進(jìn)行超速離心5 h,離心后沉淀使用少量PBS進(jìn)行復(fù)溶,取25 μL復(fù)溶樣品與2.5%醋酸鈾染液滴于封口膜上,將有支持膜的銅網(wǎng)先置于樣品滴上,3～5 min后用鑷子夾起,用干凈三角形濾紙片從銅網(wǎng)邊緣輕輕吸去液體,將稍干的銅網(wǎng)置于染液上染色3 min,以同樣的方法使用濾紙吸去染液,將制備好的銅網(wǎng)在JM-100CX透射電鏡下觀察病毒形態(tài)并拍照。

1.7 攻毒實(shí)驗(yàn) 選擇6只健康藍(lán)貓,中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)無(wú)FHV-1/FCV/FPV抗體,2～3月齡,體重1.8～2.0 kg,隨機(jī)分為兩組,通過(guò)常規(guī)病毒含量檢測(cè)的方法[19]確定分離株F4代細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒含量,適當(dāng)稀釋后,實(shí)驗(yàn)組三只貓通過(guò)滴鼻點(diǎn)眼的途徑接種含有107.0TCID50/mL的分離株1 mL/貓,對(duì)照組三只貓相同的接種方式接種PBS。由于FHV-1的傳播主要是通過(guò)與感染動(dòng)物的直接接觸,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別飼養(yǎng)在不同地方,避免交叉。每天測(cè)量每只貓的體溫,并觀察臨床癥狀。接種后第3 d開(kāi)始收集鼻、眼、咽喉分泌物進(jìn)行PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的分離培養(yǎng) 在接種病料72 h后,F81細(xì)胞表現(xiàn)出明顯皰疹病毒感染后的細(xì)胞病變,其特征主要為細(xì)胞變圓、圓縮,部分細(xì)胞出現(xiàn)壞死脫落呈現(xiàn)空斑狀,96 h時(shí)貼壁細(xì)胞剩約10%。空斑純化3次后的病毒液以2%比例繼續(xù)在F81細(xì)胞上進(jìn)行傳代,通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)病毒在48 h～72 h出現(xiàn)皰疹病毒典型CPE,而對(duì)照的F81細(xì)胞未出現(xiàn)CPE(圖1)。

2.2 病毒的鑒定

2.2.1 病毒PCR檢測(cè)及同源性分析 使用FHV-1的特異性引物,對(duì)FHV-1每一輪空斑純化后克隆毒株進(jìn)行PCR鑒定,顯示均為 FHV-1 陽(yáng)性,擴(kuò)增片段約1125 bp,與預(yù)期gD基因大小相符合(圖2)。將成功分離的FHV-1命名為WHFHV05株。gD基因的測(cè)序結(jié)果通過(guò)MEGA-5軟件比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),與GenBank上美國(guó)典型毒株C27(FJ478159.2)、澳大利亞分離毒株(KR381802.1、KR381788.1)、中國(guó)黑龍江分離株(MH027311.1)、美國(guó)MILW_12、PHIL_01毒株(MH070338.1、MH070336.1)和英國(guó)CH-B毒株(MT813047.1)的同源性均為100%,說(shuō)明分離株WHFHV05的基因保守性良好(圖3)。

圖3 WHFHV05株gD基因同源性分析Fig 3 Homology analysis of gD gene of WHFHV05 strain

2.2.2 WHFHV05株病毒顆粒電鏡觀察 超速離心收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)病毒粒子為球形,外觀呈圓形,直徑在120 nm左右,特點(diǎn)是體積大,有囊膜,核心電子致密度高,有的在囊膜外可見(jiàn)纖突(圖4)。

圖4 分離株WHFHV05株電鏡觀察結(jié)果Fig 4 Electron microscope observation results of isolated strain WHFHV05

A:實(shí)驗(yàn)組貓;B:空白對(duì)照組;C:感染后鼻拭子PCR鑒定M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000);1: FHV-1陽(yáng)性對(duì)照組;2: 陰性對(duì)照組;3-5: 實(shí)驗(yàn)組貓(1#～3#)A:Experimental group;B:Blank control group;C:PCR identification of nasal swabs of cats after infectionM: DL2000 DNA Maker;1: FHV-1 positive control;2: Negative control; 3-5: Experimental group (1#～3#)圖5 感染分離株WHFHV05的貓臨床癥狀觀察Fig 5 Observation of clinical symptoms of cats infected with isolate WHFHV05

M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1: FHV-1陽(yáng)性對(duì)照;2-6: 實(shí)驗(yàn)組1#貓感染W(wǎng)HFHV05株后3～7 d眼拭子PCR鑒定;7: 陰性對(duì)照M: DL2000 DNA Marker; 1: FHV-1 positive control; 2-6: PCR identification of eye swabs 3～7 days after the cats in experimental group 1# were infected with WHFHV05 strain; 7: Negative control圖6 感染分離株后貓的臨床病料PCR鑒定Fig 6 PCR identification of clinical disease materials of cats infected with the isolates.

2.3 分離株的攻毒實(shí)驗(yàn) F4代細(xì)胞培養(yǎng)物病毒含量為108.0TCID50/mL,稀釋后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。圖5結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組3只貓感染W(wǎng)HFHV05株3 d后均出現(xiàn)眼分泌增加和流鼻涕,隨后出現(xiàn)流膿涕及黃色的炎性眼分泌物等臨床癥狀,鼻拭子樣品PCR鑒定均為FHV-1陽(yáng)性;對(duì)照組貓未出現(xiàn)明顯臨床癥狀。對(duì)實(shí)驗(yàn)組1#貓感染病毒后3～7 d的眼分泌物進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FHV-1 gD基因陽(yáng)性(圖6)。同時(shí)通過(guò)采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組貓血清進(jìn)行中和試驗(yàn)排除FCV的感染。因此,分離株WHFHV05感染2～3月齡貓臨床癥狀明顯,且存在持續(xù)排毒的情況。

3 討論與結(jié)論

貓皰疹病毒引起的貓傳染性鼻氣管炎,對(duì)于新生的幼貓或者免疫力低下的貓危害嚴(yán)重,結(jié)膜和口鼻黏膜暴露病毒后,FHV-1在這些部位大量的復(fù)制,導(dǎo)致發(fā)熱、打噴嚏、結(jié)膜炎、角膜炎和眼鼻分泌物[11-12]。因此,FHV-1的分離和鑒定對(duì)于了解貓呼吸道疾病的流行病學(xué)和發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。本研究使用F81細(xì)胞從臨床樣本中成功分離FHV-1。在受感染細(xì)胞中觀察到的細(xì)胞病變與之前FHV-1感染的報(bào)道一致。受感染的細(xì)胞融合聚集,形成大的多核巨細(xì)胞,進(jìn)而形成合胞體是 FHV-1感染的標(biāo)志[13]。此外,受感染細(xì)胞變圓和脫離也是FHV-1感染的典型特征。這些變化表明FHV-1對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞造成了損害,這可能導(dǎo)致受感染的貓出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道癥狀。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物富集后電鏡觀察可見(jiàn)明顯的外觀呈圓形,直徑在120 nm左右,有囊膜的病毒顆粒,形狀和大小與所報(bào)道的貓皰疹病毒顆粒一致[14]。對(duì)分離株的糖蛋白gD基因測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),與GenBank上已報(bào)道的貓皰疹病毒Ⅰ型gD基因序列具有100%的同源性,進(jìn)一步表明分離的毒株為FHV-1。

FHV-1是一種DNA病毒,屬于α-皰疹病毒亞科水痘病毒屬。該病毒僅存在一種血清型,并且與其他α-皰疹病毒一樣,會(huì)在三叉神經(jīng)節(jié)中誘導(dǎo)潛伏期。因此,臨床上治療后的貓仍會(huì)終生攜帶病毒,特別是當(dāng)自身受到應(yīng)激時(shí),會(huì)經(jīng)歷周期性的病毒重新激活,引起二次感染[13]。臨床上常見(jiàn)的治療貓感染FHV-1的藥物有泛昔洛韋或阿昔洛韋,這些藥物在一定程度上可以改善臨床癥狀,但常存在嚴(yán)重的副作用及治療后復(fù)發(fā)的情況[15-17]。目前針對(duì)該病的預(yù)防主要依賴進(jìn)口的貓三聯(lián)疫苗,國(guó)內(nèi)的疫苗產(chǎn)品還處在研發(fā)階段。本研究獲得FHV-1分離株WHFHV05以107.0TCID50/mL劑量感染2～3月齡健康貓后,出現(xiàn)膿性的眼鼻分泌物和打噴嚏等臨床癥狀,使用PCR方法對(duì)感染貓的眼分泌物進(jìn)行病原監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn),病貓?jiān)?～7 d內(nèi)會(huì)持續(xù)排毒。與報(bào)道的FHV-1引起的貓呼吸道感染癥狀一致[18],說(shuō)明該分離毒株可用于疫苗研發(fā)過(guò)程中的檢驗(yàn)用毒。

本研究使用細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù)從臨床樣本中成功分離和鑒定了FHV-1,提供了有關(guān)FHV-1流行病學(xué)和病原學(xué)信息。與此同時(shí),臨床感染模型的成功建立為貓皰疹病毒發(fā)病機(jī)制的研究和疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。