測定地克珠利混懸液中的聚山梨酯20含量和枸櫞酸含量的方法

李 芳,孫立亞,楊麗英

(百美達醫藥科技(北京)有限公司,石家莊 050000)

1 材料和方法

1.1 材料 Thermo U3000高效液相色譜儀;Allchrom ELSD6000蒸發光檢測器;METTLER TOLEDO XSE205分析天平;METTLER TOLEDO SE400-K pH計。

乙腈(色譜純,Merck);甲醇(色譜純,Merck)Polysorbate 20 (分析純CRODA);枸櫞酸(中國食品藥品檢定研究院,100396-202104);磷酸氫二鈉(科密歐,20190801);磷酸:(科密歐,20170510);方法開發和驗證所用的地克珠利混懸液有百美達醫藥科技(北京)有限公司研發提供(批號為RDSB2009-07、RDSB2009-08、RDSB2010-01)

1.2 方法

1.2.1 色譜條件: 試驗選取了Thermo Acclaim surfactant plus 4.6 mm×250 mm,5 μm和 Thermo Accucore C18 4.6 mm×100 mm, 2.6 μm兩根色譜柱進行試驗,兩者對吐溫20 均有較好的保留,且理論塔板數均良好,通過重復性進行,后者的重復性明顯優于前者,故選定Thermo Accucore C18 4.6 mm×100 mm, 2.6 μm 為本方法使用的色譜柱(圖1)。

圖1 HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC Chromatogram

優化后的聚山梨酯20的色譜條件:色譜柱:Thermo Accucore C18 4.6 mm×100 mm, 2.6 μm。HPLC: Thermo U3000。流速:0.5 mL/min。流動相A:水,流動相B:乙腈

梯度程序如下:

時間/minA/%B/%0-39554-840608-20208020.1-30955

檢測器:ELSD6000(Allchrom),漂移管溫度:115 ℃。氣體流速:2L/min,稀釋劑:乙腈。

枸櫞酸的色譜條件:色譜柱:Tech Mate ST C18 250 mm×4.6 mm, 5 μm,流動相:A;20 mmol 磷酸氫二鈉 (用磷酸調節pH至3.0)B:色譜甲醇。流動相A∶B=95∶5。流速:1.0 mL/min,柱溫:30 ℃ 紫外檢測波長:UV 210 nm。

觀察組患者的腦出血治療效果明顯優于對照組,差異顯著(P<0.05),詳細數據見表1;同時觀察組患者的血腫擴大率5.3%明顯低于對照組19.3%,差異顯著(P<0.05)。

1.2.2 溶液配制 吐溫20的溶液配制:

對照品的制備:取吐溫20對照品約0.33 g,精密稱定,置于200 mL量瓶中,加乙腈稀釋至刻度,搖勻。精密量取1 mL,置于10 mL量瓶中,加乙腈稀釋至刻度,搖勻。

供試品的制備:精密量取2.5 mL樣品,置于10 mL量瓶中,加乙腈溶解并稀釋至刻度。

陰性樣品的制備:按樣品的配方比例取不含吐溫20的空白制劑(含處方中主成分及其他所有輔料)約2.5 mL,置于10 mL量瓶中,加乙腈稀釋至刻度,搖勻。

枸櫞酸的溶液配制:

對照品的制備:取枸櫞酸對照品約50 mg,精密稱定,置于25 mL量瓶中,加枸櫞酸色譜條件下流動相稀釋至刻度,搖勻。精密量取1 mL,置于10 mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻。

供試品的制備:精密量取2 mL樣品,精密稱定,置于10 mL量瓶中,加枸櫞酸色譜條件下流動相溶解并稀釋至刻度。轉移適當體積到離心管,離心機速度13000 rpm,離心10 min。用0.45 μm濾膜過濾既得。

陰性樣品的制備:按樣品的配方比例取不含枸櫞酸的空白制劑(含處方中主成分及其他所有輔料)精密量取2 mL樣品,精密稱定,置于10 mL量瓶中,加枸櫞酸色譜條件下流動相溶解并稀釋至刻度。轉移適當體積到離心管,離心機速度13000 rpm,離心10 min。用0.45 μm濾膜過濾既得。

2 結果與分析

2.1 系統適用性試驗 精密移取聚山梨酯20對照品溶液,相當于聚山梨酯20濃度為0.165 mg/mL的溶液。連續進樣5針,記錄色譜峰保留時間,理論塔板數、吐溫20及其相鄰峰的分離度和吐溫20的峰面積,并計算其RSD。實驗結果顯示,吐溫20色譜峰的保留時間及峰面積的RSD<2.0%,理論塔板數>2000,聚山梨酯20和其相鄰峰的分離度>1.5,滿足HPLC和ELSD方法要求。

精密移取枸櫞酸對照品溶液,相當于枸櫞酸濃度為0.2 mg/mL的溶液。連續進樣5針,記錄色譜峰保留時間,理論塔板數、枸櫞酸及其相鄰峰的分離度,和枸櫞酸的峰面積,并計算其RSD。實驗結果顯示,枸櫞酸色譜峰的保留時間及峰面積的RSD<2.0%,理論塔板數>2000,枸櫞酸和其相鄰峰的分離度>1.5,滿足HPLC方法要求。

2.2 專屬性試驗 對聚山梨酯對照品、陰性樣品及樣品進行檢測(圖2),可以清楚的看到,此條件下樣品中的聚山梨酯20與其他組分能達到很好的分離,而且沒有干擾,專屬性符合要求。對枸櫞酸對照品、陰性樣品及樣品進行檢測(圖2),可以清楚的看到,此條件下樣品中的枸櫞酸與其他組分能達到很好的分離,而且沒有干擾,專屬性符合要求。

圖2 液相色譜圖Fig 2 HPLC Chromatogram

2.3 線性試驗 精密移取聚山梨酯20對照品溶液適量,相當于聚山梨酯20濃度為0.165 mg/mL的溶液。分別進樣5、10、15、20、30 μL,得到lg(聚山梨酯20的量)與lg(聚山梨酯峰面積)的線性方程為:y=1.67x+0.3212,R2=0.9984。標準曲線的R2>0.99,符合HPLC和ELSD方法要求。

表1 線性結果Tab 1 Linear results

精密移取枸櫞酸對照品溶液適量,儲備液濃度相當于枸櫞酸濃度為2 mg/mL的溶液。分別制備相當于標準對照品溶液50%,70%,80%,100%,120%,150%的線性溶液,得到枸櫞酸的線性方程為:y=0.0796x-0.0015,R2=1。標準曲線的R2>0.999,符合HPLC方法要求。

2.4 精密度試驗 按照“1.1.2.2”項下溶液配制方法,同時配制6份聚山梨酯20供試品溶液,計算RSD。實驗結果顯示,重復性試驗中,RSD為1.9%,小于3.0%,符合規定。

按照“1.1.2.2”項下溶液配制方法,同時配制6份枸櫞酸供試品溶液,計算RSD。實驗結果顯示,重復性試驗中,RSD為0.51%,小于2.0%,符合規定。

表2 精密度結果Tab 2 Precision results

2.5 回收率試驗 按照“1.1.2.2”項下供試品溶液配制方法,分別配制聚山梨酯20濃度為0.132,0.165,0.198 mg/mL的溶液各三份。相當于80%,100%,120%三個濃度水平的樣品溶液,計算每個樣品中聚山梨酯20的含量,計算回收率。結果分別為101.2%,99.4%,99.8%?；厥章柿己?符合規定。

按照“1.1.2.2”項下供試品溶液配制方法,分別配制枸櫞酸濃度為0.16,0.20,0.24 mg/mL的溶液各三份。相當于80%,100%,120%三個濃度水平的樣品溶液,計算每個樣品中枸櫞酸的含量,計算回收率。結果分別為100.31%,99.94%,98.56%。回收率良好,符合規定。

表3 回收率結果Tab 3 Recovery result

3 結 論

本文介紹了測定地克珠利混懸液中的聚山梨酯20和枸櫞酸的含量的檢測方法,能夠使用此方法測定混懸液中重要成分,在控制主要原料成分含量的條件下,準確控制表面活性劑聚山梨酯20及絮凝劑反絮凝劑枸櫞酸的含量,保證制劑的穩定性,同時保障動物用藥的安全性。所有方法經過驗證,有較好的精密度,線性及回收率等驗證結果,該方法可以實現準確的定量分析,操作簡單,使用方便,節約檢測時間,本文所述的方法可作為一個可靠的檢測方法。