大腸桿菌快速檢測系統設計與實現

吳學斌，龐春穎，魏佳淇，郭云軒，顧峰

（1.長春理工大學 生命科學技術學院，長春 130022；2.中國農業科學院長春獸醫研究所，長春 130122；3.陜西省人民醫院，西安 710003）

近年來，由食源性病原體引起的疾病已成為主要公共衛生問題之一。食源性病原體種類繁多，其中大腸桿菌O157：H7 是最為常見、嚴重的一種［1］。大腸桿菌O157：H7 是條件性致病菌，在一定條件下會導致腹瀉、出血性結腸炎和溶血尿毒癥綜合征等疾病，甚至會危及幼兒和體弱者生命，因此對食品和水源中的大腸桿菌O157：H7進行快速、廣泛的檢測具有重要的現實意義。

目前，對于大腸桿菌的檢測主要采用培養基培養、酶聯免疫吸附實驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）和聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）等。培養基培養的方法具有較好的特異性，但是整個過程復雜耗時，需持續約4 天，操作費時費力；PCR 作為擴增核酸的常用技術，具有較高的準確性，但是由于DNA 提取、擴增等樣品制備步驟復雜，操作過程易形成氣溶膠污染，成本較高，需要昂貴的熱循環儀和訓練有素的專業人員，不適合現場及戶外檢測；ELISA 法大多用來進行血清學診斷檢測生物樣品中是否存在抗原或抗體，盡管ELISA 測試靈敏度較高，但仍不適合現場檢測，因為ELISA 需要大型精密儀器進行光學檢測和一定的孵育時間［2-5］。以上方法均在實際樣品應用檢測時缺乏即時診斷所需的重要特征，即反應快速和操作簡便。近年來隨著技術的不斷發展，建立了多種基于新型生物傳感器系統的檢測方法。其中，電化學生物傳感器由于其具備反應迅速、檢測限低、信號讀取方便等優勢，在臨床診斷及食品安全領域受到了研究人員的青睞，具有廣闊的應用前景［6］。橫向流動免疫分析法（Lateral Flow Immunochromatographic Assay，LFIA）是一種在20 世紀發展起來的體外檢測工具診斷技術，是即時檢測（Point of Care Testing，POCT）的主要技術之一［7］，它具有操作時間短、操作簡單、經濟效益大、適用于現場檢測的特點。例如核酸測試被認為是診斷冠狀病毒引起的肺炎（COVID-19）的“黃金標準”。

針對以上分析，本系統基于電化學橫向流動免疫分析技術配合STM32 單片機設計了一種便攜式大腸桿菌快速檢測系統，完成了電化學橫向流動免疫分析平臺的設計，改善了試紙條只能定性檢測的問題，建立了大腸桿菌濃度O157：H7 與電流強度的線性關系，實現了大腸桿菌O157：H7 的快速定量檢測［8-10］。

1 檢測原理

本設計利用電化學橫向流動免疫分析技術和嵌入式技術設計一款大腸桿菌快速檢測系統。電化學免疫分析平臺可將滴加的大腸桿菌O157：H7 溶液濃度信息轉化為電流信號，該信號由絲網印刷電極傳輸到嵌入式系統，嵌入式系統再對電流信號進行檢測、放大、處理和分析，最終計算出大腸桿菌O157：H7 溶液的濃度。

系統檢測原理框圖如圖1 所示。檢測時將待檢測液體滴加至電化學橫向流動免疫分析平臺的樣品墊上，檢測液中的大腸桿菌O157：H7可與結合墊上的Fc-MI 偶聯物結合（如步驟①），隨后與Fc-MI 偶聯物結合的大腸桿菌O157：H7在測試墊與其特異性抗體結合（如步驟②），最后Fc-MI 偶聯物中含有的二茂鐵表現出電特性，產生的電流經絲網印刷電極輸出到嵌入式檢測系統（如步驟③）。

圖1 系統檢測原理框圖

2 系統總體設計

系統的設計基于電化學橫向流動免疫分析技術。系統總體設計框圖如圖2 所示，分為電化學橫向流動免疫分析平臺和嵌入式檢測系統兩部分。電化學橫向流動免疫分析平臺負責接收滴加的大腸桿菌O157：H7 溶液，并將大腸桿菌溶液濃度信息轉化為電流信號。嵌入式檢測系統包括STM32 主控芯片及其外圍的各個電路，負責采集、放大、處理絲網印刷電極傳入的電流信號，并根據擬合函數計算大腸桿菌O157：H7 濃度，從而實現對大腸桿菌O157：H7 的檢測。

圖2 系統總體設計框圖

3 橫向流動免疫分析平臺

3.1 橫向流動免疫分析平臺結構組成

電化學橫向流動免疫分析平臺負責將大腸桿菌O157：H7 溶液的濃度信息轉化為電信號。

平臺結構如圖3 所示。平臺由五部分組成，包括樣品墊、結合墊、測試條、吸收墊和絲網印刷電極。樣品墊接收含有大腸桿菌O157：H7 的溶液，并作為過濾器幫助液體流動。結合墊上的Fc-MI 偶聯物可與大腸桿菌O157：H7 結合形成靶標Fc-MI 復合物。測試條上的特異性抗體可識別并捕獲與Fc-MI 結合的大腸桿菌O157：H7。絲網印刷電極提供電流回路，為平臺提供電壓的同時輸出電化學反應產生的電流。

圖3 電化學橫向流動免疫分析平臺結構圖

3.2 橫向流動免疫分析平臺制備

電化學橫向流動免疫分析平臺的制備包括絲網印刷電極的設計、橫向流動裝置的制作以及ELFIA 測試條的功能化三步。

本研究采用三電極系統，包括工作電極（WE）、對電極（CE）和參比電極（RE）［11-12］。工作電極和對電極由石墨烯糊制成，參比電極由Ag/AgCl 油墨制成。

橫向流動測試條由五個部分組成，包括樣品墊、結合墊、硝化纖維素膜、吸收墊和絲網印刷電極。每個組件都安裝在背板上，組件之間有2 mm的重疊，而絲網印刷電極連接在背板和硝化纖維素膜之間。另外，還需制備結合墊所需的二茂鐵抗菌肽偶聯物（Fc-MI）。首先，將二茂鐵羧酸（10 mg）完全溶解在1 mL 的HEPES 緩沖液（50 mM，pH 7.4）中。然后在溶液中分別加入了10 mg NHS 和15 mg EDC。然后，通過在室溫下連續攪拌2 h，激活該混合物中二茂鐵羧酸上的羧基。然后，將200 μL 濃度為1 mg/mL 的抗菌肽MI（使用超純水溶解干粉）滴加入混合物中，在室溫下連續攪拌12 h。孵育后，將偶聯物在3 000 rpm 下離心10 min，以去除任何沉淀。然后，將上清液以11 000 rpm 離心30 min。將以這種方法制備的Fc-MI 偶聯物顆粒用超純水稀釋至1 mL，并在4 ℃下保存。

首先將1 μL 大腸桿菌O157：H7 抗體（1 mg/ml）應用于硝化纖維素膜檢測區，在37 ℃下烘烤30 min。然后將制備的5 mL 的Fc-MI 放在結合墊上，最后在37 ℃下烘烤30 min。

完成上述三個步驟后，電化學橫向集成免疫分析平臺即可連接嵌入式檢測系統進行實驗，實物圖如圖4 所示。

圖4 電化學橫向流動免疫分析平臺實物

4 嵌入式檢測系統

4.1 硬件設計

硬件電路主要由I/V 轉換電路、放大電路、濾波電路、A/D 轉換電路和電源模塊等構成。I/V轉換電路負責將電化學集成免疫分析平臺輸出的電流信號轉化為電壓信號。放大電路將信號進一步放大，以便信號檢測。濾波電路濾除噪聲，保證結果穩定性。A/D 轉換電路則是將處理好的模擬信號轉換為單片機可識別的數字信號［13］。

主控單元采用ST 公司的STM32F407ZGT6 作為主控芯片，通過控制單片機的SPI 接口、ADC接口、IIC 接口與相應的參數采集模塊進行數據傳輸，并且該單片機具有浮點運算器并支持DSP功能，能夠實現對數字信號的處理與分析。主控單元資源分配如下：采用GPIOA9、GPIOA10 引腳的USART1 功能，通過CH340G 芯片構成USB轉串口一鍵下載電路，實現程序的調試與下載；觸摸屏通信采用跳線帽轉換，實現與USB 轉換電路共用USART1，進行指令發送與接收；采用GPIOF7 引腳的ADC3 功能，對輸入的模擬信號進行12 位模數轉換。

I/V 轉換電路采用AD825 運算放大器，該芯片具有噪聲低、穩定性高、抑制電源高頻噪聲、不易受溫度影響等優點，其電路設計如圖5 所示。

圖5 I/V 轉換電路原理圖

I/V 轉換電路采用負反饋放大設計，電流信號由反相輸入端輸入，輸出端經電阻與反向輸入端相連，放大倍數由輸出端與輸入端之間的等效電阻決定。同時，電路中采用T 型反饋網絡結構，可實現信號的大倍數放大，同時可避免大阻值電阻引入的噪聲干擾。Uout1的計算公式如下：

計算結果如下：

放大電路采用LF353 運算放大器，采用二級放大設計，將信號放大相應倍數，同時避免電路陷入自激狀態。LF353 芯片采用場效應管作為差分輸入級，具有很高的輸入阻抗及較低的輸入噪聲電壓，輸出級為NPN 和PNP 構成的互補射極跟隨器，具有較強的帶負載能力。放大電路原理如圖6 所示。

圖6 放大電路原理圖

圖中一級放大電路采用反向比例放大電路，Uin作為信號輸入，U1為一級放大后的信號，反饋電阻采用滑動變阻器，可根據放大倍數的需要對反饋阻值進行調整，U1的計算公式如下：

二級放大電路采用差動放大設計，R6=R9，R7=R10，Uout2的計算公式如下：

信號濾波電路的設計主要針對可充電鋰電池的干擾，可充電鋰電池產生的干擾信號頻率在100 MHz 左右。為降低噪聲對系統信號的干擾，本系統采用OP27 運放芯片，設計低通濾波電路，針對干擾信號的頻率范圍，設置帶通截止頻率為2 Hz，濾波電路原理如圖7 所示。

圖7 濾波電路原理圖

濾波電路截止頻率計算公式如下：

濾波電路輸出電壓計算公式如下：

完成各個模塊電路的設計即可進行系統PCB 板的焊接，其實物圖如圖8 所示。

圖8 系統PCB 實物

4.2 軟件設計

嵌入式系統程序設計主要包括系統各項功能初始化、指令的發送和信號的接收，解析接收的指令，并執行對應的功能，保證整個系統的有序運行。系統運行后，主程序調用初始化函數，對單片機I/O 口、復用映射、定時器、串口、中斷及中斷優先級等參數進行初始化設置。系統初始化完成后，等待指令的傳入，并對接收到的指令進行判斷，然后解析指令完成相應的操作。系統主程序的功能主要包括觸摸屏顯示、信號檢測、數據的處理和存儲等。系統主程序流程如圖9 所示。

圖9 系統主程序流程圖

5 實驗結果及分析

5.1 橫向流動免疫分析平臺可行性測試

為測試電化學集成檢測平臺的可行性，選用大腸桿菌O157：H7 溶液和純凈水作對照組，利用電化學工作站進行電化學檢測，測試結果如圖10 所示。

圖10 可行性測試結果

由圖10 可知，在滴加陰性溶液時，電化學集成橫向免疫分析平臺幾乎不產生電流響應。滴加含有大腸桿菌O157：H7 的溶液時，平臺在0.1～0.4 V 范圍內有較明顯的電流響應，并且在0.2～0.3 V 之間取最大值。綜上所述，電化學集成橫向免疫分析平臺能明顯區分陰性、陽性，有較好的可行性。

5.2 橫向流動免疫分析平臺靈敏性測試

實驗配置10 組濃度分別為0、101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL 的大腸桿菌O157：H7 溶液，滴入電化學集成免疫分析平臺樣品墊檢測，檢測結果如圖11 所示。

圖11 靈敏性測試結果

從圖中可以看出，電流響應強度隨大腸桿菌O157：H7 溶液濃度的增加而增強，并且不同濃度之間表現出明顯的差異，說明電化學集成免疫分析平臺具有較好的靈敏性。

5.3 橫向流動免疫分析平臺特異性測試

實驗準備4 組濃度為106CFU/mL 的大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌、金黃葡萄球菌、李斯特菌溶液，在相同條件下進行電化學檢測，結果如圖12 所示。

圖12 特異性測試結果

從圖中可以看出，大腸桿菌O157：H7 電流響應非常明顯，沙門氏菌有輕微的電流響應，其他菌種幾乎無電流響應，說明電化學集成免疫分析平臺具有較好的特異性。

5.4 濃度表達式擬合

為得到檢測電信號大小與物質濃度之間的關系，配制9 組濃度為101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL 的標準液樣品，滴入測試條進行電化學檢測。根據電流信號與待測樣品濃度關系，用最小二乘法做線性回歸，擬合曲線如圖13 所示。

圖13 大腸桿菌濃度檢測擬合結果

由圖可知，電流強度的大小與待測物濃度有明顯線性關系，線性擬合后，檢測公式如下：

在檢測范圍102～109CFU/mL 濃度內，線性擬合度R2=0.985 2，電流強度與大腸桿菌O157：H7溶液濃度有良好的線性擬合度。

5.5 系統誤差測試

在進行誤差測試時，使用上海辰華儀器有限公司生產的電化學工作站分別對濃度為102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL 的標準液樣品進行電化學檢測，測試過程重復5 次，取平均值記錄，測試數據如表1 所示。

表1 系統誤差測試數據

根據表1可知，本系統檢測相對誤差小于4.5%，準確性較好。

5.6 系統重復性測試

系統的重復性測試是衡量檢測儀器穩定性的重要指標，是對檢測結果離散程度的反應。重復性常采用變異系數CV值表示，其計算公式如下：

式中，σ表示樣本標準差；表示樣本均值。計算得到的CV值越小，則表示系統檢測重復性檢測越穩定。

進行系統重復性檢測時，實驗室配置標準液濃度103CFU/mL、106CFU/mL、109CFU/mL 三種濃度指標進行測試，每組測試重復10 次，并計算檢測樣本濃度均值以及標準差，進行系統重復性測試。通過計算，CV值分別為3.7%、2.1%、0.3%，結果表明隨著檢測濃度的升高，變異系數越小，系統檢測結果越穩定。實驗結果的測試曲線如圖14 所示。

圖14 系統重復性測試結果

6 結論

本系統采用電化學免疫分析技術，設計電化學集成橫向流動免疫分析平臺，選用STM32F407微處理器作為系統控制核心，實現對食品溶液中大腸桿菌O157：H7 的快速定量檢測。該系統體積小，操作簡單，只需“一鍵式”操作，即可在10 min 內得到檢測結果，適合家用普及。實驗結果表明，該系統的檢測誤差小于4.5%，系統重復誤差小于3.7%，檢測限達到102CFU/mL，可有效用于大腸桿菌O157：H7 的檢測。