血管性認知功能障礙病人血清微RNA-335-5p、血清應答因子水平及其臨床意義

姚潔，王尚臣，褚麗芳，朱倩

作者單位：石家莊市人民醫院神經內一科，河北 石家莊 050000

腦卒中是一種具有高復發率、高致殘率的急性腦血管疾病，包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，我國每年約200 萬新發病例［1］。血管性認知功能障礙（vascular cognitive impair-ment，VCI）是由于腦血管損傷導致的認知能力降低和生活能力減退的綜合征，是老年人常見的認知障礙，其包括從輕度認知障礙到血管性癡呆（vascular dementia，VD）［2］。據報道，30%的腦卒中病人將出現不同程度的VCI，影響腦卒中后病人康復，并給家庭、社會造成負擔［3］。VCI 具有可防治性，發病早期有效診療能夠在一定程度上逆轉病情，減少癡呆發生。因此，需要更好地了解VCI 疾病進展的病理生理學，以制定新的干預措施。

微RNA（microRNA，miR）屬于小型無編碼能力的RNA，以往研究證實miRNA 在VCI 病人血清、腦脊液等體液循環中差異表達，容易檢測，是一種新型VCI診斷指標［4］。miR-335-5p是miRNA 家族成員之一，有研究指出，miR-335-5p 在VD 中具有重要作用，可以作為VD 診斷、治療標志物［5］。亦有研究指出，50%肌萎縮側索硬化癥病人表現出行為和認知功能障礙，且血清中檢測到miR-335-5p水平降低［6］。血清應答因子（vascular cognitive impair-ment，SRF）位于染色體6p21.1 上，是一種普遍表達的MADSbox轉錄因子，參與氧化應激。SRF在阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）中的高表達能夠推動疾病進展［7］。本研究通過檢測腦卒中后VCI 病人血清miR-335-5p、SRF 水平，并進一步明確miR-335-5p、SRF 異常表達與認知功能的相關性，以期為VCI 的早期診斷與治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料以石家莊市人民醫院2019 年1 月至2020 年12 月因腦卒中治療后6 個月合并VCI 病人110 例為研究對象（VCI 組），且蒙特利爾認知評估量表（Montreal cognitive assessment，MoCA）評分＜26 分，其中男67 例、女43 例，年齡（61.46±8.15）歲。納入標準：①腦卒中診斷符合《中國急性腦卒中臨床研究規范共識2018》［8］診斷標準，并結合臨床檢查確診；②VCI符合《2016中國血管性認知障礙診療指導規范》診斷標準，且治療后6 個月的腦卒中病人MoCA 評分＜26 分［9］。③年齡≥18 歲，首次確診為腦卒中；④簽署知情同意書。排除標準：①發病前存在認知障礙、繼發性腦卒中病人；②合并肢體功能障礙、合并心肺肝腎疾病；③合并失語、構音障礙、視覺障礙或聽覺障礙，無法完成檢查；④凝血功能障礙；⑤腦腫瘤或其他顱腦疾病；⑥早期出現進行性惡化的記憶缺陷。本研究經石家莊市人民醫院倫理委員會批準同意（批號2018-11-0178）。將110例病人進一步根據《美國精神障礙診斷與統計手冊》第5 版［10］分為非癡呆型血管性認知功能障礙（vascular cognitive impairment with no dementia，VCIND）組，血管性癡呆（VD）組。同時間段該院110例腦卒中無VCI 的病人作為對照組，男69 例，女41例，年齡（59.08±8.36）歲。腦卒中病人發病后6個月時采用MoCA 評估受試者認知功能，并將MoCA 評分＜26 分的病人作為VCI 組。同時對腦卒中病人于發病時（入院次日）、發病后1 年分別采用MoCA 評估受試者認知功能，比較VCIND 組、VD 組以及對照組病人MoCA評分差異。

1.2 方法

1.2.1 資料收集入院時統計病人以下資料：（1）一般資料：年齡、性別、基礎疾病史、飲酒史（乙醇量≥36 g/d，持續半年）、腦卒中類型（出血性/缺血性）、腦卒中部位（皮層/基底核/丘腦/小腦/腦干/其他）、吸煙史（≥1 支/天，持續半年）、美國國立衛生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評分等；（2）入院時生化指標檢查結果：三酰甘油、C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、空腹血糖、總膽固醇、血同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。

1.2.2 實時熒光定量PCR 檢測血清miR-335-5p、SRF 水平所有研究對象分別于發病時（入院次日）、發病后6 個月、發病后1 年時清晨抽取空腹肘靜脈血，離心半徑8 cm，3 000 r/min 離心10 min，取上層血清，并置于-80 ℃超低溫冰箱中貯存，備用。采用miRNA 抽提試劑盒（貨號DP503）得到miRNA，按照miRcute 增強型miRNA 互補DNA（cDNA）第一鏈合成試劑盒（貨號KR211-01）說明書將RNA 反轉錄為cDNA 后稀釋至等量濃度，使用熒光定量檢測試劑盒（貨號FP411）中反應混合液配制反應體系，并在Mx3005P QPCR（Aglient，美國）擴增儀上采集信號。

取血清樣品，采用Trizol試劑（貨號DP424）得到總RNA，然后利用反轉錄試劑盒（貨號KR106）得到cDNA，利用FastFire qPCR PreMix 試劑盒（貨號FP207）配制混合體系，同樣在Mx3005P QPCR 儀器上進行PCR 反應。miR-335-5p以U6為內參，SRF 以β 肌動蛋白（β-actin）為內參，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。試劑盒均由天根生化科技有限公司提供。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR檢測血清miR-335-5p、SRF水平引物序列

1.3 統計學方法應用SPSS 23.0 處理數據。符合正態分布的計量資料如CRP、SRF、NIHSS 評分以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，三組間行單因素方差分析，組內兩兩比較為LSD 法；不同時間點血清miR-335-5p、SRF 水平及MoCA 評分比較采用雙因素重復測量方差分析。計數資料以例（%）表示，采用χ2檢驗。logistic 回歸模型分析腦卒中病人發生VCI 的影響因素。Peasrson 法分析血清miR-335-5p 與SRF 水平的相關性。受試者操作特征曲線（ROC 曲線）分析血清miR-335-5p、SRF 預測腦卒中后VCI 的效能，曲線下面積（AUC）比較采用Z檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者基線資料比較對照組與VCI 組受試者年齡、飲酒史、NIHSS 評分、Hcy 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組受試者性別、吸煙史、腦卒中類型、腦卒中部位、受教育年限、高血壓、糖尿病、冠心病、高脂血癥、三酰甘油、總膽固醇、LDL-C、CRP、HDL-C 及空腹血糖水平相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組受試者基線資料及臨床指標分析

2.2 兩組受試者血清miR-335-5p、SRF 水平比較對照組與VCI 組受試者發病時血清miR-335-5p、SRF 水平比較顯示，VCI 組血清miR-335-5p 表達水平低于對照組（0.76±0.15 比1.06±0.07），SRF 水平高于對照組（1.52±0.24比1.01±0.09），差異有統計學意義（t=19.01、20.87，均P＜0.001）。

2.3 三組受試者不同時間點血清miR-335-5p、SRF水平及MoCA 評分比較對照組受試者發病時、發病后6個月及1年時MoCA評分、miR-335-5p、SRF水平相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。VD 組、VCIND 組受試者在發病后6 個月、發病后1 年時MoCA 評分、SRF 水平低于發病時，而miR-335-5p 水平高于發病時，差異有統計學意義（P＜0.05）；VD 組受試者發病后1年MoCA 評分低于發病后6個月，差異有統計學意義（P＜0.05）；VCIND 組發病后1 年受試者MoCA 評分、miR-335-5p 水平、SRF 水平與發病后6 個月相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。發病時，三組受試者的MoCA評分差異無統計學意義（P＞0.05），而對照組、VCIND 組、VD 組的miR-335-5p 水平逐次降低，SRF水平呈升高趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05）。發病后6 個月及發病后1 年時，對照組、VCIND 組、VD 組MoCA 評分均逐次降低，差異有統計學意義（P＜0.05），而miR-335-5p水平、SRF水平無明顯變化（P＞0.05）。三組MoCA評分、miR-335-5p、SRF 組間、時間、交互作用差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 三組受試者不同時間點MoCA評分、血清miR-335-5p及SRF水平比較/

表3 三組受試者不同時間點MoCA評分、血清miR-335-5p及SRF水平比較/

注：MoCA 評分為蒙特利爾認知評估量表評分，SRF 為血清應答因子。①與本組發病時相比，P＜0.05。②與對照組同時間相比，P＜0.05。③與本組發病后6個月相比，P＜0.05。④與VD組同時間相比，P＜0.05。

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2.4 相關性分析發病時，VCI 組血清miR-335-5p與SRF水平存在負相關性（r=-0.64，P＜0.001）。

2.5 腦卒中病人發生VCI 的影響因素分析以VCI 為因變量，將單因素分析中差異有統計學意義的年齡、NIHSS 評分、飲酒史、Hcy、miR-335-5p、SRF為自變量，進行logistic 回歸分析。年齡、NIHSS 評分、miR-335-5p、SRF 是影響腦卒中病人發生VCI 的危險因素（P＜0.05）。見表4。

表4 腦卒中病人220例發生VCI的影響因素分析

2.6 血清miR-335-5p、SRF 預測VCI 的ROC 曲線ROC 分析顯示，血清miR-335-5p 水平預測腦卒中后VCI 的AUC 為0.88［95%CI：（0.84，0.93）］，截斷值為0.92，靈敏度為78.20%，特異度為87.30%；血清SRF 水平預測腦卒中后VCI 的AUC 為0.90［95%CI：（0.86，0.95）］，截斷值為1.20，特異度為93.60%，靈敏度為79.10；miR-335-5p 聯合SRF 預測VCI 的AUC為0.93［95%CI：（0.89，0.97）］，特異度為89.20%，靈敏度為79.10%。3 種預測方式的AUC 比較顯示：miR-335-5p 與SRF 的Z=0.66、P=0.511，miR-335-5p與聯合的Z=2.28、P=0.023，SRF與聯合的Z=2.12、P=0.034。

3 討論

VCI 是由多種腦血管疾病引起的異質性疾病，表現為認知處理速度較慢、執行功能較差，致殘率高［2］。腦卒中是臨床常見且具有高致殘率的腦血管疾病，約30%的病人在發病后出現VCI［11］。目前，VCI的臨床診斷包括臨床評估、神經影像學檢查、神經認知功能測試，但均存在診斷局限性［12］。其中，VCI 病人出現明顯癥狀時已處于晚期，錯過最佳治療時間；神經影像學檢查難以區分VD 及AD；神經認知功能測試尚無廣泛認可的認知功能測試。因而，需要探究能夠用于臨床早期診斷VCI 的血清學指標，以便于及時采取治療措施，有效逆轉病情，避免癡呆等不良后果。本研究結果顯示，對照組與VCI組受試者年齡、飲酒史、NIHSS評分、Hcy水平比較，差異有統計學意義；并經logistic 回歸分析發現，年齡、NIHSS 評分是影響腦卒中病人VCI 的危險因素。黃曉蕓等［13］同樣發現，年齡、NIHSS評分是影響腦卒中后VCI的危險因素，說明對于高齡、NIHSS 評分較高者，臨床上應給予重視。

VCI 涉及多種病理生物學變化，腦灌注不足和神經血管單元損傷是VCI 的主要病理生物學機制，而炎癥因子的大量釋放通過作用于局部神經元，通過破壞神經元結構，影響認知功能［14］。以往研究顯示，miRNA 在調節炎癥反應、神經元發育、造血、受損組織的修復和重塑、氧化應激等中發揮關鍵作用［4］。近期，有學者發現，miR-335-5p 可能是腦卒中［15］、VD［5］的關鍵預后標志物和新的治療靶點。此外，miR-335-5p 還在肌萎縮側索硬化癥病人血清中下調表達，miR-335-5p 的下調會增強SH-SY5Y 的線粒體自噬和凋亡，增加活性氧和超氧化物歧化酶活性［6］。本研究首次利用熒光定量PCR 技術檢測了miR-335-5p 在腦卒中后VCI 病人血清中水平變化，結果發現，VD 組發病時血清miR-335-5p 表達水平明顯低于VCIND 組、對照組，VCIND 組又低于對照組，說明血清miR-335-5p 表達水平越低，腦卒中后認知功能障礙越嚴重。發病后6 個月及1 年時VCIND 組、VD 組血清miR-335-5p 水平即恢復至對照組水平，說明miR-335-5p 可能僅在腦卒中后前期參與認知功能障礙形成過程。過表達miR-335-5p能夠抑制炎癥因子分泌，降低G 蛋白偶聯受體激酶4 表達水平，保護HA-VSMC 減少損傷［16］。基于本研究結果，推測腦卒中病人發病時血清miR-335-5p 越低，病人越易發生認知功能障礙，而miR-335-5p 的低表達導致機體炎癥因子大量分泌，損傷血管內皮，斑塊形成，阻礙血運重建，加速腦血管損傷，增加VCI 風險。本研究多因素logistic 回歸分析發現，miR-335-5p 水平降低是VCI 發生的獨立危險因素，說明miR-335-5p 水平與腦卒中后認知障礙發生顯著相關，miR-335-5p 水平減少，VCI 發生風險增加。因而，本研究利用ROC 曲線分析了miR-335-5p 對VCI 的預測價值，發現AUC 為0.88［95%CI：（0.84，0.93）］，提示腦卒中病人發病時檢測血清miR-335-5p水平能夠及早預測VCI發生，并盡早治療。

SRF 是一種高度通用性轉錄因子，參與調節神經元的遷移、神經突出、軸突和樹突分化以及突觸功能［17］。SRF的缺失導致小鼠模型體內肝星狀細胞的活性氧水平，改善肝纖維化，說明SRF 參與氧化應激過程［18］。SRF還在AD小腦動脈中的過表達，能激活SRF 依賴的SM 收縮基因而增加動脈收縮力減少血流量，被證實有助于疾病進展［7］。本研究結果顯示，在VCI 組受試者血清中SRF 水平明顯高于對照組，說明SRF 與認知功能障礙形成有關。進一步分析發現，發病時，對照組、VCIND 組、VD 組SRF 水平逐次升高，說明腦卒中后SRF 水平越高，病人后期認知障礙越嚴重；發病后6 個月、發病后1 年時VCIND 組、VD 組血清SRF 恢復至與對照組相同水平，說明SRF 可能僅參與腦卒中發病后VCI 形成過程，當VCI 形成后，病人SRF 水平即恢復至正常水平。SRF 水平升高是影響VCI 發生的危險因素，說明SRF 水平與認知障礙程度有關，早期監測血清SRF 水平變化，能夠輔助臨床VCI的診斷。此外，有學者認為SRF 可替代Scr 作為AKI 潛在的新早期診斷標志物［19］。本研究ROC 顯示，血清SRF 水平預測腦卒中后VCI 的AUC 為0.90［95%CI：（0.86，0.95）］，提示SRF 預測VCI 的效能較高。Pearson 相關性發現，miR-335-5p與SRF存在負相關，說明二者可能在腦卒中后VCI 過程中存在相互作用，但具體調控機制仍待后續探究。為了提高miR-335-5p、SRF 對VCI 預測效能，本研究將miR-335-5p 聯合SRF 預測VCI，結果顯示AUC 為0.93，明顯高于miR-335-5p、SRF 單獨預測效能，這說明將miR-335-5p 聯合SRF能顯著提高診斷效能。

綜上所述，miR-335-5p、SRF 與腦卒中后VCI 形成密切相關，miR-335-5p 水平降低，SRF 水平上升，將導致VCI 病情加重，且二者聯合能夠用于臨床預測VCI 發生。本研究納入樣本量較少，血清miR-335-5p、SRF 對腦卒中后VCI 發生的預測效能還需要后續擴大樣本量論證，同時需要開展細胞實驗等探究miR-335-5p、SRF在VCI中的具體調控機制。