巖藻黃素對小鼠非酒精性脂肪性肝病的修復作用

任祥雨，鄭佳文，田笑笑，曹洪杰，李航婷，唐云平，楊最素

（浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江省海洋生物醫用制品重點工程技術研究中心，浙江 舟山 316022）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種與酒精無關的、以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變性為主要特征的一類臨床病理綜合征。NAFLD可從脂肪變性發展為非酒精性脂肪性肝炎、纖維化、肝硬化，容易發展為癌癥，是目前最常見的慢性肝臟疾病[1]。NAFLD的全球患病率為25%，NAFLD已成為全球關注的公共健康問題，患者會同時出現2型糖尿病、高血脂、高血壓和心腦血管疾病等并發癥[2]。目前，臨床上缺乏針對NAFLD的特效藥物。盡管NAFLD發病機制尚未完全明晰，但肝脂質聚積所致的氧化應激、炎性應激等是導致疾病發生發展的重要機制[3]。研究顯示，高脂飲食是導致NAFLD的形成與發生的重要因素[4]。NAFLD患者通常會出現體脂和肝質量的增加、血脂水平變化以及肝脂肪病變，并伴隨著炎癥的發生。因此對于NAFLD的預防和治療仍然強調健康的生活方式和降低體質量的重要性。

已有的研究表明，從海洋褐藻中提取的非VA類胡蘿卜素——巖藻黃素是一種呈橙紅色的粉末狀物質，其分子式為C42H58O6，密度為1.09 g/cm3，熔點為166～168 ℃。其不溶于水，易溶于有機溶劑，穩定性較差，但具有強大的抗氧化、減輕炎癥等生理活性，且分子質量很小，很容易被生物體吸收[5]。本實驗室前期研究發現，巖藻黃素對小鼠急性酒精性肝損傷具有保護作用，其機制是激活核轉錄因子紅系2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）介導的抗氧化防御和抑制由Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）介導的炎癥機制相關[6]。此外，還發現巖藻黃素可以改善體外NAFLD細胞模型中的脂質沉積，降低炎癥因子白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的釋放，通過抑制TLR4信號通路的關鍵蛋白并通過過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferators-activated receptors α，PPARα）途徑改善Chang liver細胞脂質代謝平衡而發揮作用[7]。然而巖藻黃素對高脂飼料誘導C57BL/6J小鼠建立的NAFLD模型是否具有修復作用目前報道不多。本實驗通過給予8 周高脂飼料喂養小鼠，建立小鼠非酒精性脂肪性肝病的動物模型后，從體內途徑通過檢測小鼠生理、生化指標的變化，肝臟中主要抗氧化酶和炎癥因子的水平、降脂抗炎信號傳導途徑相關蛋白表達的變化，來探究巖藻黃素對高脂飲食誘導的小鼠NAFLD的修復作用機制，為開發海洋來源的天然抗氧化劑在慢性肝病中的防治作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性C57BL/6J小鼠52 只（4 周齡，體質量為16～18 g），購自浙江省實驗動物中心（生產許可證號：SCXK 2014-0001）。實驗小鼠均在本校SPF級動物房（SYXK（浙）2014-0013）中飼養，飼養條件為24～26 ℃、60%相對濕度、12 h光/暗循環控制條件，自由進食進水（全營養滅菌飼料，去離子水），適應性飼養1 周后對所有小鼠進行稱質量并分組開始實驗。

60%高脂實驗鼠糧（D12492）蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司；巖藻黃素（70%）山東潔晶集團股份有限公司；脂聯素、瘦素試劑盒 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和糖原染色（periodic acidschiff stain，PAS）試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染色試劑盒上海碧云天生物技術有限公司；DAB免疫組織化學試劑盒博士德生物工程有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、三羥甲基氨基甲烷、ECL Plus超敏發光液、20×TBS、牛血清白蛋白V 北京索萊寶科技有限公司；甲醇、吐溫80 國藥集團化學試劑有限公司；甘氨酸上海麥克林生化科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉GEN-VIEW科技有限公司；NAD(P)H-醌氧化還原酶1（NAD(P)H quinone oxidoreductase 1，NQO1）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein-1，Keap-1）、Nrf2、谷氨酸-半胱氨酸連接酶（glutamatecysteine ligase modifier，GCLM）、5’-單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶（p-acetyl-CoA carboxylase，p-ACC）、肉堿脂酰轉移酶1（carnitine acyl transferase 1，CPT-1）、固醇調節元件結合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）、PPARα、磷酸化5’-單磷酸腺苷活化蛋白激酶（p-adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，p-AMPK）、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FAS）武漢三鷹生物科技有限公司；TLR4、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、磷酸化人核因子κB抑制蛋白α（p-nuclear factor κB inhibitory protein α，p-IκBα）、磷酸化核因子κB（p-nuclear factor kappa-B，p-NF-κB）蛋白 上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CX31型光學顯微鏡 日本OLYMPUS公司；RM2135型切片機、HI1210型攤片機、H1220型烤片機德國Leica公司；SpectraMax型酶標儀、Mini sub cell型電泳系統 美國Bio-Rad公司；BSA124S型電子天平德國Satorius AG公司；CF16RX II型高速低溫離心機日本日立公司；Fluor Chem FC3型化學發光成像分析系統美國ProteinSimple公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組

實驗動物分組情況如圖1所示，適應性喂養1 周后，隨機挑選14 只小鼠喂養普通飼料（Con組），其余38 只小鼠均給予高脂飼料進行自由進食，8 周后，從Con組和高脂飼料（high fat diet，HFD）組中各挑選小鼠2 只，進行血清生化指標檢測和肝臟組織學觀察，發現高脂飼料組中血清生化指標（谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）等）明顯高于Con組，且伴有肝細胞中的空泡樣脂肪沉著，表明NAFLD小鼠模型建立成功。然后將喂養高脂飼料的小鼠隨機分為3 組（每組12 只）進行灌胃治療，每日1 次，連續6 周：1）普通飼料+生理鹽水（HFD組）；2）普通飼料+20 mg/kgmb巖藻黃素（Fx-20組）；3）普通飼料+40 mg/kgmb巖藻黃素（Fx-40組）。每周記錄小鼠的體質量。第14周結束時小鼠禁食12 h后全部處死。肝臟、脂肪解剖離體后立即稱質量并進行觀察拍照，所有組織和血清按實驗所需要保存備用。

圖1 小鼠分組和實驗方法Fig.1 Grouping and treatments of mice

1.3.2 小鼠Lee’s指數的計算

根據小鼠的體質量與體長，計算Lee’s指數。其計算公式為：

1.3.3 小鼠血清生化指標的測定

小鼠眼球取血，4 ℃、10000 r/min離心5 min取血清。血清樣本收集后于-80 ℃儲存，谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活力，總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、LDL-C、HDL-C、游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）脂聯素和瘦素含量按試劑盒說明書進行測定。

1.3.4 小鼠肝臟中炎癥因子和抗氧化指標的測定

稱取一定質量的肝臟，用生理鹽水均質處理制成10%的勻漿液，混合液以4000 r/min離心10 min后，取上清液，依照試劑盒操作說明對肝臟中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及抗氧化指標MDA、SOD、谷胱甘肽（glutathione，GSH-Px）、CAT含量進行測定。

1.3.5 小鼠組織切片和形態學分析

1）H&E染色和PAS：小鼠肝臟、脂肪組織取出后，切成1 cm2大小立即放入4%中性甲醛固定液中固定，經脫水、包埋、制片，按說明書染色后，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

2）油紅O染色：小鼠肝組織取出后經常規方法進行冰凍切片，按試劑盒說明進行油紅O染色，光學顯微鏡下觀察并拍照。

3）透射電鏡觀察：小鼠肝組織取出后，切成0.5 cm2大小立即放入2.5%戊二醛固定液中固定，委托浙江大學電鏡中心進行透射電鏡觀察。

1.3.6 蛋白免疫印跡法檢測小鼠肝臟中相關蛋白的表達情況

提取肝臟中蛋白：液氮中研磨肝組織，加入預先配制含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液并充分混勻，4 ℃條件下10000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定各個樣品的蛋白濃度，加入適量的5×蛋白上樣緩沖液并在95 ℃金屬浴條件下10 min致蛋白質變性，封口后于-20 ℃保存。蛋白免疫印跡法參考Ren Xiangyu等[8]方法進行。

1.3.7 免疫組織化學法觀察小鼠肝臟中p-AMPK、p-ACC、FAS的表達

小鼠肝臟切片至5 μm厚，脫蠟至水，EDTA高溫高壓進行修復抗原，3% H2O2封閉內源性過氧化物酶10 min，37 ℃、5% BSA封閉30 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育30 min，滴加DAB顯色，鏡下控制時間，蘇木素染核2 min，脫水、透明、中性樹膠封片后在光學顯微鏡下觀察各蛋白的表達情況并拍照，隨后用ImageJ軟件對各蛋白表達量進行半定量分析。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 巖藻黃素對小鼠體質量和肝臟指數的影響

如圖2所示，飼喂高脂飼料的小鼠出現明顯的體質量上升和豎毛現象。第9周開始用巖藻黃素干預后，小鼠體質量開始下降，特別是Fx-40組的小鼠體質量接近于Con組。此外，和Con組相比，HFD組小鼠的肝臟指數和Lee’s指數也顯著上升（P＜0.01），而巖藻黃素組逆轉了這一現象，Fx-40組小鼠的肝臟指數和Lee’s指數與Con組相比無顯著差異（P＞0.05）。說明巖藻黃素對抑制高脂飲食引起的體質量和肝質量增加效果明顯。

圖2 巖藻黃素對NAFLD小鼠體質量、肝臟指數的影響Fig.2 Effect of fucoxanthin on body mass and liver index in NAFLD mice

2.2 巖藻黃素對小鼠脂肪質量的影響

相較于皮下脂肪，內臟脂肪的顯著增加更能直觀地反映出小鼠存在代謝紊亂、肥胖等健康問題。如圖3所示，HFD誘導后小鼠體內附睪和腎周脂肪明顯增多，與HFD組相比，用巖藻黃素干預的小鼠脂肪質量顯著減少（P＜0.01）。同時，對各組的附睪脂肪進行H&E染色，結果顯示，與Con組相比，HFD組小鼠附睪脂肪細胞明顯增大，而經巖藻黃素處理后小鼠的附睪脂肪細胞明顯減小。

圖3 巖藻黃素對NAFLD小鼠脂肪質量的影響Fig.3 Effect of fucoxanthin on fat mass in NAFLD mice

2.3 巖藻黃素對小鼠血清ALT和AST活力的影響

血清ALT、AST的檢測結果如圖4所示，對比Con組，HFD組的ALT和AST活力出現了異常升高。而與HFD組相比，巖藻黃素給藥組小鼠血清中的ALT和AST活力均顯著降低（P＜0.01）。

圖4 巖藻黃素對NAFLD小鼠血清ALT（A）和AST（B）水平的影響Fig.4 Effect of fucoxanthin on the serum levels of ALT (A) and AST (B)in NAFLD mice

2.4 巖藻黃素對小鼠血脂水平的影響

小鼠血清中脂質代謝參數TG、TC、LDL-C、HDL-C和FFA的含量如表1所示。相較于Con組，HFD組小鼠血清中TG、TC、LDL-C和FFA含量均顯著升高（P＜0.01），而HDL-C則顯著性下降（P＜0.01）。與此同時，巖藻黃素組中小鼠的TG、TC、LDL-C和FFA含量相較于HFD組則顯著下降（P＜0.01），并且基本恢復到正常水平，而HDL-C含量明顯升高。

表1 巖藻黃素對NAFLD小鼠血脂水平的影響Table 1 Effect of fucoxanthin on blood lipid levels in NAFLD micemmol/L

2.5 巖藻黃素對小鼠血清脂聯素和瘦素水平的影響

如圖5所示，HFD誘導使小鼠血清中脂聯素水平下降，瘦素水平上升。而與HFD組相比，巖藻黃素可降低血清中瘦素水平，并增加脂聯素的分泌。

圖5 巖藻黃素對NAFLD小鼠血清脂聯素（A）和瘦素（B）水平的影響Fig.5 Effect of fucoxanthin on the serum levels of adiponectin (A) and leptin (B) in NAFLD mice

2.6 巖藻黃素對小鼠肝臟組織學結構的影響

各組小鼠解剖后，取出肝臟用生理鹽水清洗后觀察其形態的變化。如圖6所示，可見Con組小鼠肝臟體積較小，呈鮮艷的暗紅色，相比之下，HFD組肝臟體積變大，顏色偏黃無光澤，經巖藻黃素處理后肝臟的體積減小，顏色與正常相近呈暗紅色。

圖6 巖藻黃素對NAFLD小鼠肝臟組織形態學的影響Fig.6 Effect of fucoxanthin on morphological characteristics of liver tissue in NAFLD mice

H&E染色結果顯示，Con組小鼠的肝索呈放射狀排列在中央靜脈周圍、肝細胞胞質內少見脂肪滴。而HFD組的肝索排列紊亂，細胞質出現大量空泡樣變性。經巖藻黃素處理后肝組織修復較好，肝索排列整齊，細胞質中空泡較少。

油紅O染色陽性部位呈紅色顆粒，從圖6可以看出，HFD組肝組織較Con組出現大量的脂質沉積，細胞內可見不同大小的脂滴。而巖藻黃素組切片顯示細胞內脂滴分布明顯減少。

PAS陽性部位為細胞質內出現的紫紅色區域，從圖中可見，HFD組細胞內與細胞間糖原染色明顯增多，糖原顆粒明顯。巖藻黃素組的糖原陽性區域明顯減少。

2.7 巖藻黃素對小鼠肝臟超微結構的影響

如圖7所示，Con組小鼠肝臟細胞內細胞器豐富，核膜清晰；HFD組小鼠肝臟中出現大量大小不一、電子密度低的白色圓形脂滴，同時細胞器結構模糊，粗面內質網減少，滑面內質網腫脹，核膜不清晰。經巖藻黃素干預后，內質網的數量增多，脂滴數量明顯減少，線粒體明顯增多。

圖7 巖藻黃素對NAFLD小鼠肝臟超微結構的影響Fig.7 Effect of fucoxanthin on ultrastructure of liver tissue in NAFLD mice

2.8 巖藻黃素對小鼠肝臟脂質過氧化的影響

如圖8所示，MDA是細胞膜脂質過氧化的標志性產物，與Con組相比，HFD組MDA含量顯著增高（P＜0.01），而相較于HFD組，巖藻黃素組小鼠肝臟中MDA的含量明顯降低。肝臟中SOD、GSH-Px和CAT是體內固有抗氧化防御系統的標志物，與Con組相比，HFD組中SOD、GSH-Px和CAT的活性顯著下降（P＜0.01），而巖藻黃素干預可以逆轉由HFD引起的小鼠肝臟中抗氧化酶活力的下降，使其呈劑量依賴性增加。

圖8 巖藻黃素對NAFLD小鼠肝臟脂質過氧化的影響Fig.8 Effect of fucoxanthin on lipid peroxidation of liver tissue in NAFLD mice

2.9 巖藻黃素對小鼠肝臟中炎癥因子水平的影響

為探究巖藻黃素對HFD誘導小鼠NAFLD炎癥水平的影響，檢測了血清中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的質量濃度。如圖9所示，相較于Con組，HFD組小鼠肝臟中IL-1β、IL-6和TNF-α質量濃度均顯著增加（P＜0.01），而與HFD組相比，巖藻黃素組這3 種因子的質量濃度均顯著下降（P＜0.01）。

圖9 巖藻黃素對NAFLD小鼠肝臟中炎癥因子質量濃度的影響Fig.9 Effect of fucoxanthin on the levels of inflammatory cytokines in liver tissue of NAFLD mice

2.10 巖藻黃素對AMPK通路相關蛋白表達的影響

如圖10所示，相較于Con組，HFD組小鼠肝臟中p-AMPK、PPARα蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），SREBP-1c、FAS蛋白的表達上升；給予巖藻黃素干預后p-AMPK和PPARα的蛋白表達水平顯著上升（P＜0.01），SREBP-1c表達下降，上調p-ACC、CPT-1蛋白和抑制FAS蛋白的表達。

圖10 巖藻黃素對NAFLD小鼠肝臟中AMPK通路相關蛋白表達的影響Fig.10 Effect of fucoxanthin on the expression of proteins associated with AMPK signaling pathway in liver tissue of NAFLD mice

為了進一步證實該結論，采用免疫組織化學法檢測小鼠肝臟組織中p-AMPK、p-ACC和FAS蛋白的表達，細胞質中出現的棕黃色結構即為陽性部位。如圖11所示，經各蛋白的半定量分析結果可以看出，免疫組織化學的結果與蛋白免疫印跡法結果一致。

圖11 免疫組織化學法檢測NAFLD小鼠肝臟中p-AMPK、p-ACC和FAS光學顯微鏡照片和蛋白表達情況Fig.11 Immunohistochemical results of optical microscope photo and the protein expression of p-AMPK,p-ACC and FAS in liver tissue of NAFLD mice

2.11 巖藻黃素對Nrf2通路相關蛋白表達的影響

為進一步探討巖藻黃素對NAFLD小鼠氧化應激關鍵調控蛋白的影響，檢測了Keap/Nrf2通路關鍵蛋白的表達。如圖12所示，HFD喂養后可顯著提高小鼠肝臟中Keap-1的水平（P＜0.01），同時抑制Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1、NQO1和GCLM的表達水平。巖藻黃素給藥組顯著改變了這些蛋白的表達水平（P＜0.01），與Con組的表達情況一致，說明巖藻黃素可以通過激活Nrf2介導的抗氧化反應，從而減輕HFD對小鼠肝臟造成的氧化應激。

圖12 巖藻黃素對NAFLD小鼠肝臟中Nrf2通路相關蛋白表達的影響Fig.12 Effect of fucoxanthin on the expression of proteins associated with the Nrf2 signaling pathway in liver tissue of NAFLD mice

2.12 巖藻黃素對TLR4通路相關蛋白表達的影響

TLR4信號通路與NAFLD發展過程密切相關，從圖13可以看出，相較于Con組，HFD組小鼠肝臟中TLR4表達顯著上調（P＜0.01），同時啟動下游信號級聯，誘導MyD88、p-IκBα和p-NF-κB (p65)表達顯著上調（P＜0.01）。而巖藻黃素有效抑制了這些蛋白的上調，表明巖藻黃素能通過減少TLR4蛋白的表達，繼而抑制其與下游MyD88的結合，減少炎癥因子的合成及活化，從而達到抑制炎癥產生、緩解肝臟損傷的目的。

圖13 巖藻黃素對NAFLD小鼠肝臟中TLR4通路相關蛋白表達的影響Fig.13 Effect of fucoxanthin on the expression of proteins associated with the TLR4 signaling pathway in liver tissue of NAFLD mice

3 討論

隨著生活方式及飲食習慣的改變，全球代謝綜合征患病率不斷上升，NAFLD已取代病毒性肝病成為全球第一肝病，對病人的身體造成嚴重的影響并加重了經濟負擔。然而NAFLD尚無明確的發病機制，缺乏有效的防治方法[9]。目前的“多重打擊假說”已取代了“二次打擊”，從最初的脂質堆積和單純脂肪變性，逐漸演變為線粒體功能障礙、氧化應激、脂肪和細胞因子改變等，最終導致NAFLD發展為非酒精脂肪性肝炎[10]，因此減脂、抗氧化應激、抗炎癥反應仍是防治的要點[11-12]。

本實驗發現，經高脂飲食誘導可成功建立NAFLD模型，表現為小鼠體質量異常增加，肝臟指數和Lee’s指數增加，肝組織結構中出現大量的脂滴堆積，附睪和腎周脂肪的質量增加及脂肪細胞體積增大，肝功能敏感指標ALT、AST升高，并伴有血清TG、TC和LDL-C等血脂水平的增高，而給予巖藻黃素后改善了這些異常表現，使肝的形態結構、肝功能敏感指標和血脂水平恢復到正常范圍。同時使用巖藻黃素后減輕了氧化應激水平，表現為SOD、GSH-Px和CAT水平的升高，MDA水平的降低；炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的質量濃度呈現明顯下降，表明巖藻黃素通過抑制脂質水平和減輕氧化應激改善小鼠NAFLD，這與文獻報道的修復NAFLD的活性物質的機制[13-14]相似。另有研究表明，肥胖小鼠的脂肪組織可分泌過量的瘦素，并與下丘腦神經元上的瘦素受體發生結合，從而降低食欲，減輕體質量[15]。脂聯素也是由脂肪細胞分泌產生，可調節血清中的葡萄糖和脂質水平，并減少肝臟中的脂質積累[16]，實驗中給予巖藻黃素改善NAFLD的作用可通過降低血清中瘦素水平、升高脂聯素的分泌而實現。

AMPK可通過調節脂質分解代謝和合成代謝來改善能量代謝的激酶，并調節相關基因和蛋白的表達，因此是代謝疾病的潛在治療靶標。AMPK活化可能通過抑制肝臟中的脂肪生成、增加ACC的磷酸化來改善脂肪酸氧化，抑制NAFLD[17]。AMPK信號通路活化可以改善NAFLD小鼠肝臟的脂質沉積[18]。在NAFLD中，PPARα的激活可預防TG的積累，調節炎癥反應[19]；并可通過誘導CPT-1表達而增加游離脂肪酸氧化[20]。而AMPK是下游ACC、SREBP-1c和FAS的主要激酶調節因子[21-22]，其中ACC主要存在于合成脂類組織的細胞質中[23]；SREBP-1c是一種細胞質轉錄因子，主要被胰島素激活，在脂質合成的誘導中起核心作用[24]；FAS是脂肪酸從頭合成的關鍵酶[25]，其過表達會導致大量脂肪酸的合成，SREBP-1c通過刺激FAS來誘導脂肪酸和TG的合成。有研究表明，在糖尿病小鼠模型中巖藻黃素能通過激活AMPK調節糖原生成[26-27]。因此檢測AMPK通路的相關蛋白可判斷巖藻黃素是否激活該通路影響能量代謝。本實驗結果表明，在HFD組中，AMPK通路蛋白受到抑制，同時脂質合成關鍵蛋白的表達增加，而巖藻黃素改變了這一現象：激活AMPK通路，通過PPARα途徑改善肝臟脂質代謝平衡，減少脂質的生成，促進NAFLD修復。

脂質積累的衰減和氧化應激的抑制將是治療NAFLD的有效方法[28]。Nrf2信號作為關鍵的細胞防御系統，通過調節一系列基因來防止病理性損傷[29]。Nrf2信號還參與負控制脂質積累，不僅通過抑制FFA攝取因子，也可通過激活PPARα信號來調節脂肪酸代謝和轉運[30]。Nrf2通過參與脂質代謝、炎癥和抗氧化反應的調節，在NAFLD的發展中起關鍵作用[31]。有報道稱，橘子素通過Nrf2途徑改善高脂肪飲食誘導的NAFLD小鼠的肝脂肪變性和氧化應激[32]。本實驗通過檢測Keap/Nrf2介導的抗氧化通路相關蛋白的表達，發現巖藻黃素可明顯降低Keap-1的水平，增加Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1、NQO1和GCLM的表達水平，因此巖藻黃素通過調節肝細胞抗氧化系統和脂質過氧化反應而發揮修復作用。

TLR4信號傳導是先天免疫的關鍵組成部分，與NAFLD的發病機制有關，當其與特異性配體結合后，可通過系列的級聯反應激活信號通路下游的炎癥因子，導致肝臟損傷[33]。有研究證明，TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB的水平在HFD誘導的NAFLD大鼠肝臟中顯著增加[34]，本實驗結果與此相似，即給予巖藻黃素后，這些相關的蛋白表達明顯下降，表明巖藻黃素可通過TLR4/NF-κB途徑介導其在NAFLD修復中的作用。

綜上所述，本研究認為巖藻黃素對HFD誘導的小鼠NAFLD有一定的修復作用，通過調節脂質代謝、抑制氧化應激、調節炎癥反應等多途徑、多靶點起作用，從而對HFD誘導NAFLD的“多重打擊”具有保護作用，為揭示巖藻黃素修復NAFLD的機制提供新的思路。