ε-聚賴氨酸對西番蓮果實采后病害與抗病物質代謝的影響

林育釗，陳蕾伊，陳佳怡，蔣璇靚，鄭金水，陳洪彬,3,*

（1.泉州師范學院海洋與食品學院，福建 泉州 362000；2.泉州市農業科學研究所，福建 泉州 362212；3.近海資源生物技術福建省高校重點實驗室（泉州師范學院），福建 泉州 362000）

西番蓮（Passiflora caeruleaL.），亦稱雞蛋果或者百香果，在我國廣西、福建、廣東、臺灣等地區廣泛栽培[1-2]。西番蓮果實含有豐富的礦物質、酚類、有機酸、維生素等營養成分[2-3]，因而具有較高的食用價值。此外，香氣也是影響西番蓮果實品質的重要特性，丁酸乙酯、己酸乙酯、丁酸己酯、醋酸乙酯、α-松油醇、己醛、β-月桂烯等是果實中重要的香味成分，使得果實具有濃郁的香氣[4-5]。然而，西番蓮果實大多成熟和采收于高溫高濕季節，采后極易發生果實感病、腐爛等品質敗壞現象，不利于采后貯藏及品質保持[2]。病原菌的侵染是誘導西番蓮果實采后感病、腐爛發生的關鍵因素，嚴重限制果實采后貯藏、遠距離貯運與銷售，也是西番蓮果實產業健康發展需要迫切解決的關鍵問題[6]。目前，使用化學殺菌劑（例如丙氯靈、二氯異氰尿酸鈉等）雖然能夠控制西番蓮果實采后病害發生，但是由此帶來的藥物殘留、人體健康損傷及環境污染等問題突出，因而化學殺菌劑不適于西番蓮果實采后病害控制[7]。因此，很有必要尋找一種安全、有效的采后處理技術，以控制西番蓮果實采后病害、腐爛發生，進而提高西番蓮果實采后貯藏品質。

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）是從白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）NO.346中分離而得[8-9]。它是一種安全、有效的抑菌多肽[10-11]，由25～35 個L-賴氨酸殘基通過ε-氨基和α-羧基之間形成的酰胺鍵所形成[11-12]。ε-PL因其具備強抗菌能力、安全性、生物降解性等特性，可在食品中應用[11,13]。有研究報道，ε-PL可控制龍眼[9-10]、草莓[14]等果實采后病害發生，進而穩定果實品質。此外，ε-PL控制采后果實病害的發生，可能是由于ε-PL能提高果實采后抗病相關酶的活性或者提升木質素等抗病物質的含量，進而誘導果實采后抗病性[10,15-16]。

另外，筆者在前期研究中發現，可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）是致使福建黃金西番蓮果實采后腐爛的主要病原菌之一，嚴重降低了果實采后品質。然而，目前鮮見ε-PL提高黃金西番蓮果實抗病物質代謝水平而增強采后抗病性，進而抑制果實采后發生病害的研究報道。因此，本研究以福建省近年來快速發展的黃金西番蓮果實為研究對象，研究ε-PL抑制L.theobromae接種黃金西番蓮果實采后病害發生及其與果皮細胞膜透性、果實抗病性及抗病物質代謝的關系，旨在闡明ε-PL抑制L.theobromae侵染所致黃金西番蓮果實采后病害發生的作用機制，為ε-PL維持黃金西番蓮果實采后品質提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

以福建省主栽黃金西番蓮品種‘福建百香果3號’（Passiflora caeruleaL.cv.Fujian Baixiangguo NO.3）果實為研究對象，果實（8 成熟）采摘于福建南安溪美鎮緣味家庭農場，挑選色澤一致、大小均一、無感病、無損傷、健康的果實，將經過清水清洗、次氯酸鈉浸泡10 s（表面消毒）、無菌水（sterile distilled water，SDW）清洗等步驟后的果實用于后續研究。

L.theobromae由本課題組自主分離、鑒定及保存。另外，參考Zhang Shen等[17]的方法制備L.theobromae孢子懸浮液，將L.theobromae接種至燕麥米糠瓊脂培養基，在光照下連續培養21 d，用SDW洗脫成熟孢子，制成1×105/mL的懸浮液。

ε-PL 鄭州拜納佛生物工程股份有限公司；氯化鋇、苯丙氨酸、葡萄糖-6-磷酸二鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯二酚、磷酸二氫鈉、氯化鎂、抗壞血酸、亮抑酶酞、丙三醇、三氯乙酸、反式肉桂酸、三磷酸腺苷、昆布多糖、檸檬酸、輔酶A、p-香豆酸、愈創木酚、四硼酸鉀、3,5-二硝基水楊酸等（化學純）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

CP224C型分析天平 奧豪斯儀器上海有限公司；Infinite M 200 Pro型酶標儀 瑞士帝肯公司；SQ510C型高壓滅菌器 重慶雅馬拓科技有限公司；S230型電導率儀 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；H2050R型離心機 湖南湘儀儀器有限公司；PRX-450A型智能人工氣候箱 浙江寧波賽福實驗儀器有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果實采后處理與損傷接種

在預實驗中，采用0（對照）、50、100、150 mg/L和200 mg/Lε-PL浸泡西番蓮果實10 min（浸泡時間參照Sun Junzheng等[10]的方法），晾干，采用無菌打孔器在果實赤道面打孔1 個（直徑5 mm，深度3 mm，下同），并在孔中接種20 μLL.theobromae孢子懸浮液，晾干之后裝盤（10 個/盤），再用聚乙烯薄膜袋包裝，置于（28±1）℃、90%相對濕度（relative humidity，RH）的恒溫箱中貯藏7 d。結果發現，100 mg/Lε-PL處理再接種L.theobromae的西番蓮果實具有較低的病斑直徑，果實感病癥狀不明顯。因此，選用100 mg/Lε-PL進行后續實驗。

在獲得ε-PL最佳濃度的基礎上，將挑出來的西番蓮果實分成2 組，進行以下處理（每組均設3 個重復）：1）接種L.theobromae組：SDW浸泡果實10 min后，晾干，打孔，接種20 μL濃度為1×105/mL的L.theobromae孢子懸浮液；2）ε-PL+接種L.theobromae組：ε-PL浸泡果實10 min后，晾干，打孔，接種20 μL濃度為1×105/mL的L.theobromae孢子懸浮液。

西番蓮果實經上述處理之后，晾干，裝盤（10 個/盤），包裝聚乙烯薄膜袋，貯藏在（28±1）℃、90% RH的恒溫箱中。在貯藏期，隨機取樣觀察果實外觀變化，測定果實病斑直徑，并從果實發病部位外10～30 mm內取樣，測定相關指標。

1.3.2 果皮細胞膜透性的測定

參考Gong Di等[18]的方法測定西番蓮果實的果皮細胞膜透性，結果用%表示。

1.3.3 果實病斑直徑的測定

參考Gong Di等[18]的方法使用十字交叉法測定西番蓮果實的病斑直徑。

1.3.4 果皮木質素質量分數的測定

參照郭欣[7]與Sun Junzheng[10]等的方法測定西番蓮果皮木質素質量分數，結果以%表示。

1.3.5 果皮抗病相關酶活力的測定

參考Sun Junzheng等[10]的方法進行測定西番蓮果皮苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活力；果皮4-香豆酰輔酶A連接酶（4-coumarate CoA ligase，4-CL）、肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）、肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）活力的測定均參照郭欣[7]、Sun Junzheng[10]與Tang Jinyan[19]等的方法；果皮多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活力參考郭欣等[7]的方法進行測定；果皮幾丁質酶（chitinase，CHI）、β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活力參照Tang Jinyan等[19]的方法進行測定。另外，參照Bradford[20]的方法測定蛋白質含量，上述酶活力均以蛋白質含量進行計算。

1.4 數據處理

在本實驗中，除測定病斑直徑進行10 次重復之外，其他指標均設置3 次重復。利用Microsoft Excel 2019軟件進行繪圖；利用SPSS 22.0軟件進行數據統計與相關性分析。

2 結果與分析

2.1 果實外觀變化和病斑直徑

由圖1A可知，在貯藏0 d時，西番蓮果實果皮呈現明亮的黃綠色，果實外形完整。然而，隨著貯藏時間的延長，果實果皮色澤由黃綠色變成黃色，之后再變成褐色。對于接種L.theobromae組，從貯藏2 d開始，果實接種處快速長出菌絲，并由白色轉變為黑色，果實感病加重；同時接種處伴有嚴重的黃褐色腐爛癥狀，并向周邊擴散，果實腐敗程度加劇。然而，與接種L.theobromae組比較，ε-PL+接種L.theobromae組的果實接種處菌絲生長較緩，果實感病癥狀較輕；同時接種處黃褐色腐爛癥狀較輕，腐爛癥狀向周邊擴散速度較慢，果實腐敗較不嚴重。

圖1 ε-PL對接種L.theobromae西番蓮果實外觀（A）和病斑直徑（B）的影響Fig.1 Effect of ε-PL on appearance (A) and lesion diameter (B) of L.theobromae-inoculated passion fruits

果實病斑直徑是一個評價果實采后病害發生的重要指標。由圖1B可知，兩個處理組的西番蓮果實病斑直徑在貯藏0～1 d均為0，但是從貯藏1 d開始，表現出不同的變化趨勢。相比于接種L.theobromae組，ε-PL+接種L.theobromae組病斑直徑增大速度較為緩慢。基于顯著性分析，ε-PL+接種L.theobromae組的病斑直徑在貯藏4 d顯著低于接種組（P＜0.05），在貯藏5～7 d極顯著低于接種組（P＜0.01）。

因此，ε-PL能延緩接種L.theobromae西番蓮果實采后病害的發生。

2.2 果皮細胞膜透性

完整的細胞膜對植物細胞正常生命活動具有重要作用[18]，細胞膜的損傷將影響采后抗病性，一般用細胞膜透性表示細胞膜的損傷程度[21]。由圖2可知，西番蓮果實的果皮細胞膜透性于貯藏0～7 d快速升高。相比之下，ε-PL+接種L.theobromae組的果皮細胞膜透性在貯藏0～7 d低于接種L.theobromae組，并在貯藏2 d達到顯著水平（P＜0.05），在貯藏4～7 d達到極顯著水平（P＜0.01）。因此，ε-PL能延緩接種L.theobromae西番蓮果實采后果皮細胞膜透性的上升。

圖2 ε-PL對接種L.theobromae西番蓮果實果皮細胞膜透性的影響Fig.2 Effect of ε-PL on cell membrane permeability in pericarp of L.theobromae-inoculated passion fruits

2.3 果皮木質素質量分數

木質素作為植物抗病系統中的重要組成，能抵抗病原菌入侵[7,10]。由圖3可知，接種L.theobromae組的西番蓮果實果皮木質素質量分數在貯藏0～5 d快速升高，隨后快速下降。然而，ε-PL+接種L.theobromae組的果皮木質素質量分數在貯藏0～4 d快速升高，隨后快速降低。進一步比較可知，與接種L.theobromae果實的果皮木質素質量分數對比，ε-PL+接種L.theobromae組具有較高水平，并在貯藏3、5～7 d具有顯著水平（P＜0.05），在貯藏4 d具有極顯著水平（P＜0.01）。

圖3 ε-PL對接種L.theobromae西番蓮果實果皮木質素質量分數的影響Fig.3 Effect of ε-PL on lignin content in pericarp of L.theobromaeinoculated passion fruits

因此，ε-PL可提升接種L.theobromae西番蓮果實果皮木質素水平。

2.4 果皮PAL、C4H、4-CL、CAD和POD活性

PAL、C4H、4-CL、CAD與POD是苯丙烷代謝途徑中的重要酶，參與合成木質素[7,10,22]。由圖4A可知，接種L.theobromae組的西番蓮果實果皮PAL活性在貯藏0～1 d較快降低，1～2 d較快升高，2～3 d較快降低，3～6 d加劇提高，之后快速減少。然而，ε-PL+接種L.theobromae組的果皮PAL活性于貯藏0～1 d快速上升，1～2 d快速減小，2～6 d急劇提高，6～7 d快速下降。與接種L.theobromae果實對比可知，ε-PL+接種L.theobromae組的果皮PAL活性在貯藏0～7 d具有較高水平，同時在貯藏3、7 d具有極顯著較高水平（P＜0.01），在貯藏4 d表現為顯著較高水平（P＜0.05）。

圖4 ε-PL對接種L.theobromae西番蓮果實果皮PAL（A）、C4H（B）、4-CL（C）、CAD（D）和POD（E）活性的影響Fig.4 Effect of ε-PL on activities of PAL (A),C4H (B),4-CL (C),CAD (D)and POD (E) in pericarp of L.theobromae-inoculated passion fruits

由圖4B可知，接種L.theobromae組的西番蓮果實果皮C4H活性在貯藏0～4 d加速上升，4～5 d較快降低，隨后快速提高。然而，ε-PL+接種L.theobromae組的果皮C4H活性在貯藏0～5 d變化趨勢與接種L.theobromae組類似，但在貯藏5～7 d卻較快升高。另外，ε-PL+接種L.theobromae組的果皮C4H活性在貯藏0～7 d高于接種L.theobromae組，且于貯藏3～5 d顯著高于接種L.theobromae組（P＜0.05）。

由圖4C可知，接種L.theobromae組的西番蓮果實果皮4-CL活性于貯藏0～4 d快速提高，4～6 d快速下降，隨后加速升高。但是，ε-PL+接種L.theobromae組的果皮4-CL活性在貯藏0～3 d加劇提升，3～5 d快速減小，5～6 d快速升高，6～7 d較快減少。另外，與接種L.theobromae組相比，ε-PL+接種L.theobromae組的果皮4-CL活性始終處于較高水平，且于貯藏2～3、5、7 d達到顯著水平（P＜0.05），在貯藏6 d具有極顯著水平（P＜0.01）。

由圖4D可知，接種L.theobromae組的西番蓮果實果皮CAD活性于貯藏0～2 d加劇上升，2～3 d加速降低，3～4 d快速提高，隨后較快下降。然而，ε-PL+接種L.theobromae組的果皮CAD活性于貯藏0～4 d急劇上升，隨后快速減少。此外，和接種L.theobromae果實對比，ε-PL+接種L.theobromae組在貯藏期維持較高果皮CAD活性，并在貯藏3～7 d具有顯著較高水平（P＜0.05）。

由圖4E可得，接種L.theobromae組的西番蓮果實果皮POD活性在貯藏0～1 d加速升高，1～4 d較快降低，4～5 d快速提高，5～6 d快速下降，6～7 d緩慢上升。但是，ε-PL+接種L.theobromae組的果皮POD活性于貯藏0～4 d加劇提高，4～5 d緩慢下降，之后加速降低。另外，ε-PL+接種L.theobromae組的果皮POD活性在貯藏2～7 d高于接種組，并在貯藏3 d有極顯著水平（P＜0.01），在貯藏4～5、7 d有顯著水平（P＜0.05）。

因此，ε-PL保持L.theobromae接種西番蓮果實較高的果皮PAL、C4H、4-CL、CAD及POD活性。

2.5 果皮PPO活性

PPO可氧化酚類物質，從而產生對病原菌有毒的醌類物質[7,22-23]。由圖5可知，接種L.theobromae組的西番蓮果實果皮PPO活性在貯藏0～4 d加劇提高，4～5 d快速下降，5～6 d緩慢上升，6～7 d加速減少。然而，ε-PL+接種L.theobromae組的果皮PPO活性于貯藏0～3 d急劇上升，3～4 d快速降低，4～5 d快速提高，之后加速減少。此外，和接種組對比，ε-PL+接種L.theobromae組的果皮PPO活性均保持較高水平，同時在貯藏1 d具有顯著水平（P＜0.05），在貯藏3、5 d具有極顯著水平（P＜0.01）。

圖5 ε-PL對接種L.theobromae西番蓮果實果皮PPO活性的影響Fig.5 Effect of ε-PL on PPO activity in pericarp of L.theobromaeinoculated passion fruits

因此，ε-PL能維持接種L.theobromae西番蓮果實較高水平的果皮PPO活性。

2.6 果皮GLU和CHI活性

GLU與CHI也是防御病原菌入侵果實的關鍵酶[24]。從圖6A發現，接種L.theobromae組的西番蓮果實果皮GLU活性于貯藏0～1 d快速降低，1～2 d快速上升，2～3 d快速減小，隨后加速升高。但是，ε-PL+接種L.theobromae組的果皮GLU活性在貯藏0～1 d緩慢上升，1～2 d緩慢降低，2～5 d加劇上升，5～6 d快速減少，6～7 d快速提高。另外，和接種組比較，ε-PL+接種L.theobromae組于貯藏0～1、3～7 d保持較高果皮GLU活性，同時在貯藏3～7 d具有極顯著水平（P＜0.01）。

圖6 ε-PL對接種L.theobromae西番蓮果實果皮GLU（A）和CHI（B）活性的影響Fig.6 Effect of ε-PL on activities of GLU (A) and CHI (B) in pericarp of L.theobromae-inoculated passion fruits

從圖6B發現，接種L.theobromae組的西番蓮果實果皮CHI活性于貯藏0～1 d較快下降，1～5 d較快上升，5～6 d快速減小，6～7 d快速提高。但是，ε-PL+接種L.theobromae組的果皮CHI活性于貯藏0～1 d快速升高，1～3 d緩慢上升，3～5 d加速提升，5～6 d較快減少，隨后急劇增高。另外，與接種組比較，ε-PL+接種L.theobromae組的果皮CHI活性在貯藏期維持較高水平，并在貯藏4～5 d達極顯著水平（P＜0.01），在貯藏6～7 d達顯著水平（P＜0.05）。

因此，ε-PL能保持接種L.theobromae西番蓮果實較高的果皮GLU和CHI活性。

3 討論

細胞膜損傷與病原菌入侵密切相關。較高的細胞膜透性是果實采后細胞膜結構喪失、抗病性下降、病害發生的促進因素[21,25-26]。在本研究中，接種L.theobromae組的西番蓮果實果皮細胞膜透性（圖2）和果實病斑直徑（圖1B）在貯藏期均呈現上升趨勢。基于相關性分析可知，接種果實的病斑直徑（圖1B）與果皮細胞膜透性（圖2）具有極顯著的正相關關系（P＜0.01），相關系數為0.917。由此可推斷，L.theobromae侵染加速西番蓮果實病害發生與細胞膜損傷有關。然而，與接種L.theobromae組相比，ε-PL+接種L.theobromae組在貯藏期具有較低果實病斑直徑（圖1B）、果皮細胞膜透性（圖2）。因此，ε-PL能減輕接種L.theobromae果實果皮細胞膜損傷程度，穩定果實抗病性，從而減緩果實發生病害。這與Chen Yihui等[21]的研究結果一致，即水楊酸減緩龍眼果實發生病害，是由于水楊酸維持較好的果皮細胞膜完整性。

另外，木質素是果實抗病防御系統中的重要成分，當果實受到病原菌侵染時，迅速積累木質素，形成物理屏障，抑制病原菌進一步入侵[7,10,23]。本研究發現，接種L.theobromae組的西番蓮果實果皮木質素質量分數在貯藏0～5 d不斷累積上升，之后卻呈現下降趨勢（圖3），而病斑直徑在貯藏1～7 d不斷升高（圖1B）。這可能是因為在貯藏前期，L.theobromae入侵西番蓮果實后，西番蓮果實的抗病防御機制被激活，將不斷累積木質素等抗病物質，進而提高果實抗病水平而應對病原菌早期入侵；但在L.theobromae侵染后期，由于果實的抗病物質（木質素等）水平下降，誘導果實抗病性喪失，進而引發果實發生病害。因此，L.theobromae侵染加速西番蓮果實采后抗病性喪失、病害發生與其果實果皮木質素質量分數下降有關。進一步對比發現，在貯藏期，ε-PL+接種L.theobromae組具有較高的果皮木質素質量分數（圖3），而具有較小的果實病斑直徑（圖1B）。因此，ε-PL抑制L.theobromae侵染所致西番蓮果實采后病害發生，是由于ε-PL促進果實果皮累積木質素，進而增強果實采后抗病性。這與黃曉杰等[27]的研究結果一致，即茉莉酸甲酯延緩藍莓果實發生病害與果實保持較高木質素水平有關。類似地，Ren Yanfang等[24]研究報道，硝普酸鈉能提高芒果果實木質素含量，進而延緩果實采后炭疽病的發生。

此外，PAL、C4H、4-CL、CAD、POD、PPO、GLU與CHI等抗病酶在果實應對病原菌入侵反應中起著重要作用[7,10,22,24]。其中，PAL、C4H、4-CL、CAD、POD等抗病酶可參與木質素的合成及累積，在抵御病原菌侵染中具有關鍵作用[7,10,22-23]。PPO可催化酚類發生氧化而形成醌，進而抑制病原菌的生長[7,10]。GLU與CHI分別能降解病原菌細胞壁的β-1,3-葡聚糖與幾丁質，從而抑制病原菌的生長[7,28-29]。本研究發現，相比于接種L.theobromae的西番蓮果實，ε-PL維持接種L.theobromae西番蓮果實在貯藏0～7 d具有較高的果皮PAL、C4H、4-CL、CAD活性，在貯藏2～7 d具有較高的果皮POD活性（圖4），這促進了果實累積木質素；ε-PL也保持接種果實在貯藏0～7 d有較高的果皮PPO活性（圖5），這有利于PPO催化酚類而生成醌，進而抑制L.theobromae對果實的侵染；ε-PL還維持接種果實在貯藏1、3～7 d有較高的果皮GLU活性，在貯藏0～7 d有較高的果皮CHI活性（圖6），這有助于破壞L.theobromae細胞壁結構而抑制其生長。因此，ε-PL抑制L.theobromae侵染所致的西番蓮果實采后病害發生，是由于ε-PL提高接種L.theobromae西番蓮果實的果皮PAL、C4H、4-CL、CAD、POD、PPO、GLU及CHI等抗病相關酶的活性，累積果皮木質素等抗病物質，進而提高果實采后抗病性。類似地，Sun Junzheng等[10]研究表明，ε-PL能提升龍眼果實的PAL、CAD、C4H、4-CL與POD等抗病酶的活性，促進木質素的累積，進而增強果實采后抗病能力，延緩龍眼果實采后病害的發生。Liu Yongxiang等[28]研究發現，L-賴氨酸可以提高梨果實的GLU與CHI活性，進而提高果實抗病性而控制采后病害發生。另外，劉曉佳等[30]研究報道，苯并噻二唑可提升柑橘果實的PAL、POD、PPO、CHI和GLU等抗病酶活性，提升果實對病原菌入侵的抗性水平。

4 結論

綜上，100 mg/Lε-PL可有效維持接種L.theobromae西番蓮果實的果皮細胞膜完整性，還能提升接種果實與果皮木質素合成有關的相關酶（PAL、C4H、4-CL、CAD、POD等）活性而促進累積木質素，提高接種果實果皮的PPO、GLU及CHI等酶活性，從而增強果實采后抗病性，抑制L.theobromae侵染所致的果實采后病害發生。因此，ε-PL可作為一種安全的采后處理技術以增強西番蓮果實的抗病能力，進而抑制果實采后發生病害、穩定其采后品質。