采前氨基乙氧基乙烯甘氨酸處理對‘黃冠’梨長期冷藏后果實品質和果心褐變的影響

何近剛，馮云霄，程玉豆，關軍鋒,*

（1.河北省農林科學院生物技術與食品科學研究所，河北 石家莊 050051；2.河北省植物轉基因中心，河北 石家莊 050051）

‘黃冠’梨（Pyrus bretschneideriRehd.cv.Huangguan）是我國主栽的中早熟梨品種之一，因其果形端正、果肉細嫩多汁、品質上乘而深受消費者喜愛，市場上銷售期可達12 個月[1]。黃冠梨成熟期一般在每年的7月底至8月上旬，由于采收時氣溫較高，果實呼吸旺盛，而因市場需求貯藏期較長，因此該品種在低溫冷藏過程中易發生果面褐斑和果心褐變現象，極大降低了其商品價值，造成嚴重經濟損失[1-2]。

乙烯是啟動和加速果實成熟衰老的重要植物激素[3-4]。氨基乙氧基乙烯甘氨酸（aminoethoxyvinylglycine，AVG）為乙烯抑制劑，能夠通過阻斷S-腺苷甲硫氨酸向氨基環丙烷羧酸的轉化過程而減少乙烯的生成[5]。研究證明，采前噴施AVG可延緩果實成熟衰老[6-7]，延長果實的貯藏時間和貨架期。梨采前噴施AVG，可抑制乙烯生成，延長果實貯藏期[8-9]，提高果實品質[10]。采前使用250 mg/L的AVG噴施‘Jersey Mac’蘋果，可有效降低果實采后內源乙烯生成、延緩果實軟化，并且AVG處理蘋果含有更高的可滴定酸含量、總酚含量和抗氧化能力[11]；‘McIntosh’蘋果采前噴施AVG，可顯著降低落果率，推遲呼吸躍變，延長果實采收期[12]；采前AVG處理‘Cripps Pink’蘋果相對于1-甲基環丙烯處理來說，延遲乙烯產生和果實轉色效果更為明顯[13]；采前AVG處理可使‘金冠’蘋果推遲轉色，并降低果實貯藏時酯類和醛類揮發性物質含量[14]。桃[6]、油桃[15]采前噴施AVG均可有效降低落果率，降低乙烯生成速率和延緩果實軟化。李子采前噴施AVG，可有效維持果實硬度，減少果實乙烯生成，維持果實色澤[16-17]。研究發現，AVG采前處理的獼猴桃果實較對照含有更高的總酚含量和抗氧化能力[18]，而AVG采前處理的蘋果[7]和李子在貯藏期總酚含量下降[17]。

果實褐變與組織內酚代謝和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）密切相關[19-21]。綠原酸是梨中的一種初級酚類化合物，被普遍認為是導致PPO催化酶促褐變的關鍵底物[22-23]，苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）是綠原酸生物合成途徑的主要酶[23]。此外，果實褐變還與細胞膜的破裂密切相關，磷脂酶D（phospholipase D，PLD）和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）的活性影響著脂膜的完整與正常功能[24-28]。

然而，近年來關于AVG調節梨果貯藏性能，尤其是對于果實內部組織褐變的影響研究較少，關于AVG調節組織褐變的機制尚不清楚。本研究采用采前AVG噴施處理方法，研究了‘黃冠’梨果實長期貯藏后品質變化，并采用實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技術研究果心褐變相關基因表達規律，以闡明AVG調控‘黃冠’梨果心褐變的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料‘黃冠’梨種植于河北省趙縣梨果示范基地，樹齡20 a生。

AVG（商品名ReTain?）美國Valent生物科學有限責任公司；正己烷（色譜純）美國賽默飛世爾公司；反轉錄試劑盒（PrimescriptTMRT reagent Kit）、TB Green? Premix ExTaqII qPCR試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設備

GY-4型硬度計 浙江托普儀器有限公司；PAL-1型手持數字糖度儀 日本ATAGO公司；HITACHI L-2000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本日立科學儀器有限公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；7500定量PCR儀 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 處理

‘黃冠’梨于采前2 周與1 周分別噴施50、100 mg/L以及200 mg/L的AVG，以噴施清水作為對照，每個處理3 株果樹。果實于2016年8月11日采收并當天運回實驗室，過夜放置散去田間熱。選取8～9 成熟，無機械損傷、無病蟲害、大小一致的AVG和對照果實置于溫度（0±0.5）℃、相對濕度（90±5）%下冷藏180 d后出庫，貨架（20±1）℃貯藏7 d。于采收當天（0 d）、冷藏180 d以及貨架7 d（（180+7）d）測定果實硬度、可溶性固形物質量分數（soluble solid content，SSC）以及可滴定酸（titratable acid，TA）質量分數，統計果皮褐斑及果心褐變情況后，取果心于液氮中速凍、并在液氮中研磨為粉末后放置于-80 ℃，以備后續分析。

1.3.2 果實硬度、SSC以及TA質量分數測定

硬度采用GY-4型硬度計，沿果實赤道部位相對兩點測定果實去皮硬度，單位為kg/cm2；SSC使用PAL-1型手持數字糖度儀測定，單位為%；采用酸堿滴定法測定TA質量分數，以蘋果酸計，單位為%。

1.3.3 果皮褐斑指數及果心褐變指數統計

按照果皮褐斑面積占果面總面積比率分為4 級：0級，無褐斑；1級，0%＜褐斑面積≤25%；2級，25%＜褐斑面積≤50%；3級，褐斑面積＞50%。果皮褐斑指數按公式（1）計算[2]：

按照褐變面積占果心總面積比率分為4級：0級，無褐變；1級，0%＜褐變面積≤25%；2級，25%＜褐變面積≤50%；3級，褐變面積＞50%。果心褐變指數按公式（2）計算[20]：

1.3.4 綠原酸、熊果苷及總酚含量的測定

綠原酸和熊果苷含量采用HPLC法測定[29]。稱取果心1.0 g，加入6 mL 80%甲醇，20 ℃超聲提取15 min，10000×g、20 ℃離心10 min，取上清液過固相C18萃取小柱，以甲醇淋洗，經直徑為0.45 μm的濾膜過濾后，進行HPLC檢測，單位為mg/g（以鮮質量計）。HPLC條件：HITACHI L-2000 HPLC儀自帶的反相Lachrom C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，洗脫程序為A相5%冰醋酸水溶液、B相為水、C相為乙腈（0～6 min，A∶B∶C＝19∶76∶5（V/V，下同）；7～19 min，A∶B∶C＝95∶0∶5；20～24 min，A∶B∶C＝85∶0∶15；25 min，A∶B∶C＝55∶0∶45；26～30 min，A∶B∶C＝15∶0∶85；31 min，A∶B∶C＝15∶0∶85；32 min，A∶B∶C＝19∶76∶5），流速為1.0 mL/min，進樣體積為10 μL。

采用福林-酚法測定總酚含量[30]。稱取0.3 g果心，加入體積分數為50%乙醇溶液5 mL，室溫下超聲30 min，4 ℃、10000×g離心10 min，得上清液。取1 mL樣液加入3.5 mL蒸餾水，加入0.5 mol/L福林-酚試劑0.5 mL，加入70% Na2CO3溶液 1 mL，混勻，30 ℃避光水浴2 h，760 nm處測定吸光度。根據沒食子酸標準曲線計算總酚含量，結果以每克樣品中沒食子酸含量表示（mg/g，以鮮質量計）。

1.3.5 PPO活力的測定

PPO活力測定參考Cheng Yudou等[30]方法。稱取果心凍樣1 g，加入3 mL的0.1 mol/L（pH 7.0）磷酸緩沖液（含6%聚乙烯吡咯烷酮），4 ℃、12000×g離心15 min，取上清液用于測定PPO活力。將200 μL酶提取液加入到25 ℃預熱反應液中（含25 mmol/L鄰苯二酚的磷酸鹽緩沖液，pH 6.0），使終體積為4 mL。在420 nm波長下測定OD變化值，以每分鐘吸光度增加0.01時為1 個PPO活力單位（U），單位為U/kg（以鮮質量計）。

1.3.6 RNA提取與基因表達分析

采用改良CTAB法[31]提取果心總RNA。總RNA經DNase清除DNA后，用PrimescriptTMRT reagent Kit進行反轉錄。real-time PCR使用TB Green? Premix ExTaqII qPCR試劑盒。以PbActin2為內參基因[20]，其余基因參照GenBank上登記序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計基因引物，所有引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。通過2-ΔΔCt法計算出待測基因相對表達量。

表1 real-time PCR特異性引物序列Table 1 Specific primer sequences used for real-time PCR

1.4 數據處理與分析

每個實驗處理設3 個重復，測定時每個重復5 個果實。數據采用Excel 2007和SPSS 18.0數據處理軟件進行統計和相關性分析，結果用3 次重復的平均值表示，方差分析采用Duncan法。使用GraphPad Prism 9軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度AVG處理對黃冠梨冷藏和貨架品質及果實褐變的影響

如圖1A所示，采前噴施不同質量濃度AVG對果實采收硬度無顯著影響；冷藏180 d后，各處理果實硬度較采收時顯著下降，其中200 mg/L AVG處理果實硬度最大，為5.98 kg/cm2，50 mg/L和100 mg/L處理果實硬度與對照果實無明顯差別；經過貨架7 d（（180+7）d），果實硬度有所下降，不同質量濃度AVG處理果實硬度無明顯差別，其中100 mg/L和200 mg/L AVG處理果實硬度顯著高于對照果實，說明質量濃度為200 mg/L的AVG維持‘黃冠’梨果實冷藏和貨架硬度效果最好。

圖1 采前AVG處理對‘黃冠’梨果實冷藏和貨架期硬度（A）、SSC（B）以及TA含量（C）的影響Fig.1 Effect of preharvest AVG treatment on firmness (A),SSC (B) and TA content (C) of ‘Huangguan’ pear during cold storage and shelf-life periods

經180 d貯藏，‘黃冠’梨果實采后SSC呈升高趨勢（圖1B）。采收時，200 mg/L AVG處理果實SSC最高，而50 mg/L和100 mg/L AVG處理果實與對照SSC無明顯差別；冷藏180 d，200 mg/L AVG處理果實SSC顯著高于50 mg/L和100 mg/L AVG處理和對照；（180+7）d時，200 mg/L以及100 mg/L AVG處理與對照果實SSC無明顯差別，而50 mg/LAVG處理果實SSC最低。

在整個貯藏期間，‘黃冠’梨果實TA含量降低（圖1C）。采收時，50 mg/L AVG處理果實TA含量最高，200 mg/L AVG處理和對照果實無明顯差別，100 mg/L AVG處理果實TA含量最低；冷藏180 d時，100 mg/L和200 mg/L AVG處理果實TA含量顯著高于對照和50 mg/L AVG處理果實；（180+7）d，200 mg/L AVG果實TA含量最高，而50 mg/L和100 mg/L AVG與對照無明顯差別。

采前噴施不同質量濃度AVG可有效抑制‘黃冠’梨貯藏期果皮褐斑及果心褐變的發生（圖2）。冷藏180 d時，對照果皮褐斑指數最高，不同質量濃度AVG處理果皮褐斑指數均低于對照果實，其中200 mg/L AVG處理的果實褐斑指數最低（圖2A）。‘黃冠’梨冷藏180 d時果心發生褐變，不同質量濃度AVG處理果實褐變指數在冷藏180 d和貨架期間（（180+7）d）顯著低于對照果實，其中200 mg/L AVG處理下果心褐變指數最低（圖2B）。

圖2 采前AVG處理對‘黃冠’梨冷藏和貨架期果皮褐斑指數（A）和果心褐變指數（B）的影響Fig.2 Effect of preharvest AVG treatment on peel browning index (A)and core browning index (B) of ‘Huangguan’ pear during cold storage and shelf-life periods

2.2 AVG處理對‘黃冠’梨果心酚類物質含量及PAL基因表達的影響

‘黃冠’梨果心中含量較高的2 種單酚物質為熊果苷和綠原酸，這兩種酚類物質以及總酚在貯藏期含量均升高（圖3）。AVG處理對采收時（0 d）和冷藏180 d果心熊果苷和總酚含量無顯著影響，（180+7）d時200 mg/L AVG處理果心熊果苷和總酚含量顯著高于對照（圖3A、C）。然而，從采收時（0 d）到貯藏期（180 d、（180+7）d），200 mg/L AVG處理的果心綠原酸含量均顯著高于對照果實（圖3B），說明AVG處理對于‘黃冠’梨果心綠原酸含量的影響更為明顯。這也說明采前AVG處理對采后生物體內次生代謝物質的合成與降解起到了一定的調控作用。

圖3 采前AVG處理對‘黃冠’梨冷藏和貨架期果心熊果苷（A）、綠原酸（B）和總酚（C）含量的影響Fig.3 Effect of preharvest AVG treatment on contents of arbutin (A),cholorogenic acid (B) and total phenolics (C) in ‘Huangguan’ pear core during cold storage and shelf-life periods

PbPAL1在整個貯藏期間表達量升高（圖4A），（180+7）d時該基因表達量達到峰值，而采前AVG處理顯著抑制了PbPAL1在‘黃冠’梨果心中的表達。在冷藏180 d時，PbPAL2達到表達峰值（圖4B），200 mg/L AVG處理果心中該基因表達量顯著低于對照果實；采收時（0 d）和貨架期（（180+7）d）時，AVG處理果實PbPAL2相對表達量與對照無明顯差別。

圖4 采前AVG處理對‘黃冠’梨冷藏和貨架期果心PbPAL1（A）和PbPAL2（B）相對表達量的影響Fig.4 Effect of preharvest AVG treatment on the relative expression levels of PbPAL1 (A) and PbPAL2 (B) in ‘Huangguan’ pear core during cold storage and shelf-life periods

2.3 AVG處理對‘黃冠’梨果心PPO活性及基因表達的影響

與采收時（0 d）相比，‘黃冠’梨冷藏180 d時果心PPO活性變化不大，而貨架期PPO活性顯著升高（圖5）。與對照相比，AVG處理顯著降低了‘黃冠’梨果心PPO活性。

圖5 采前AVG處理對‘黃冠’梨冷藏和貨架期果心PPO活性的影響Fig.5 Effect of preharvest AVG treatment on PPO activity of‘Huangguan’ pear core during cold storage and shelf-life periods

兩個PbPPO基因在‘黃冠’梨冷藏期間（180 d）表達量明顯升高，而貨架期（（180+7）d）表達量降低，采前AVG處理對于這兩個基因采收時表達量無明顯影響不大，但可有效抑制它們在貯藏期的表達（圖6）。

圖6 采前AVG處理對‘黃冠’梨冷藏和貨架期果心PbPPO1（A）和PbPPO5（B）相對表達量的影響Fig.6 Effect of preharvest AVG treatment on relative expression levels of PbPPO1 (A) and PbPPO5 (B) in ‘Huangguan’ pear core during cold storage and shelf-life periods

2.4 AVG處理對‘黃冠’梨果心LOX和PLD基因表達的影響

180 d時，‘黃冠’梨果心中PbLOX1和PbLOX5表達量達到峰值，貨架期表達量隨之下降（圖7）。采前AVG處理對PbLOX1的表達無明顯影響，但可有效抑制PbLOX5在180 d和（180+7）d時的表達。PbPLD4在貯藏期表達量降低，AVG處理顯著抑制了采收時（0 d）和冷藏期（180 d）‘黃冠’梨果心PbPLD4的表達，但對貨架期（（180+7）d）該基因的表達無明顯作用（圖8）。

圖7 采前AVG處理對‘黃冠’梨冷藏和貨架期果心PbLOX1（A）和PbLOX5（B）相對表達量的影響Fig.7 Effect of preharvest AVG treatment on relative expression levels of PbLOX1 (A) and PbLOX5 (B) in ‘Huangguan’ pear core during cold storage and shelf-life periods

圖8 采前AVG處理對‘黃冠’梨冷藏和貨架期果心PbPLD4相對表達量的影響Fig.8 Effect of preharvest AVG treatment on relative expression level of PbPLD4 in ‘Huangguan’ pear core during cold storage and shelf-life periods

2.5 ‘黃冠’梨果心褐變指數與酚類物質以及相關基因表達量相關性分析

相關性分析結果顯示（表2），‘黃冠’梨果心褐變指數與綠原酸含量顯著正相關（r＝0.475）、與熊果苷（r＝0.650）以及總酚（r＝0.714）含量極顯著正相關；與PPO活性顯著正相關（r＝0.502），與PbPAL1（r＝0.775）、PbPAL2（r＝0.786）、PbPPO1（r＝0.827）、PbPPO5（r＝0.806）、PbLOX1（r＝0.655）和PbLOX5（r＝0.813）表達量極顯著正相關；與PbPLD4（r＝-0.590）表達量極顯著負相關。

表2 ‘黃冠’梨果心褐變指數與酚類物質以及相關基因表達量的相關系數Table 2 Correlation coefficients of core browning index with phenol contents and related gene expression

3 討論

乙烯在促進果實的成熟、形成特有的色澤和風味具有重要的作用，但同時又引起果實衰老和品質劣變[3-4]。AVG作為一種乙烯生成抑制劑，采前處理果實不僅可以減少落果、延長采收期，還可維持果實貯藏期品質[6-18]。本實驗通過在‘黃冠’梨采前噴施不同濃度AVG，延緩了‘黃冠’梨在長期貯藏后硬度的下降、保持了較高的SSC以及TA含量，并可有效抑制果皮褐斑和果心褐變的發生（圖2），其中以200 mg/L AVG處理效果最為明顯。說明采前噴施AVG對于維持‘黃冠’梨貯藏品質、延緩果實衰老具有良好作用。

研究認為，果實組織酶促褐變的原因之一是細胞的膜系統受到損傷，細胞區隔化被打破，細胞中的酚類物質被PPO氧化為褐色的醌類物質[32-34]。梨果實中綠原酸被認為是PPO酶促褐變的底物之一[19,32]，而‘黃冠’梨果心中含量最高的兩種酚類物質為熊果苷和綠原酸[35]。本研究中，200 mg/L AVG處理的‘黃冠’梨果心熊果苷和總酚含量在貨架期（（180+7）d）顯著高于對照果實（圖3A、C）；200 mg/L AVG處理下果心綠原酸含量在整個貯藏期都顯著高于對照果實（圖3B）。說明酚類物質在‘黃冠’梨果心褐變時作為底物被消耗，而AVG處理在一定程度上減少了酚類物質被氧化。PAL是苯丙氨酸途徑的限速酶，也是催化苯丙烷類代謝途徑第一步反應的酶[36-37]。本研究中發現PbPAL1、PbPAL2基因相對表達量與果心褐變指數極顯著相關（表2），這與Cheng Yudou[20]以及韓艷文[38]等在鴨梨果心褐變中的研究結果一致。

PPO廣泛存在于生物體內，能夠催化酚類物質氧化形成醌，醌再進一步聚合成黑色素[19]。PPO活性的升高以及PPO基因表達的上調與梨果心褐變密切相關[20-21,30]。在本研究中，AVG顯著降低了PPO活性（圖5）以及PbPPO1與PbPPO5的轉錄水平（圖6）。特別是PbPPO1和PbPPO5表達量的變化與果心褐變的發生同步（圖2B、圖6），表明這兩個基因可能在‘黃冠’梨果心褐變的引發中起著相對重要的作用。此外，AVG處理果實熊果苷、綠原酸以及總酚含量僅在（180+7）d時均顯著高于對照果心（圖3）；而果心褐變更加嚴重的對照果實PPO活性在整個貯藏期間均高于AVG處理果實（圖5）。這一結果可能與酚類物質的生物合成和氧化過程的整體效應有關，進一步表明在梨果心褐變過程中PPO可能具有更為重要的作用。

LOX和PLD是兩種與細胞膜損傷有關的重要酶，可通過氧化游離的二烯和三烯脂肪酸，導致活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生[24-28]。ROS啟動脂質分解以及果實衰老和褐變過程[39-41]。有研究發現，AVG可以通過抑制PLD活性進而減少細胞編程性凋亡[42]。在蘋果[43]和桃[44]中發現采前AVG處理可抑制LOX活性。但AVG對于細胞膜損傷在基因水平的調控鮮有報道。在本研究中，采前AVG處理下調了PbLOX5和PbPLD4的表達（圖7B、圖8），說明AVG處理可以避免膜功能的喪失，并有可能保護膜脂免受氧化損傷。PbLOX5在‘黃冠’梨冷藏時表達量顯著升高，與果心褐變變化趨勢一致；而PbPLD4在貯藏期表達量下降，說明了PbLOX5是‘黃冠’梨果心褐變過程中與膜損傷相關的關鍵基因。

總之，采前噴施AVG可維持‘黃冠’梨長期貯藏品質，有效抑制果面褐斑和果心褐變的發生，其中以200 mg/L AVG效果最好。‘黃冠’梨果實在長期貯藏時果心發生褐變，同時熊果苷、綠原酸以及總酚含量增加，PPO活性升高；PbPAL1、PbPAL2、PbPPO1、PbPPO5、PbLOX1以及PbLOX5在冷藏期間表達量升高，貨架期表達量隨之下降，AVG可顯著抑制PbPAL1、PbPAL2、PbPPO1、PbPPO5以及PbLOX5的表達。