改良QuEChERS技術結合超高效液相色譜-串聯質譜法測定水產品中撲草凈及其代謝物殘留

彭 婕，穆迎春，喻亞麗，陳建武，劉 婷，何 力,3,*，甘金華,3,*

（1.中國水產科學研究院長江水產研究所，農業農村部淡水魚類種質監督檢驗測試中心，農業農村部水產品質量安全風險評估實驗室（武漢），湖北 武漢 430223；2.中國水產科學研究院，北京 100141；3.農業農村部水產品質量安全控制重點實驗室，北京 100141）

撲草凈是一種選擇內吸傳導型均三氮苯類除草劑，在中國農業生產和水產養殖中應用廣泛[1]，它具有類似苯環的結構，化學性質比較穩定，是一種持久性有機污染物[2]。20世紀70年代，撲草凈開始被用于池塘水產養殖中清除雜草和青苔[3]，后續又用于去除蝦類、海參、貝類等養殖中的大型藻類[4]。種植業和漁業使用的撲草凈大部分隨著地表徑流和雨水沖刷等途徑進入水體環境[5]，它在水中有較高的溶解度，難以降解，經過自然界的水循環作用被帶入江河湖海，從而導致國內外不同水域中均能檢測到撲草凈殘留[6-10]。撲草凈通過水體環境在生物體內富集，沿食物鏈傳遞，危害人類健康[11]，它會引起生物機體的內分泌紊亂、腫瘤產生等不良危害[12-13]，因此，美國和歐盟等已將其列入內分泌干擾物名單[14]，中國也于2010年在中華人民共和國農業部公告第1435號中將其列入《獸藥試行標準廢止目錄》[15]。近年來我國水產品中多次檢出撲草凈殘留[16-17]，甚至突發使用撲草凈清除蝦池中的青苔，導致克氏原螯蝦全部死亡的事故，2021年撲草凈被正式納入“國家產地水產品獸藥殘留監控計劃”主要檢測指標，可見水產品中撲草凈殘留問題已引起廣泛的關注和重視。撲草凈在動物體內經降解代謝轉化途徑產生了結構多樣的代謝中間產物[18]，其中主要包含通過N-脫烷基化反應形成的化合物去異丙基撲草凈（desisopropyl prometryn，DIP）和雙去異丙基撲草凈（dideisopropyl prometryn，DDIP），硫氧化形成的化合物撲草凈亞砜，以及羥基取代甲硫基形成的化合物2-羥基-撲滅津等[19]。目前諸多研究都只針對水產品中撲草凈殘留分析，缺乏有效的水產品中撲草凈及其代謝產物殘留測定方法，無法準確評估水產品中撲草凈殘留風險，因此有必要開發水產品中撲草凈及其主要代謝產物DIP、DDIP、撲草凈亞砜和2-羥基-撲滅津快速準確的分析方法，進一步提高水產品質量安全監測水平。

由于水產品基質具有組分復雜、干擾物質多以及目標物含量低等特點，因此，準確評估水產品中撲草凈及其代謝物的殘留水平需要優良的前處理方法和精準的分析技術。目前報道的撲草凈殘留測定方法主要有氣相色譜法[1]、氣相色譜-質譜聯用法[20-21]、氣相色譜-串聯質譜法[22]和液相色譜-串聯質譜法[23-24]。對比4 類分析方法，氣相色譜法靈敏度不高，準確定性能力較弱；氣相色譜-質譜聯用法和氣相色譜-串聯質譜法在精準定性能力方面有所提升，但檢測靈敏度仍不具備顯著優勢；液相色譜-串聯質譜法由于其靈敏度高、選擇性好，成為分析復雜基質中撲草凈殘留的首選方法。當前，水產品中撲草凈殘留分析多采用固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）凈化[25-27]，此類方法往往需先活化SPE柱，再上樣、淋洗、洗脫，不僅過程耗時，還需消耗大量溶劑，既不經濟也不環保。近年來，QuEChERS（quick,easy,cheap,effective,rugged and safe）作為一種快速、簡單、廉價、高效、安全的前處理技術，在動物性食品農獸藥殘留檢測中應用較為廣泛[28-30]。

本研究經實驗優化，采用增強型脂質去除吸附劑（enhanced matrix removal of lipids，EMR-Lipid）與Cleanert LipoNo混合物作為凈化吸附劑，基于改良的QuEChERS技術結合超高效液相色譜-串聯質譜分析、同位素內標定量，建立了一種同時測定水產品中撲草凈及其代謝物殘留的分析方法。該方法操作簡便、定量結果準確、靈敏度高，具有良好的準確度和精密度，以期為水產品中新型持久性有機污染物殘留來源和質量安全評價提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚、克氏原螯蝦、中華絨螯蟹樣品來源于本地農貿市場。

撲草凈標準品（CAS 號7287-19-6、分子式C10H19N5S，純度≥99%）、DDIP標準品（CAS號5397-01-3、分子式C4H7N5S，純度為99.7%）、2-羥基-撲滅津標準品（CAS號7374-53-0、分子式C9H17N5O，純度為99.9%）天津阿爾塔科技有限公司；DIP標準品（CAS號4147-57-3、分子式C7H13N5S，純度≥99%）美國TLC公司；撲草凈亞砜標準品（CAS號55702-48-2、分子式C10H19N5OS，純度≥99%）美國Panphy公司；撲草凈-D6標準品（CAS號1705649-52-0、分子式C10H13D6N5S，純度≥98%）美國Dr.Ehrenstorfer公司；撲草凈原藥（純度＞97%）浙江中山化工集團有限公司。

乙腈、乙酸乙酯（均為色譜純）美國J.T.Baker公司；甲醇、乙腈（均為質譜級）德國Meker公司；甲酸（質譜級）美國Fisher公司；氯化鈉、無水硫酸鎂（均為分析純）上海國藥集團化學試劑有限公司；EMR-Lipid 安捷倫科技（中國）有限公司；Cleanert LipoNo 天津博納艾杰爾科技有限公司；實驗用水為Milli-Q高純水。

1.2 儀器與設備

Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀、TSQ Quantiva 三重四極桿質譜儀（配有電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI））美國Thermo Fisher Scientific公司；VORTEX 2渦旋混勻儀 德國IKA公司；R-300型旋轉蒸發儀 瑞士Büchi公司；Avanti JXN-26高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

撲草凈、DIP、DDIP、撲草凈亞砜、2-羥基-撲滅津標準儲備液（100 μg/mL）：分別準確稱取撲草凈、DIP、DDIP、撲草凈亞砜、2-羥基-撲滅津標準品各5.00 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加入適量甲醇充分溶解后，用甲醇定容至刻度線，超聲混勻備用。

撲草凈-D6標準儲備液（100 μg/mL）：準確稱取撲草凈-D6標準品5.00 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加入適量甲醇充分溶解后，用甲醇定容至刻度線，超聲混勻備用。

撲草凈及其代謝混合標準中間液（1 μg/mL）：分別準確移取1 mL撲草凈、DIP、DDIP、撲草凈亞砜、2-羥基-撲滅津標準儲備液，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，超聲混勻備用。

撲草凈-D6標準中間液（10 μg/mL）：移取5 mL撲草凈-D6標準儲備液，置于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，超聲混勻備用。

撲草凈-D6標準工作液（100 ng/mL）：移取1 mL撲草凈-D6標準中間液，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，超聲混勻備用。

1.3.2 標準曲線的制作

用20%乙腈-甲酸溶液配制系列質量濃度的混合標準溶液，每份混合標準溶液均含有撲草凈、DIP、DDIP、撲草凈亞砜、2-羥基-撲滅津混合外標和內標物撲草凈-D6。每份混合標準溶液中內標質量濃度均為20 ng/mL，外標系列質量濃度分別為1.0、5.0、10、50、200、500 ng/mL。

1.3.3 前處理方法

1.3.3.1 樣品制備

草魚去鱗，帶皮沿背脊取肌肉部分；克氏原螯蝦去頭、殼、腸腺，取肌肉部分；試樣切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm小塊后均質、混勻。中華絨螯蟹去殼、鰓后，將所有可食部分全部取出并絞碎混勻。所有待測樣品密封標記后置于-20 ℃冷凍保存，備用。

1.3.3.2 樣品前處理

稱取2 g（精確至0.01 g）均質的肉糜樣品，置于50 mL離心管中，加入200 μL撲草凈-D6標準工作液（100 ng/mL），混勻后靜置10 min，加入10 mL乙腈和3 顆玻璃珠均質子渦旋混勻30 s，隨后依次加入2 g氯化鈉和1 g無水硫酸鎂，渦旋混合2 min后超聲提取5 min，5000 r/min離心5 min，取上清液至雞心瓶中，殘渣按上述方法重復提取1 次，合并提取液，40 ℃減壓蒸干。

向雞心瓶中加入2 mL 20%甲醇溶液，渦旋混合至瓶內殘留物全部溶解，將上述復溶液置于10 mL離心管中，加入0.20 g EMR-Lipid與0.05 g Cleanert LipoNo混合凈化劑，渦旋振蕩1 min，10000 r/min冷凍離心10 min，取1 mL上清液經0.22 μm聚砜醚濾膜過濾后，待測。

1.3.4 液相色譜條件

Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸溶液；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL；梯度洗脫條件：0～1.0 min，20% A、80% B；1.0～6.0 min，20%～80% A、80%～20% B；6.0～8.0 min，80% A、20% B；8.0～8.1 min，80%～20% A、20%～80% B；8.1～10.0 min，20% A、80% B。

1.3.5 質譜條件

加熱大氣壓ESI；正離子模式掃描；掃描模式為選擇反應監測模式；噴霧電壓為3500 V；蒸發溫度為350 ℃；離子傳輸毛細管溫度為330 ℃；鞘氣和輔助氣均為氮氣，流速分別為40 L/min和10 L/min；碰撞氣（氬氣，純度≥99.999%）；碰撞氣壓力2.0 mTorr。撲草凈及其代謝物的質譜檢測參數如表1所示。

表1 撲草凈及其代謝物質譜檢測參數Table 1 Mass spectrometric parameters for prometryn and its metabolites

1.3.6 基質效應（matrix effect，ME）評估

水產品中含量較高的蛋白質、磷脂等內源性物質會因與待測物離子競爭液-液表面，從而產生基質抑制或基質增強效應，有關研究表明基質種類、基質質量和待測物質量濃度對ME均有一定影響[31]，因此為評估建立方法的準確度，應考慮ME對檢測結果的影響，本研究采用提取凈化后添加標樣法，按照下式計算ME：

基質匹配標準曲線制備：取均質的陰性草魚、克氏原螯蝦和中華絨螯蟹肌肉組織樣品，不加內標物撲草凈-D6，其余步驟按照1.3.3.2節進行樣品前處理，制備得到不同水產品空白基質溶液。用不同水產品空白基質溶液配制系列質量濃度標準工作液，其中內標物撲草凈-D6質量濃度為20 ng/mL，撲草凈及其代謝物混合外標質量濃度依次為1.0、5.0、10、50、200、500 ng/mL，以此建立基質匹配標準曲線。

1.3.7 克氏原螯蝦肌肉中撲草凈及其代謝物殘留測定

選取體質量為（26.94±6.78）g的鮮活克氏原螯蝦，按9.6 μg/mL的質量濃度藥浴撲草凈溶液，藥浴36 h后換干凈爆氣水繼續暫養，每個實驗箱每只克氏原螯蝦用隔板隔開。給藥后在0.5、1、2、4、6、8、12、18、24、48、72、96、120、144 h和168 h采集克氏原螯蝦肌肉組織。克氏原螯蝦肌肉組織均質后于-18 ℃冷凍保存，待分析。分析前將克氏原螯蝦肌肉樣品解凍，前處理步驟及儀器分析方法同1.3.3～1.3.5節。

1.4 數據處理

采用Trace Finder 3.2數據處理系統（美國Thermo Fisher Scientific公司）對樣品中的撲草凈及其代謝物進行超高效液相色譜-串聯質譜分析、數據采集和處理，采用Origin 2023進行統計計算和圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

撲草凈及其代謝物均為含氨基的三嗪類化合物，質譜分析時宜選擇ESI正離子模式測定，在流動相中加入一定量的甲酸，不僅能夠提高目標物的離子化效率，還能改善色譜峰峰形，提高色譜峰的分離度。取質量濃度為1 μg/mL的撲草凈及其代謝物混合標準溶液，用蠕動泵將其隨流動相一同注入質譜儀中，在ESI+模式下進行母離子全掃描，手動調試質譜參數（噴霧電壓、蒸發溫度、離子傳輸毛細管溫度、鞘氣和輔助氣流速等）使目標物的質譜強度和穩定性達到最佳狀態，然后儀器自動對目標物進行質譜條件優化。優化后的相關參數見表1。

2.2 色譜條件優化

本研究對比Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）和Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）對撲草凈及其代謝物的分離效果，結果顯示，粒徑更小的色譜柱在峰形、分辨率、保留時間等方面表現更佳。流動相的組成直接影響分析物的分離效果和檢測靈敏度[32]，甲醇和乙腈是農獸藥殘留分析時常用的流動相[33-34]，本研究考察了水相為0.1%甲酸溶液，有機相分別選用甲醇和乙腈時目標物的分離效果和質譜響應強度。如圖1所示，采用甲醇時，代謝物2-羥基-撲滅津與DIP無法徹底分離，撲草凈亞砜和撲草凈色譜峰不僅重疊在一起，而且出峰時間位于高有機相沖洗色譜柱階段，極易受到樣品中強極性雜質干擾；采用乙腈時，雖然撲草凈及其代謝物質譜強度稍有降低，但所有分析物的保留時間均提前至線性梯度洗脫階段，并且5 個目標物的色譜峰分離度顯著提升，因此選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相。

圖1 撲草凈及其代謝物總離子流圖（50 ng/mL）Fig.1 Total ion current chromatograms of prometryn and its metabolites (50 ng/mL)

2.3 前處理方法優化

2.3.1 提取溶劑優化結果

以撲草凈及其代謝物均未檢出的陰性草魚為基質，添加質量濃度為10 ng/mL的撲草凈及其代謝物混標溶液，分別以甲醇、乙酸乙酯、乙腈和1%甲酸-乙腈溶液作為提取溶劑，參照1.3.3.2節進行前處理，考察不同提取溶劑對5 種目標物的萃取回收率。圖2表明，當選擇甲醇作為提取溶劑時，代謝物DIP和撲草凈亞砜加標回收率超過120%，而代謝物DDIP和2-羥基-撲滅津回收率僅為60%～70%，由于甲醇與水互溶導致樣品濃縮時不容易蒸干，從而影響實驗結果的準確性；當選擇乙酸乙酯提取目標物時，加標回收率可達90%～130%之間，但平行樣測定結果偏差較大，結果的穩定性和重復性較差，同時乙酸乙酯容易溶解水產品中的大量脂肪，提取液顏色深且后續凈化復雜；使用1%甲酸-乙腈提取時，撲草凈亞砜回收率低于20%，說明撲草凈亞砜在酸性環境中的萃取效率較低，從而導致加標回收率偏低；采用乙腈作為提取溶劑時，5 種目標物加標回收率達75%～105%，乙腈具有沉淀蛋白等作用，提取液顏色較淺且各目標物回收率均滿足分析要求，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑對撲草凈及其代謝物回收率的影響（n＝3）Fig.2 Effects of different extraction solvents on the recoveries of prometryn and its metabolites (n=3)

2.3.2 凈化試劑優化結果

采用超高效液相色譜-串聯質譜分析水產品藥物殘留時，與水產品共萃出的脂肪、蛋白質等雜質會影響目標物的電離能力，造成目標物信號強度的改變，因此在前處理中應盡量提高凈化效果，去除雜質，避免干擾檢測，污染或損害檢測儀器。本研究對比凈化劑Cleanert LipoNo、EMR-Lipid、Cleanert LipoNo與EMRLipid混合物對撲草凈及其代謝物的凈化效果，圖3表明，3 組試劑凈化時撲草凈及其代謝物的加標回收率均可達80%～120%，Cleanert LipoNo作為一種新型除脂材料，其填料表面修飾了許多長的碳鏈，可針對性地吸附脂肪，使用該凈化試劑時僅需混合后靜置分層，無需離心，操作方便，但DIP、DDIP和撲草凈亞砜回收率高于117%，基質增強效應顯著。EMR-Lipid結合了體積排阻和疏水作用，可選擇性去除樣品中的主要脂類和大分子雜質，選用該試劑凈化時，除撲草凈亞砜加標回收率高于120%之外，其余目標物回收率均小于110%，其測量準確性能夠滿足檢測需求，但平行樣間的相對標準偏差（relation standard deviation，RSD）大于11%，結果的重復性較差。將兩種凈化試劑組合用于樣品凈化時，5 種目標物加標回收率為85%～106%，平行樣間的RSD小于6%，說明其去除基質干擾的能力最佳。因此，選用Cleanert LipoNo與EMR-Lipid混合物作為樣品前處理的凈化試劑。

圖3 不同凈化試劑對撲草凈及其代謝物回收率的影響（n＝3）Fig.3 Effects of different cleanup sorbents on the recoveries of prometryn and its metabolites (n=3)

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍與靈敏度

按照1.3.2節配制標準系列工作液，以標準系列工作液中撲草凈及其代謝物的質量濃度為橫坐標，系列質量濃度下撲草凈及其代謝物的定量子離子峰面積與內標物撲草凈-D6子離子峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，撲草凈及其代謝物在1.0～500 ng/mL范圍內線性關系良好，確定系數R2均大于0.992。在空白樣品中加入系列低質量濃度撲草凈及其代謝物混合標準溶液，以目標峰不小于3 倍信噪比（RSN≥3）確定方法的檢出限（limits of detection，LOD），以不小于10 倍信噪比（RSN≥10）確定方法的定量限（limits of quantification，LOQ），得出水產品基質中撲草凈及其代謝物的LOD為0.20 μg/kg，LOQ為0.50 μg/kg，方法靈敏度較高，結果見表2。

表2 撲草凈及其代謝物線性范圍、線性方程、確定系數、LOD和LOQTable 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients,LODs and LOQs of prometryn and its metabolites

2.4.2 回收率與精密度結果

取陰性草魚、克氏原螯蝦和中華絨螯蟹肌肉組織樣品，依據GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》附錄F[35]的技術要求，選取LOQ、中間濃度、常見限量值3 個水平進行加標回收實驗，撲草凈及其代謝物3 個添加量分別為0.5、10、50 μg/kg，每個添加量進行6 次平行實驗，計算方法的加標回收率和RSD。如表3所示，草魚、克氏原螯蝦、中華絨螯蟹等不同水產品基質中撲草凈及其代謝物的加標回收率為74.4%～113.7%，RSD為3.17%～11.47%，均有良好的準確度與精密度，符合農藥殘留分析的要求。

表3 不同水產品中撲草凈及其代謝物回收率和RSD（n＝6）Table 3 Recoveries and RSD of prometryn and its metabolites in different aquatic samples (n=6)

2.4.3 ME評估結果

采用基質標準曲線斜率與溶劑標準曲線斜率的比值，評價ME的影響。標準曲線法優于單點或者多點單獨評價ME，更具有統計意義和代表性。當ME＜0.85時，存在基質抑制效應；當ME為0.85～1.15時，ME不明顯；當ME＞1.15時，存在基質增強效應[36]。不同基質中撲草凈及其代謝物ME結果如表4所示，結果顯示，通過內標法進行校正后，5 種撲草凈及其代謝物在不同水產品中的ME不明顯，ME均位于0.85～1.15之間，這一結果證實了內標法可以消除ME造成的定量結果偏差，提高檢測方法的穩定性和精準性。因此本研究采用溶劑標準曲線內標法定量分析5 種撲草凈及其代謝物含量。

表4 不同水產品中撲草凈及其代謝物的METable 4 Matrix effects of prometryn and its metabolites in different aquatic samples

2.5 克氏原螯蝦肌肉中撲草凈及其代謝物殘留分析

應用建立的方法分析藥浴撲草凈后的克氏原螯蝦陽性樣品，以此評價方法的適用性?？耸显r樣品按照1.3.7節處理后，將檢出目標物與標準品進行對比確認，結果顯示藥浴撲草凈后的克氏原螯蝦肌肉樣品中主要檢測出3 種目標物殘留，其中包括撲草凈及其代謝物DIP和撲草凈亞砜（圖4），對殘留物質進行精準定性后，再利用建立方法準確評估撲草凈及其代謝產物DIP和撲草凈亞砜在克氏原螯蝦肌肉組織中的殘留水平?？耸显r肌肉組織中撲草凈及其代謝產物藥-時曲線詳見圖5?？梢钥闯觯c菲律賓蛤仔對撲草凈的富集規律類似[37]，藥浴撲草凈后，克氏原螯蝦肌肉中的撲草凈殘留量隨時間大幅波動，先后出現2 個較為明顯峰，不同的是菲律賓蛤仔體內撲草凈殘留量在24 h達到峰值，而克氏原螯蝦肌肉中撲草凈及其代謝物殘留量在12 h達到峰值，說明克氏原螯蝦對撲草凈具有快速富集效應，但對比圖5中撲草凈原藥和代謝物殘留量變化趨勢可以看出，在短時間內撲草凈的富集效率遠高于代謝效率。藥浴撲草凈36 h后將克氏原螯蝦轉移至潔凈水中，其肌肉中撲草凈殘留量迅速下降，該結果與菲律賓蛤仔[37]和海參[38]體內的撲草凈消除實驗數據基本一致，說明撲草凈在水中消除較快。

圖4 克氏原螯蝦肌肉組織中撲草凈及其代謝物選擇反應監測色譜圖Fig.4 SRM chromatograms of prometryn and its metabolites in muscle tissue of crayfish

圖5 克氏原螯蝦肌肉組織中撲草凈及其代謝物藥-時曲線（n＝5）Fig.5 Drug-time curves of prometryn and its metabolites in muscle tissue of crayfish (n=5)

3 結論

本研究開發了一種水產品中撲草凈及其代謝物殘留的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，樣品經乙腈提取，EMR-Lipid與Cleanert LipoNo組合凈化，甲醇溶液定容后超高效液相色譜-串聯質譜測定，內標法定量。撲草凈及其代謝物在1.0～500 ng/mL范圍內線性良好，確定系數R2大于0.992。5 種除草劑LOD為0.20 μg/kg，LOQ為0.50 μg/kg。撲草凈及其代謝物在3 種水產品基質中的加標回收率為74.4%～113.7%，RSD為3.17%～11.47%。該方法操作簡單快速、基質干擾少、靈敏度高，可實現水產品中撲草凈及其代謝物殘留的精準識別和準確定量，為撲草凈在水產動物中的藥代動力學和殘留消除規律研究提供理論依據和技術支撐。