肉制品中馬源性成分重組酶介導鏈置換等溫擴增實時檢測方法的建立及應用

范 維，孔維恒，高曉月，董雨馨，李賀楠，郭文萍,*

（1.中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學研究院，北京 100068；2.中國海關科學技術研究中心，北京 100000）

隨著全球經濟的發展，肉及肉制品逐漸成為人們餐桌上的主角，而其摻假問題也成為國內外重點關注的食品安全問題之一[1-2]。目前，肉及肉制品摻假的主要形式之一是使用廉價肉代替或部分摻入到高價肉中進行銷售[3]，這種不法行為不僅給消費者帶來經濟損失、干擾肉類行業有序發展，更有甚者可引起宗教信仰、食品安全等問題[4-5]。馬肉作為一種食用范圍不廣泛的低價肉，其在色澤、肉質等方面與價格相對較高的驢肉、牛肉較為相近，尤其是當經過深加工制成肉制品后，消費者很難通過肉眼進行區分，這就導致一些用馬肉進行蓄意摻假行為的發生。從歐洲的“馬肉風波”[6]到英國的“掛牛頭賣馬肉”[7]，再到中國的“馬肉變驢肉”[8]等層出不窮的肉類摻假事件，揭示了馬肉摻假現象的廣泛存在。近些年，我國深化改革，大力加強肉及肉制品質量安全監管和摻假鑒別檢測技術支撐能力建設，并于2021年發布了《關于開展肉制品質量安全提升行動的指導意見》，突出強調了要持續性地對肉及肉制品進行源性成分摻假鑒別風險監測，并要求通過發展新技術進一步提升基層肉種快速鑒別檢測能力，充分發揮食品安全快速檢測初級“過濾網”作用。因此，開發出快速、準確、可在基層推廣使用的動物源性成分摻假鑒別技術將成為檢測行業未來的發展方向。

目前，國內外主要采用核酸分子生物學檢測手段對動物源性成分進行鑒別，包括聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）及衍生技術和等溫擴增技術[9]。其中PCR及衍生技術靈敏度高、準確性強，已經成為源性成分鑒定較為常用的方法之一[10]，但其實驗過程需依靠精準且昂貴的控溫設備，有時后期還要結合電泳跑膠和條帶測序，使其成本較高、實驗周期長、操作繁瑣，適合在大型專業性實驗室使用[11]。與PCR及衍生技術不同，等溫擴增技術是在恒溫條件下對目標核酸序列進行特異性擴增，不需要昂貴的溫度循環控制設備，且可以與其他微設備（恒溫熒光檢測儀、橫向流試紙條、微流體芯片等）進行偶聯，在低資源配置條件下實現快速檢測[12-13]。常見的等溫擴增技術包括環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、滾環等溫擴增（rolling circle amplification，RCA）、重組酶介導鏈置換等溫擴增（recombinase aided chain displacement isothermal amplification，RAA）等[14-15]。其中，LAMP技術較為常用，但4 條引物設計難度較大，引物間易發生交互作用，影響結果的準確性；RCA技術具有特異性強、高通量等特點，但其要求模板為環狀DNA，若擴增線性DNA，需要鎖式探針和連接酶，步驟繁瑣，成本較高；相較之下，RAA技術僅需要2 條引物，一般在37 ℃至42 ℃等溫條件下反應5～20 min即可完成特異性擴增，具有反應迅速、引物設計簡單、特異性強和操作簡便等優勢[16]，可作為一種有效的肉種快速鑒別方法在監管部門、中小企業及一般檢測實驗室得到推廣使用。

RAA技術的擴增原理是利用重組酶與引物結合形成聚合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結合蛋白的幫助下，侵入雙鏈DNA模板形成D-loop區域，并對DNA雙鏈進行掃描，當找到與引物互補的目標區域后，聚合體Rec/ssDNA解體，同時聚合酶結合到引物的3’末端開始鏈的延伸，完成擴增過程[17]。目前，RAA技術主要應用在病毒和致病菌檢測領域[18-19]，如Mu Dan等[20]建立了脫脂乳、生菜和湖水中大腸埃希氏菌O157:H7的RAA快速檢測方法；在動物源性成分摻假鑒別方面，尤其是針對馬源性成分鑒別的應用研究較少，如Zhou Chi等[21]建立了一種快速檢測動物源性食品中鴨源性成分的RAA方法。因此，本研究旨在建立一種快速、準確、便捷的馬源性成分RAA實時檢測方法，并對該方法在不同加工工藝（生、煮、烤、風干、油炸、高溫高壓滅菌）肉制品中的適用性進行評估，使其可以真正應用于市售深加工肉制品的真偽性鑒別檢測中，為監管部門開展肉制品摻假鑒別風險監測提供強有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于對照或模擬樣品制備的26 種動物肉分別購自屠宰廠或由北京市食品質量監督檢驗三站提供，均為整塊純肉，包括：馬肉（蒙古馬、伊犁馬、哈薩克馬）、驢肉（德州驢、關中驢、新疆驢、云南驢）、豬肉、鴨肉、雞肉、山羊肉、綿羊肉、黃牛肉、水牛肉、牦牛肉、狗肉、貓肉、兔子肉、火雞肉、鵝肉、狍子肉、駱駝肉、鼠肉、狐貍肉、鹿肉、鴿子肉。用于市售樣品檢測的肉及肉制品，分別購自農貿市場、超市、生產企業及餐館，包括：驢肉及其制品（生驢肉、驢肉餡、驢肉火燒、醬驢肉、驢肉火腿等）、牛肉及其制品（生牛肉、牛肉片、醬牛肉、牛肉串等）、羊肉及其制品（生羊肉、羊肉片、羊肉串、燜羊肉等）。

動物基因組DNA提取試劑盒 廣州迪澳生物科技有限公司；RAA核酸擴增試劑盒（熒光法）安普未來生物科技有限公司；2×PCR Premix ExTaqTM大連寶生物科技有限公司；引物、探針合成 北京華大基因科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FTC-3000P型實時熒光PCR儀 加拿大Funglyn公司；微量核酸蛋白測定儀 美國BioTek公司；3-30K臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；DK-80恒溫金屬浴 上海一恒儀器有限公司；ZK系列小型高速萬能粉碎機 上海達平儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

生肉需用清水進行簡單沖洗，清洗掉樣品表面可能沾染的其他源性組織或細胞；肉制品用清水多次浸泡清洗，盡量去除鹽、糖、色素及油脂等干擾成分。選取樣品瘦肉部分，用清洗干凈的剪刀、高速粉碎機等將其研磨成肉糜狀。不同源性的樣品使用不同的器具，防止交叉污染。

1.3.2 DNA提取及濃度測定

按照動物基因組試劑盒說明書對0.5 g研磨好的肉糜樣品進行DNA提取并測定其純度。DNA的OD260nm/OD280nm在1.8～2.0之間，可用于RAA擴增。將提取出的樣品和對照DNA均稀釋成5 ng/μL，作為擴增模板，置于-20 ℃冰箱備用。

按以下計算公式進行質量濃度和拷貝數之間的換算[22-23]：

式中：ρ代表馬基因組質量濃度/（ng/μL）；DNA length代表馬基因組長度（2.5×109bp）。

1.3.3 引物、Exo探針設計與篩選

1.3.3.1 引物與探針設計

參考近年文獻發表的相關序列，選擇ATpase 6基因為靶基因，從NCBI上查找并下載馬（GenBank：KX377931.1）、驢（GenBank：KT829558.1）、牛（GenBank：DQ347618.1）、羊（GenBank：KY453456.1）的ATpase 6基因序列，使用SnapGene軟件進行序列比對，篩選出種內保守、種間差異性區域片段，按Twist Dx公司給出的引物探針設計指南[24]，使用Primer Express和Primer Premier 5.0軟件設計2 對RAA引物和1 條Exo探針。用于RAA擴增的引物長度一般在30～35 bp，GC相對含量在30%～70%之間，擴增片段避免形成二級結構，目標序列長度建議在150～300 bp；探針序列不與特異性引物識別位點重疊，長度為46～52 bp，避免回文序列、內部二級結構和連續的重復堿基。探針共有4 個修飾位點：1）距離5’端30～35 bp中部位置標記一個dSpacer（四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF））；2）THF位點的上游標記一個熒光基團（如熒光染料（fluorescein amidite，FAM））；3）THF位點的下游標記一個淬滅基團（如BHQ1（black hole quencher 1））；4）3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團或C3-spacer。具體序列見表1。之后將設計好的引物探針通過SnapGene軟件檢測其可行性和特異性。

表1 實驗所用引物及Exo探針序列Table 1 Primers and Exo probes used in this study

1.3.3.2 引物的篩選策略

將設計出的2 對RAA引物和1 條Exo探針分別進行組合，形成4 組引物探針組合（F1/R1/Pro、F1/R2/Pro、F2/R1/Pro、F2/R2/Pro），分別用4 組引物探針進行馬源性RAA擴增，根據熒光信號強度和擴增開始時間（Ct值）篩選出最優引物探針組合。

1.3.4 RAA反應體系及擴增條件的優化

1.3.4.1 Mg2+添加量的優化

RAA反應體系為50 μL：向預混有重組酶及聚合酶干粉的反應管中加入29.4 μL反應緩沖液、上下游引物（10 μmol/L）各2 μL、探針（10 μmol/L）0.6 μL以及2 μL模板DNA，用相應ddH2O補至總體積分別為49.5、48.5、47.5、46.5、45.5 μL。充分混勻后，對應的分別將0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 μL MgAc2溶液（280 mmol/L）加到反應管蓋內，上下顛倒8～10 次進行混勻。瞬時離心后，按39 ℃，1 min；39 ℃，30 s，30 個循環（熒光PCR儀）或39 ℃，1 min；39 ℃，15 min（恒溫熒光檢測儀）的反應條件進行RAA擴增，根據熒光信號強度、擴增開始時間（Ct值）以及方法特異性確定最佳反應體系。

1.3.4.2 反應溫度的優化

用優化出的最佳反應體系分別于30、35、37、39、42 ℃條件下進行馬源性RAA擴增，根據熒光信號強度、擴增開始時間（Ct值）確定最佳反應溫度。

1.3.5 RAA方法特異性及包容性實驗

提取3 種目標源性和23 種非目標源性的DNA，并以此為模板，進行馬源性RAA擴增，驗證本方法的特異性及包容性。同時以雙蒸水作為空白對照。

1.3.6 RAA方法靈敏度實驗

將1.8×104copies/μL的馬源性DNA溶液進行10 倍梯度稀釋，從各梯度的DNA稀釋液中分別取2 μL作為模板加入到反應體系中，進行RAA擴增，各濃度設置5 個重復。按Ivanov等[16]的方法，以DNA拷貝數的對數為橫坐標，Ct值為縱坐標，繪制目標DNA檢測靈敏度Box-plot圖，并進行Logistic函數曲線擬合，以此考察該方法的DNA靈敏度。

1.3.7 RAA方法在不同加工工藝中的適用性及檢出限實驗

1.3.7.1 不同摻入比例混合樣品制備

分別以驢肉、牛肉和羊肉為本源，向其中摻入馬肉，參照Chen Xiaoyu等[25]的方法制備5 個不同的質量比例梯度（0.01%、0.1%、1%、10%、100%）的二元混合樣品（馬/驢、馬/牛、馬/羊）。以馬/驢二元混合樣品制備為例：使用高速破碎機將預先研磨好的1 g馬肉糜與9 g驢肉糜間歇性混合6 min，得到馬肉質量分數為10%的混合樣品（編碼為A1）；取1 g A1樣品與9 g驢肉糜間歇性混合6 min，得到馬肉質量分數為1%的樣品（編碼為A2）；取1 g A2樣品與9 g驢肉糜間歇性混合6 min，得到質量分數為0.1%的樣品（編碼為A3），同樣方法依次制備0.01%混合樣品以及其他源性二元混合樣品。每個樣品中的兩種肉糜總質量為10 g，混合過程中加入無毒藍色染料，混合至顏色均勻（6 min）。各比例混合樣品設10 個重復。

1.3.7.2 不同加工工藝及條件

為了評估不同加工工藝對所建立方法適用性的影響，參照Kim等[26]的研究，將1.3.7.1節制備的不同比例混合樣品進行以下5 種處理：1）100 ℃沸水浴中煮15 min；2）180 ℃烤箱中烤10 min；3）65 ℃烘箱中干燥12 h；4）180 ℃食用油中炸10 min；5）121 ℃、103.4 kPa條件下滅菌15 min。各加工工藝樣品設10 個重復。

1.3.7.3 適用性及檢出限測定

取經不同加工工藝處理后的不同摻入比例的混合樣品各0.5 g，進行DNA提取，用于馬源性成分的RAA檢測方法的建立。根據≥95%置信水平法則[25]，評估所建立的RAA方法在不同加工工藝肉制品中的適用性及檢出限，即在10 次平行實驗中，10 次結果均為檢出的最低目標源性摻入量即為該加工工藝條件下目標源性的檢出限。

1.3.8 市售樣品檢測

從不同渠道購買肉及肉制品共計90 份，包括驢肉及其制品30 份（編號1～30）、牛肉及其制品30 份（編號31～60）、羊肉及其制品30 份（編號61～90）。將樣品粉碎研磨至肉糜狀，取0.5 g進行DNA提取，之后采用建立的RAA方法對樣品進行馬源性成分檢測，同時采用標準方法SN/T 3730.5—2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第5部分：馬成分檢測 實時熒光PCR法》[27]進行驗證，對比兩種方法的檢測結果。

1.3.9 結果判定標準

陽性對照：有熒光信號檢出，且出現典型的擴增曲線，Ct值≤30.0；空白對照、陰性對照：無熒光信號檢出，相應Ct值＞30；樣品判定：熒光通道有熒光信號檢出，相應Ct值≤30.0，判定為陽性；熒光通道無熒光信號檢出，相應Ct值＞30.0，判定為陰性。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 引物、Exo探針設計及篩選結果

使用Snap Gene 軟件對馬（Gen Bank ：KX377931.1）、驢（GenBank：KT829558.1）、牛（GenBank：DQ347618.1）、羊（GenBank：KY453456.1）的ATpase 6基因序列進行比對，并將設計的引物、探針導入軟件中，對其可行性進行分析，結果見圖1。從馬源性ATpase 6靶基因譜圖（圖1A、B）和不同物種ATpase 6基因序列比對圖（圖1C）可知，所設計的2 對引物和1 條探針均可以在馬源性的ATpase 6靶基因序列中搜索到，且在引物界定的靶標序列區域內，馬源性與其他物種的差異性堿基數均超過150 個（相似度僅為43.1%），屬于位于種間序列差異性區域內[28]。因此，本研究設計的引物、探針均可以用于馬源性的特異性擴增。進一步對適用于RAA方法的最佳引物、探針組合進行篩選，采用4 組引物探針（F1/R1/Pro、F1/R2/Pro、F2/R1/Pro、F2/R2/Pro），分別進行馬源性RAA擴增，結果見圖2。從圖2可知，不同的引物、探針組合均能產生擴增曲線，其中F2/R1/Pro組合特異性擴增開始時間最早（Ct值為2.86），且熒光信號最強。綜上，選擇F2、R1、Pro作為馬源性RAA擴增的上、下游引物和探針。

圖1 引物、Exo探針可行性分析Fig.1 Feasibility analysis of primers and Exo probes

圖2 引物、Exo探針的篩選Fig.2 Screening of primers and Exo probes

2.2 RAA反應條件優化結果

為了確定最佳的RAA擴增反應參數，本研究對Mg2+添加量和反應溫度進行了優化。根據Mg2+添加量優化結果（圖3A）可知，隨著反應體系中Mg2+添加量的增加（0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 μL），RAA擴增開始時間逐漸提前且熒光信號顯示出增強的趨勢，這與吳昊等[29]的研究相似。這主要是由于Mg2+作為聚合酶的輔助因子在整個RAA擴增中起到啟動反應的作用，并且對反應的擴增效率也有至關重要的影響[22,29]。但隨著進一步特異性驗證實驗發現，當Mg2+添加量較高時（3.5、4.5 μL），反應的特異性會降低，會出現非特異性擴增條帶，這與Lin Liyun等[22]的研究結果一致。綜上，本實驗選擇2.5 μL作為Mg2+最佳添加量。從反應溫度優化結果（圖3B）可知，在30～42 ℃擴增溫度范圍內均可以擴增出馬源性特異性目標條帶。但當擴增溫度較低時（30、35 ℃），不利于酶活性維持，使得擴增開始時間較晚；而當擴增溫度為37、39、42 ℃時，特異性擴增開始時間和熒光信號強度均無明顯差異，這與Lin Liyun[22]、郭燕華[30]等的研究結果相近。綜上，選擇39 ℃作為馬源性RAA擴增反應的最佳反應溫度。

圖3 RAA反應條件優化結果Fig.3 Optimization of RAA reaction conditions

2.3 RAA方法特異性及包容性實驗結果

以3 種馬源性和23 種非目標源性DNA為模板，進行馬源性RAA擴增，結果見表2和圖4。本實驗開發的方法對常見的馬品種均可以檢出，且當添加的DNA模板初始質量濃度為5 ng/μL時，非目標源性（陰性對照）及空白對照均未檢測到熒光信號。由此可知，建立的RAA方法對于馬源性具有較好包容性，且對非目標源性無交叉反應。

圖4 引物、Exo探針特異性分析Fig.4 Specificity analysis of primers and Exo probes

表2 方法特異性及包容性實驗結果Table 2 Results of specificity and inclusiveness experiments

2.4 RAA方法靈敏度實驗結果

以Ct值為縱坐標（Y），DNA拷貝數的對數值為橫坐標（X）繪制目標DNA檢測靈敏度Box-plot圖，并進行Logistic函數曲線擬合，結果如圖5所示。隨著目標DNA拷貝數的增加，RAA擴增反應Ct值隨之減小，但DNA拷貝數的對數值與Ct值并非呈嚴格的線性關系，這與Ivanov[16]、張雅薇[31]等的研究結果相似。本實驗開發的RAA方法可準確檢測到拷貝數為1.8 copies/μL的馬源性DNA，而當模板DNA拷貝數低于該值時，仍有擴增，但重復性和準確性差。

圖5 目標源性擴增曲線及靈敏度Box-plot圖Fig.5 Amplification curves and sensitivity Box-plot for target animal origin

2.5 不同加工工藝條件下RAA方法適用性及檢出限結果

通過對5 種加工條件（煮、烤、炸、干制、高溫高壓滅菌）下處理的不同比例混合肉樣品進行檢測，確定該方法在深加工熟肉制品和生肉中的適用性及方法的檢出限。如表3所示，同等摻入比例條件下，經過加工處理的樣品目標源性檢測Ct值相對高于生肉的Ct值，說明深加工工藝會對目標源性的RAA檢測造成影響，可能是由于高溫和高壓條件使得DNA發生降解[26]。此外，通過不同摻入比例樣品的測定結果發現，當摻入量為0.01%時，生肉樣品10 次平行實驗目標源性的檢出次數可以達到10 次，滿足不小于95%置信區間的測試要求，表明該摻入量可以檢出且重復性較好；而煮肉、烤肉、干制肉、油炸肉、高溫高壓滅菌肉樣品的檢出次數均有小于10 次的情況，說明該摻入量存在無法檢出的可能性，若以0.01%摻入量作為熟肉制品的檢出限，會造成假陰性結果的產生。綜上，為了確保使用本方法進行肉及肉制品檢測時的準確性，現規定本方法對于生肉的檢出限為0.01%，對于熟肉制品的檢出限為0.1%。該檢出限與Jonas[28]、苗麗[32]等的研究結果一致，但低于Kumar[24]、吳昊[29]等研究的1%和0.2%。

表3 不同加工工藝下RAA方法適用性及樣品檢出限結果Table 3 Applicability of RAA and detection limits for samples under different processing techniques

2.6 市售樣品檢測結果

采用本實驗建立的RAA方法與標準方法同時對90 份市售樣品進行馬源性成分檢測，結果見表4。本方法與標準方法結果一致，均有8 個樣品檢出含有馬源性成分，不合格率為8.9%（8/90）。8 個不合格樣品中包括6 個驢肉及其制品和2 個牛肉制品。其中6 個不合格驢肉及其制品中有2 個生驢肉（1 個生鮮驢肉、1 個驢肉餡）和4 個熟肉制品（3 個驢肉火燒、1 個醬驢肉）；2 個不合格牛肉制品均為熟肉制品（醬牛肉）。此外，用所建的RAA方法僅需16 min即可完成對目標DNA的檢測，而標準方法則需要大約1 h（94 ℃預變性1 min；94 ℃變性34 s，60 ℃退火45 s，40 個循環）。綜上可知，兩種方法的檢測結果一致，且所建方法的檢測時間僅為標準方法的1/4，說明該方法快速、準確，可作為一種有效技術手段用于市售肉及肉制品中馬源性成分的摻假鑒別檢測。

表4 市售樣品中不合格樣品的檢測結果Table 4 Results of detection of problem commercial samples

3 結論

本研究通過靶基因篩選、目標區域片段比對、特異性引物探針設計以及反應參數優化，開發出一種可快速鑒定肉及肉制品中馬源性成分的RAA實時檢測方法。研究采用多拷貝線粒體基因為靶基因，克服了單拷貝基因在樣品熱處理溫度越高、摻假比例越低時，其檢測結果偏差越大的問題[33-34]，并充分考慮了不同加工工藝（煮、烤、炸、干制、高溫高壓滅菌）對方法適用性的影響，使得該方法的應用范圍從生鮮肉進一步擴展到了深加工熟肉制品。本方法操作簡便、反應迅速，可在39 ℃恒溫條件下16 min內完成對馬源性成分的特異性檢測，且對檢測儀器要求低，適用于熒光PCR儀或成本更低的便攜式恒溫熒光檢測儀，具有較強的基層推廣性和現場檢測實用性。此外，該方法的靈敏度、特異性和檢出限均可以與現有的PCR方法相媲美，其目標DNA的檢測靈敏度可以達到1.8 copies/μL水平；與常見的23 種畜禽均無交叉反應；對生肉的檢出限為0.01%，對熟肉制品的檢出限為0.1%，滿足目前各標準中對馬源性檢出限的要求。用該方法對90 份市售樣品進行馬源性成分檢測，結果與標準方法一致，而用時僅為標準方法的1/4。綜上，本研究建立的重組酶介導等溫擴增實時檢測方法可以作為一種有效的檢測手段，應用在生肉及深加工熟肉制品中馬源性成分的真偽性鑒別風險監測中，為提升基層現場檢測能力、打擊非法摻假欺詐、規范市場秩序和保障人民食品安全提供技術支持。