人工窖泥微生物群落對濃香型白酒發酵過程風味代謝物形成的影響

毛鳳嬌，黃 均，周榮清,2, ，張宿義，秦 輝

（1.四川大學輕工科學與工程學院，四川 成都 610065；2.國家固態釀造工程技術研究中心，四川 瀘州 646699；3.四川省瀘州市瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646699）

濃香型白酒的生產工藝特點之一是以內襯棲息多種厭氧微生物窖泥的長方形地下窖池為發酵容器[1]。窖泥微生物群落與窖齡和發酵過程參數的調控密切相關，顯著影響發酵過程及白酒的品質和產率[2]。一般認為，許多重要風味化合物的形成與窖泥菌群的組成與演替息息相關[3-4]。應用可培和免培技術對窖泥的研究已經較清楚地了解了微生物群落的構成及功能，窖泥中的群落主要由細菌和真菌構成[5-6]。梭菌被認為是合成丁酸、己酸等中、短鏈脂肪酸的關鍵種群之一[7]。有研究表明，隨著窖齡的增長，窖泥中的微生物多樣性增加[3]，優質窖泥具有穩健的群落結構。這些研究主要集中在破譯窖泥本身的微生物群落結構和組成方面。然而，迄今對窖泥棲息菌群的貢獻缺乏科學的認識，目前尚不清楚窖泥微生物對風味化合物的貢獻以及作用機制。本實驗通過設置有泥和無泥組模擬發酵體系，解析酒醅間風味化合物的差異。同時，應用高通量測序技術檢測酒醅中細菌和真菌的群落結構，探究風味化合物與微生物群落之間的相關性，以期闡明窖泥微生物群落對風味形成的影響規律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所有試劑 成都金山化學試劑有限公司；2×Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、ITS1/ITS4引物、DNase/RNase-free Deionized Water和真菌基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

強化人工窖泥為實驗室培養，質量分數5%的100 a窖泥培養液接種到1 a的新泥中，同時接種1%的太空大曲，室溫厭氧發酵60 d[5]。太空大曲、高粱、糠殼和酒醅均取自中國四川省瀘州市一家著名白酒企業，其中太空大曲通過接種1%的母曲生產，母曲是在神舟十一號飛船的太空艙中育種了1 個月的大曲粉經逐批擴大培養得到[8]。

1.2 儀器與設備

TGL 16M高速冷凍離心機 長沙湘麓離心機儀器公司；S100TMThermal Cycler PCR儀、Gel DocTMXR凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；ND-1000 NanoDrop分光光度計 美國賽默飛世爾科技公司；Infinite M1000 Pro全自動多功能酶標儀 瑞士Tecan有限公司；85-2型數顯恒溫磁力攪拌器 上海雙捷實驗設備有限公司；PHS3C pH計 上海大普儀器有限公司；1260高效液相色譜、Trace 1300-TQS 9000頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品收集

使用5 L塑料容器（28 cm×19 cm×14 cm）作為實驗室反應器模擬白酒發酵過程。設置窖泥組（JJP）和對照組（CJP）。窖泥組使用太空大曲和100 a窖泥培養液強化后的人工窖泥，厚度為4～4.5 cm，對照組中沒有窖泥。按照DB510500/T 36—2016《單糧濃香型白酒原酒生產技術規范》操作工藝流程完成蒸糧，將上一輪發酵后的酒醅與高粱、糠殼按照20∶5∶1進行混合，蒸熟，冷卻至40 ℃左右后添加20%（以體系質量計）的太空大曲混合均勻，待冷卻到室溫后，將上述發酵糟裝入自制窖池中，用窖泥密封后置于培養箱內（26～28 ℃）厭氧發酵60 d[8]。在發酵的第15、30、45天和第60天分上下兩層進行取樣，對照組分別標記為U-CJP、B-CJP，實驗組分別標記為U-JJP和B-JJP。

1.3.2 理化指標檢測

總酸、總酯的檢測方法分別參照GB/T 10345.4—1989《白酒中總酸的試驗方法》、GB/T 10345.5—1989《白酒中總酯的試驗方法》。水分質量分數通過質量法測定，在105 ℃下干燥至少4 h直至質量恒定。樣品與超純水按照1∶9（g/mL）混合，使用pH計直接測量pH值。通過蒸餾法及乙醇計測定乙醇體積分數。淀粉和還原糖的含量采用Fehling試劑法測定[9]。

1.3.3 有機酸分析

有機酸的測定采用高效液相色譜法，參照Chen Suqi等[10]描述的方法略作修改：稱取5.0 g樣品置于50 mL離心管中，用20 mL H2SO4溶液（0.009 mol/L）稀釋，樣品渦旋5 min（200 r/min），超聲1 h（100 W、40 kHz）。經超聲處理后的樣品在12000 r/min（4 ℃）條件下離心10 min。取3 mL上清液加入活化后的C18SPE純化柱，收集濾液，0.22 μm濾膜過濾，最后通過1260高效液相色譜分析。色譜條件：流動相為0.009 mol/L H2SO4溶液，流速為0.6 mL/min，進樣量為20 μL，柱溫75 ℃。色譜柱為Alltech OA-1000有機酸柱（300 mm×7.8 mm），檢測器為紫外檢測器（波長210 nm）。用標準品乳酸、乙酸、丁酸和己酸等的濃度和峰面積繪制標準曲線對樣品進行定性、定量分析。

1.3.4 揮發性代謝物分析

揮發性代謝物及含量：采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法，參考Zhang Liqiang等[11]的方法：將0.500 g樣品和20 μL內標（0.0079 g/100 mL辛酸甲酯）加入20 mL頂空瓶中，置于60 ℃水浴鍋中平衡15 min，使用固相微萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）萃取50 min，然后將其插入進樣口解吸5 min，經質譜檢測。

氣相色譜-質譜條件：以20∶1分流模式進樣，載氣為純度99.99%的氦氣。升溫程序：起始溫度為40 ℃保持5 min，以4 ℃/min的速率升溫至100 ℃，再以6 ℃/min的速率升溫至230 ℃保持10 min。進樣口溫度為270 ℃，電子電離源，電子能量為70 eV，質量掃描范圍m/z35～400。將揮發性代謝物數據與標準譜庫（NIST 2017）對比進行鑒定，根據保留指數選取正反匹配度均大于800的物質給予分析[12]。基于內標辛酸甲酯濃度和峰面積對鑒定的揮發性化合物采用峰面積歸一化法計算含量。

1.3.5 DNA提取和擴增子測序分析

按照Omega Mag-bind soil DNA試劑盒的操作說明提取DNA。1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop分光光度計檢測DNA的濃度、純度和完整性。使用引物338F和806R擴增16S rRNA基因的V3～V4區域，真菌以ITS1區域進行擴增[13]。利用建庫試劑盒MiSeq ReagentKit v3進行文庫構建，PCR擴增產物由瓊脂糖凝膠切膠獲得目標片段并純化回收，酶標儀測定濃度后，等濃度混合。然后送往上海派森諾生物科技有限公司，利用Illumina MiSeq測序平臺對DNA片段進行雙端（Paired-end）測序。測序數據使用官方提供的QIIME 2（http://qiime.org）云平臺分析[14]。根據Mothur軟件（v1.31.2）的結果計算Shannon多樣性指數和Chao1豐富度指數[15]。

1.4 數據處理與分析

樣本平均值之間的差異顯著性通過使用S P S S Statistics 22軟件的單因素方差分析（ANOVA）進行檢驗，P＜0.05被認為具有統計學意義。采用Excel 2021和Origin 2021軟件繪制數據并進行統計分析，結果以的形式表示。采用Chao1指數和Shannon指數評價微生物群落的α多樣性。用Simca 14.0軟件和pheatmap軟件分別對揮發性代謝物進行偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），并對PLS-DA的變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）進行評分和熱圖聚類分析。用R語言的hmisc軟件包計算優勢微生物（相對豐度＞1%）以及揮發性代謝物之間的Spearman相關系數（ρ）和顯著性（P），并根據|ρ|＞0.6和P＜0.05構建共生網絡，然后在Cytosscape（v.3.60）軟件中進行可視化。用PICRUSt2軟件分析原核生物群落的功能組成[16]。

2 結果與分析

2.1 理化指標和有機酸的差異分析

在發酵過程中，兩組酒醅水分都是先增高后漸趨平緩。代謝所產生的水分質量分數通常是以重力作用從上自下逐漸增高[17]，因此，下層酒醅水分質量分數較高，且JJP高于CJP（圖1）。相反地，兩組酒醅的淀粉和還原糖含量在發酵過程中逐漸降低，且下層降幅高于上層[18]。JJP因棲息在窖泥中的菌群遷移到酒醅，并與酒醅的菌群互作，形成了良好的生態位[19]，使淀粉的利用率高于CJP，下層同樣高于上層[18]。發酵15 d后，還原糖亦呈現類似趨勢。發酵前期CJP上層接觸了空氣，菌群繁殖速率快，產生的還原糖更多。因窖泥棲息了大量產酸菌，尤其是發酵前期JJP的下層酒醅酸度大于CJP。隨著發酵的進行，Methanogen、Clostridiumsp.等的種間氫轉移、乳酸碳鏈延長、轉化己酸和丁酸等的代謝速率提高，JJP的pH值在發酵30 d后降低速率減緩[19]。兩組酒醅的乙醇體積分數在前、中期持續增加，且發酵前期CJP高于JJP，45 d后JJP下層的乙醇體積分數高于上層，發酵結束時，類似Gao Jiangjing等[17]報道的結果，兩組間上、下層酒醅的乙醇體積分數幾乎相等。

圖1 發酵過程中酒醅的理化特性Fig.1 Physicochemical characteristics of fermented grains during fermentation

如圖2所示，兩組酒醅中4 種優勢有機酸的含量在前30 d均增幅較高，隨之變緩。JJP因后續發酵過程部分乳酸轉化為丁酸和己酸[17]，因此后期乳酸含量低于CJP，且丁酸和己酸在上、下層的含量都高于CJP，并持續增高[20]。這些結果揭示了窖泥的重要貢獻是將乳酸轉化為丁酸和己酸[21]，促進了己酸乙酯等風味骨架成分的合成[22]。同時窖泥中的功能菌甲烷八疊球菌（Methanosarcina）在將乙酸轉化為甲烷的同時也消耗H＋，減緩了體系的酸化，促進了己酸的合成[23]。

圖2 發酵過程中酒醅有機酸的變化Fig.2 Changes in organic acid contents of fermented grains during fermentation

2.2 揮發性代謝物構成差異分析

如圖3所示，窖泥顯著提高了酒醅中揮發性代謝物的含量。JJP揮發性代謝物的含量在發酵過程中持續增高，而CJP僅在45～60 d緩慢增加。在15 d時，JJP下層揮發性代謝物的總含量較CJP高15.10 mg/kg，但上層僅高0.32 mg/kg，其中JJP下層酒醅乙酸含量比CJP高0.79 mg/kg，發酵60 d時，高2.29 mg/kg。經15 d發酵，JJP己酸的含量較CJP高8.60 mg/kg，發酵至60 d時，兩種酒醅間己酸含量的差值高達13.57 mg/kg。發酵15～60 d，JJP和CJP下層酒醅的丁酸含量差值在2.24～2.75 mg/kg之間，而兩組酒醅的這些代謝物在上層僅略有差異。乙酸、己酸和丁酸的乙酯類化合物在JJP中的含量都高于CJP，尤其是JJP下層酒醅中己酸乙酯的含量始終高于CJP，且30 d時高達7.95 mg/kg。乳酸乙酯在JJP的含量顯著低于CJP。發酵結束時，JJP上、下層酒醅揮發性代謝物總量分別是90.91 mg/kg和74.92 mg/kg，但在CJP中僅分別是53.16 mg/kg和41.15 mg/kg。這些結果證實了窖泥菌群顯著影響酒醅的風味輪廓，尤其顯著提高了風味骨架成分己酸乙酯的含量[24]。

圖3 發酵過程中對照組和窖泥組酒醅中風味代謝物的比較分析Fig.3 Comparison of flavor metabolites in fermented grains between the control and pit mud group during fermentation

酒醅中共檢出了109 種揮發性代謝物，包括酯類60 種、醇類20 種、酸類9 種、醛類4 種、酮類5 種和其他類11 種。在發酵過程中，JJP揮發性代謝物的含量持續增高，且高于CJP。這些結果表明，窖泥菌群與酒醅揮發性代謝物的組成和輪廓密切相關[25]。PLS-DA的結果也顯示，窖泥主要有益于提高酒醅中酯類、醇類和酸類的含量（圖4A）。基于VIP＞1.0，共鑒定出了24 種差異代謝物（圖4B），主要包括己酸、己酸乙酯、乙醇、亞油酸甲酯和乳酸乙酯等[8]。差異代謝物的熱圖分析結果也表明，JJP中差異代謝物的含量高于CJP，尤其是在發酵45 d后更明顯（圖4C）。發酵至15 d時，CJP下層揮發性代謝物的含量高于上層，30 d時則相反，JJP亦呈現類似變化規律。但發酵45 d后，上層酒醅代謝物的含量高于下層，包括賦予其花果香、甜味和酸味的己酸、丁酸、己酸乙酯、丁酸乙酯和2,3-丁二醇等濃香型白酒的特征風味代謝物[26]。這些結果揭示了窖泥對酒醅特征風味的貢獻特點[27]。

圖4 對照組和窖泥組酒醅揮發性代謝物的差異分析Fig.4 Differential analysis of volatile metabolites in fermented grains between the control and pit mud groups

2.3 微生物群落特征差異分析

2.3.1 群落多樣性差異

擴增子測序技術檢測發酵過程中酒醅微生物群落結構的結果如表1所示。發酵結束時，各酒醅細菌群落的α多樣性指數低于初始酒醅FG0，但真菌群落的豐富度和多樣性增加。JJP下層酒醅細菌群落的Chao1和Shannon指數都高于上層酒醅。類似Wang Shilei等[28]報道的結果，窖泥顯著提高了酒醅微生物群落的豐富度和多樣性。在發酵過程中，酒醅細菌群落的豐富度先增后減，在30～45 d都增至穩態，而JJP的增量大于CJP。真菌群落的多樣性和豐富度指數顯著低于細菌群落，真菌群落的豐富度在整個發酵過程中持續增大，45 d時多樣性達到峰值后，穩定至60 d后略有降低。

表1 酒醅中微生物群落的豐富度和多樣性Table 1 Abundance and diversity indexes of microbial communities in fermented grains

2.3.2 群落結構和組成差異

發酵過程酒醅細菌群落優勢菌的豐度及結構差異如圖5A所示。樣品間屬水平的差異因發酵周期而異。FG0中，優勢細菌包括Lactobacillus（11.51%）、Delftia（20.77%）、Kroppenstedtia（22.88%）、Staphylococcus（14.63%）和Bacillus（10.73%）。經15 d發酵后，Lactobacillus成為絕對優勢菌，曾有研究報道發酵5 d時，Lactobacillaceae的相對豐度己高達98.0%[20]。主要代謝物乳酸和乙醇能抑制酸、醇敏感菌的生長，但過量則會導致酒醅微生物群落的失衡，降低基酒的品質和產率[29]。發酵至60 d時，CJP中Lactobacillus的相對豐度降低，分別是95.88%（上層）和97.42%（下層）。Bacillus、Rhodococcus、Thermoactinomyces、Ralstonia和Pseudomonas的相對豐度增高，且上層高于下層。但在45 d時，JJP中Lactobacillus的相對豐度已經開始降低，下層（91.48%）降幅高于上層（96.85%）。窖泥降低了酒醅中Lactobacillus的相對豐度[30]，多種細菌的相對豐度增高，下層的增幅高于上層，主要包括Kroppenstedtia、Bacillus、Clostridium_sensu_stricto_12、Thermoactinomyces、Acetobacter、Ralstonia和Pseudomonas，且產己酸、丁酸及酯類化合物的重要功能菌Clostridium_sensu_stricto_12僅在JJP中檢出[31]。發酵結束時，Bacillus、Rhodococcus、Thermoactinomyces和Acetobacter的相對豐度增高。整個發酵過程中，JJP中分泌淀粉酶和纖維素酶等水解酶的Kroppenstedtia的相對豐度顯著高于CJP[32]。

圖5 窖泥對酒醅細菌（A）和真菌（B）分布和組成的影響Fig.5 Effects of pit mud on the distribution and composition of bacterial (A) and fungal communities (B) at the genus level in fermented grains

如圖5B所示，FG0中優勢真菌包括Thermoascus（43.11%）、Rhizomucor（23.36%）、Thermomyces（16.97%）和Pichia（3.35%）。發酵前45 d，Thermoascus的相對豐度在兩種酒醅中無顯著變化，發酵結束時，CJP和JJP上、下層豐度分別降至1.30%和2.26%及6.75%和6.30%，表明CJP中嗜熱酶類的活力可能被降低[33]。發酵至45d時，Rhizomucor逐漸增高至峰值，在CJP與JJP上、下層的相對豐度分別是29.13%和27.30%及24.91%和36.72%，后期則顯著降低。Thermomyces的變化趨勢類似Rhizomucor。在發酵前15 d，JJP的Kazachstania從0.05%增至22.26%（上層）和41.36%（下層），直至45 d時相對豐度一直較高，且高于CJP的20.29%和5.47%。Kazachstania參與多種白酒風味成分的合成，尤其是醇類（苯乙醇）及酯類化合物，賦予基酒獨特的花果香[34-35]。類似地，濃香型白酒重要功能真菌之一的Pichia豐度也逐漸增高[36]。由此可見，窖泥的貢獻主要是提高酒醅中部分功能菌的豐度及降低Lactobacillus的豐度。

2.4 微生物群落與揮發性代謝物的相關性分析

本實驗計算了CJP和JJP中優勢屬和揮發性代謝物之間的Spearman相關系數[37]，選擇系數|ρ|＞0.6和顯著性P＜0.05作為網絡節點的強相關性[38]。CJP有13 個細菌屬和11 個真菌屬與20 種揮發性代謝物顯著相關（圖6A）。JJP中有11 個細菌屬和9 個真菌屬與23 種揮發性代謝物顯著相關（圖6B）。初步確定這些屬是合成揮發性代謝物的功能菌，且JJP微生物群落和揮發性代謝物的相關性比CJP的更強[38]。CJP中Bacillus、Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Saccharopolyspora和Rhodococcus與20 種揮發性代謝物呈強正相關，對酒醅的風味特征貢獻顯著。Bacillus和Kroppenstedtia分泌多種耐熱酶，且生產多種重要風味代謝物[32,39]。Thermoactinomyces和Saccharopolyspora與乙酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯和乳酸乙酯等酯類化合物顯著正相關，相關研究也表明Saccharopolyspora有利于酯類化合物的產生[32]。JJP中乙醇和2,3-丁二醇與絕大多數微生物呈顯著正相關。己酸是Clostridium_sensu_stricto_12的主要代謝成分，且與乙醇、3-甲基丁醇、己酸和己酸乙酯呈顯著正相關，而與乙酸乙酯呈負相關[40]。對于真菌群落，Kazachstania在CJP中與乙酸乙酯呈負相關，但在JJP中與己酸和己酸異戊酯呈顯著正相關。Thermoascus在CJP和JJP中與多種揮發性代謝物呈負相關，類似Zhang Yuandi等[32]報道的結果。此外，在CJP中Rhizopus、Rhizomucor和Monascus與乙醇、2,3-丁二醇和3-甲基丁醇的含量呈顯著正相關，可能與這些曲霉菌的還原酶活性有關[41]。JJP中Pichia與己酸和己酸乙酯呈顯著正相關[6]。

2.5 代謝通路分析

基于京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）以及差異揮發性代謝物代謝通路分析結果，構建了酒醅揮發性代謝物，相關酶的代謝網絡如圖7A所示，PICRUSt2預測了發酵過程中細菌群落編碼相關酶的豐度（圖7B）。揭示了CJP和JJP中參與淀粉代謝和主要風味成分代謝酶的組成和豐度差異，尤其糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）途徑和脂肪酸合成途徑[42]。JJP的EMP途徑大部分酶的豐度高于CJP，意味著窖泥菌群促進了葡萄糖的轉化。JJP中脂肪酸合成途徑的多數酶，如己酸合成酶（EC 1.3.1.38、EC 2.3.1.16、EC 6.2.1.1），丁酸合成酶（EC 2.3.1.9、EC 2.8.3.8）的豐度也顯著高于CJP，且下層顯著高于上層，解釋了JJP下層己酸和己酸乙酯含量顯著高的原因。作為多種酯類化合物前體的脂肪酸，即可經氧化反應生成醇、酮等，亦可經酯酶（EC 3.1.1.1和EC 3.1.1.3）催化合成酯類[43]，兩種酶在細菌群落中的差異表達與CJP和JJP中酯類物質的含量差異吻合。淀粉是白酒釀造所需的主要碳源，酒醅中的淀粉轉化為葡萄糖、麥芽糖等還原糖，可被微生物直接利用，并通過EMP途徑產生丙酮酸，然后經乳酸脫氫酶（EC 1.1.1.27）轉化為乙醇[23]，乳酸脫氫酶是催化乳酸轉化為乙酰輔酶A，再經鏈延長途徑合成己酸的關鍵酶[44]，JJP中與乳酸相關的酶在30 d時豐度高于CJP，且下層高于上層，解釋了乳酸減少和己酸增加的原因。丙酮酸發酵生成乙酸和乳酸是酒醅細菌代謝的重要特征[45]。由于JJP中EC 1.2.5.1和EC 2.8.3.18上調，乙酸的代謝量增加。乙偶姻作為2,3-丁二醇的前體，在乙酰乳酸合成酶（EC 2.2.1.6）和乙酰乳酸脫氫酶（EC 4.1.1.5）的催化下由丙酮酸衍生而來，且這兩種酶在JJP發酵的第15天表達量最高。乙偶姻轉化為2,3-丁二醇過程所參與的丁二醇脫氫酶（EC 1.1.1.4）在JJP的第60天表達量最高，研究結果也顯示JJP中2,3-丁二醇的含量高于CJP。

圖7 重要揮發性化合物和酶的綜合代謝途徑（A）以及相應酶的豐度變化（B）Fig.7 Comprehensive metabolic pathways of important volatiles (A) and enzymes and changes in the abundance of corresponding enzymes (B)

3 結論

窖泥在濃香型白酒發酵過程中具有重要作用，顯著影響了酒醅的微生物群落結構和組成，以及揮發性風味代謝物的含量。揭示了窖泥對酒醅中細菌群落的影響，尤其是Lactobacillus的豐度，且影響了真菌群落，驅動了酒醅功能菌群的富集。窖泥顯著提高了酒醅風味代謝物的含量，尤其是特征風味代謝物己酸乙酯的含量。窖泥的貢獻具有空間屬性，下層酒醅己酸增加量和乳酸降低量高于上層酒醅。研究結果為濃香型白酒發酵體系中風味代謝物的調控提供理論依據。