草菇子實體多肽對小鼠急性酒精肝的預防作用及腸道菌群的影響

張芳藝，林海潞，陳莉莉，羅小芳，褚路路，江玉姬,2,3，陳炳智,2,3,

（1.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.福建農林大學菌物研究中心，福建 福州 350002；3.農業農村部亞熱帶特色果蔬菌加工重點實驗室（部省共建），福建 福州 350002）

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是由于大量飲酒導致的中毒性肝損傷，其表現多樣，初期通常表現為脂肪肝，進而可發展成酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化[1-3]。嚴重酗酒時可誘發廣泛肝細胞壞死甚至肝功能衰竭[4]。全球肝病病因學研究顯示，世界范圍內有超過1.5億 人的肝病是飲酒所導致，ALD的發病率在不斷增加[5-6]。在中國，酒精引起的肝病也在逐年增加，是僅次于肝炎的第二大肝病，嚴重威脅到了人們的健康[7]。酒精是全球引發肝癌的主要因素，且隨著酒精消費的增加，預計未來肝癌患者數量也會隨之增加。

肝臟是人體最大的腺體，是解毒和代謝的重要器官[8]，擁有體內最大的網狀內皮細胞吞噬系統，可吞噬血液中各種病原菌及其他顆粒物質，具有免疫防御和免疫調節功能[9]。若出現代謝紊亂，會造成脂肪肝、酒精肝等多種肝疾病，同時會造成免疫系統和腸道菌群失調，影響肝細胞代謝和脂質氧化系統[10]。研究表明，乙醇在攝入機體后經過肝臟代謝生成乙醛，再被乙醛脫氫酶氧化生成乙酸，最后氧化成水和二氧化碳。但乙醛轉化成乙酸的速度很慢，導致乙醛在體內堆積，從而破壞氧化還原平衡狀態，造成肝臟氧化應激損傷[11-12]。現今市售保肝藥物，如糖皮質類固醇、多烯磷脂酰膽堿和水飛薊素等，絕大多數對人體有毒副作用[13-14]。因此，從藥食同源植物中尋找有效預防酒精性肝損傷的功效成分，并將其開發為抗酒精性肝損傷的保健食品，是有效預防酒精性肝損傷的重要途徑[15]。

腸道菌群是人體腸道的正常微生物，與人類共生[16]。近年來，腸道健康受到越來越多的關注。研究發現，腸道菌群在酒精性肝損傷、肝硬化和肝細胞壞死等疾病的發生過程中起重要作用[17-18]。機體長期攝入酒精后，酒精及其代謝物會使腸道菌群紊亂、通透性增加，造成腸道屏障功能障礙，影響機體的正常功能，加重ALD[19]。目前，利用腸道菌群DNA序列分析腸道菌群與酒精性肝損傷的關系已成為日益受到關注的研究方向。

草菇（Volvariella volvacea(Bull.) Singer）又名蘭花菇[20]，隸屬光柄菇科（Pluteaceae）、小苞腳菇屬（Volvariella），被譽為“素中之葷”[21]。草菇含有多肽、三萜、黃酮、甾醇類物質等多種活性物質[22]。生物活性肽是一種具強抗氧化性的多肽，可以抑制大分子的氧化應激反應[23]。研究表明，生物活性肽可以改善肝臟功能和乙醇代謝，具有抗炎護肝作用[24]。本實驗以分子質量為1～3 kDa的草菇子實體多肽（Volvariella volvaceafruit body polypeptides，VVFP）為研究材料，建立小鼠急性ALD模型，通過血清和肝臟多項指標檢測，結合肝組織病理切片分析，探究VVFP對急性ALD的預防作用；同時利用16S rDNA基因高通量測序分析各樣品中微生物菌群的生物多樣性以及門和屬水平的相對豐度，探究VVFP對ALD模型小鼠腸道菌群結構的影響，從而為揭示VVFP對小鼠肝臟的保護作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

ICR雄性小鼠（SPF級），3～4 周齡，體質量（25±2）g，動物生產許可證：SCXK（京）2019-0008，由吳氏小鼠動物有限責任公司提供。

動物飼料（含有玉米、豆粕、小麥麩、小麥次粉、魚粉、大豆油、石粉、碳酸氫鈣、鹽、氮化膽堿、賴氨酸、多種維生素、多種礦物元素）由閩侯縣吳氏實驗動物貿易有限責任公司提供。

無水乙醇、冰乙酸、福爾馬林（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；聯苯雙酯滴丸 浙江醫藥有限公司；56°紅星二鍋頭 北京紅星股份有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、丙二醛（malondialdehyde，M D A）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；E.Z.N.A.Stool DNA Kit試劑盒 美國Omega BioTek公司；NovaSeq 6000SP Reagent Kit、TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

Hannuo-192組織研磨儀 上海漢諾儀器有限公司；LGJ-12真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；UV-5100B紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；SpectraMaxi3X多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；L-550臺式離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；BA210T顯微鏡 麥克奧迪實業集團有限公司；S1000聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；NovaSeq 6000高通量測序儀 美國Illumina公司；PacBio RS II分子測序儀 美國Pacific Biosciences公司。

1.3 方法

1.3.1 VVFP的制備

參照張芳藝等[25]的研究，草菇干品采用堿提酸沉的方法提取草菇蛋白，用堿性蛋白酶酶解草菇蛋白得到VVFP。經檢測VVFP的8 種必需氨基酸（essential amino acid，EAA）含量占總氨基酸含量的41.71%，VVFP的EAA與非必須氨基酸的百分比為71.56%，符合聯合國糧食及農業組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）/世界衛生組織（World Health Organization，WHO）對優質蛋白質的要求。采用透析法進行分離純化，獲得分子質量為1～3 kDa的VVFP。冷凍干燥制得VVFP粉，置于干燥皿中保存，以進行小鼠體內實驗。

1.3.2 小鼠分組

將72 只健康雄性小鼠隨機分成6 組，分別命名為空白組（CK）、模型組（MK）、陽性對照組（P）、VVFP低劑量組（L-VVFP）、VVFP中劑量組（M-VVFP）、VVFP高劑量組（H-VVFP），每組12 只。

1.3.3 急性酒精肝損傷小鼠模型的建立

小鼠適應性喂養1 周后，開始灌胃處理，多肽組按不同劑量灌胃等體積多肽溶液（100、200、400 mg/kgmb），陽性對照組將聯苯雙酯滴丸溶于蒸餾水灌胃（200 mg/kgmb），其余各組灌胃等體積的蒸餾水（10 mL/kgmb）。每5 d稱質量，每只小鼠根據體質量調整劑量，連續灌胃30 d。末次給藥處理后，間隔5 h，除了空白組外，都給予灌胃12 mL/kgmb紅星二鍋頭，建立急性ALD模型。建模時間為12 h，禁食不禁水，眼球取血，離心取上清液，再頸椎脫臼處死后解剖，迅速取出肝臟、盲腸置于液氮內，并存放在－80 ℃冰箱，用于后續指標測定。

1.3.4 血清肝功能和血清炎癥因子指標檢測

小鼠血清中肝功能指標（TG、TC、ALT和AST）和血清炎癥因子（TNF-α和IL-6）的測定分別按照對應試劑盒說明方法進行。

1.3.5 肝功能過氧化指標檢測

快速稱取0.1 g肝臟，按1∶9體積比添加0.9%生理鹽水，并在冰水浴中將其完全研磨，勻漿結束后離心吸取上清液（4 ℃、5000 r/min，10 min）。根據試劑盒說明測定小鼠肝臟中ADH、MDA、T-SOD和GSH-PX的水平。

1.3.6 肝組織病理切片染色分析

將肝臟組織用10%福爾馬林溶液固定24 h以上，置于脫水盒中，用70%～100%乙醇溶液進行脫水處理，然后用二甲苯洗脫、石蠟包埋、切片。最后，用蘇木精和伊紅染色肝組織切片、封片，進行顯微結構觀察。

1.3.7 16S rDNA測序鑒定小鼠腸道菌群及功能分析

盲腸委托北京奧維森有限公司進行16S rDNA測序，使用Qiime和SPSS Statistics 25.0軟件對測序數據進行分析處理，使用Mothur軟件計算α多樣性，使用R語言軟件繪制物種累積圖和α多樣性指數箱形圖。對不同組的腸道菌群進行門和屬水平分析，通過LEfSe（linear discriminant analysis effect size）分析，找出具有顯著差異的物種。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 VVFP對小鼠體質量的影響

由表1可知，實驗期間空白組、模型組、陽性對照組以及不同劑量VVFP組的小鼠體質量均無顯著差異（P＞0.05）。實驗中小鼠毛色光亮，大小便正常，未出現食欲不振、消瘦等癥狀，說明本實驗所用的聯苯雙酯滴丸和VVFP對小鼠無毒害作用。

表1 VVFP對小鼠體質量的影響Table 1 Effect of VVFP on body mass of mice g

2.2 VVFP對肝損傷小鼠血清TG、TC濃度及ALT、AST活性的影響

小鼠血清TG、TC含量及ALT、AST活性都是反映肝損傷情況的重要指標，當肝細胞損傷時，這些指標在血清中的含量會異常升高。如圖1所示，與空白組相比，模型組小鼠血清的TG、TC濃度及ALT、AST活性均極顯著升高（P＜0.01），說明建模成功。灌胃大量酒精后，小鼠體內的代謝平衡被破壞，上述物質大量進入血液中使得血液中的含量升高。與模型組相比，陽性對照組以及不同劑量VVFP組小鼠血清的TG、TC濃度及ALT、AST活性均極顯著降低（P＜0.01），說明VVFP可以緩解酒精引起的代謝平衡。

圖1 VVFP對肝損傷小鼠血清TG、TC含量及ALT、AST活性的影響Fig.1 Effect of VVFP on serum TG,TC,ALT and AST levels in mice with liver injury

2.3 VVFP對肝損傷小鼠炎癥因子TNF-α和IL-6的影響

通過測定血清中炎癥因子的水平可確認VVFP是否具有保肝作用。如圖2所示，與空白組相比，模型組的小鼠血清炎癥因子TNF-α和IL-6水平均極顯著升高（P＜0.01），說明酒精肝損傷會引發小鼠肝臟炎癥反應。與模型組相比，陽性對照組以及不同劑量VVFP組小鼠血清炎癥因子TNF-α和IL-6水平均極顯著降低（P＜0.01），說明VVFP可以改善肝細胞的損傷程度。

圖2 VVFP對肝損傷小鼠炎癥因子TNF-α和IL-6的影響Fig.2 Effect of VVFP on TNF-α and IL-6 levels in mice with liver injury

2.4 VVFP對肝損傷小鼠肝臟ADH、MDA、T-SOD及GSH-PX水平的影響

如圖3所示，與空白組相比，模型組小鼠肝臟組織的ADH、T-SOD活力及GSH-PX含量極顯著降低（P＜0.01），MDA含量極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，VVFP處理組肝臟組織的ADH、T-SOD活力及GSH-PX含量均顯著升高，說明VVFP可以通過提高ADH、T-SOD活力及GSH-PX含量修復受損的肝臟。與模型組相比，VVFP處理組的肝臟組織的MDA含量極顯著降低，說明VVFP可以緩解脂質過氧化。以上結果進一步說明VVFP可以減輕酒精引起的肝損傷。

圖3 VVFP對肝損傷小鼠肝臟ADH、MDA、T-SOD及GSH-PX水平的影響Fig.3 Effect of VVFP on liver ADH,MDA,GSH-PX and T-SOD levels in mice with liver injury

2.5 VVFP對小鼠肝組織病理切片的影響

對小鼠肝組織病理切片和蘇木精-伊紅染色觀察，結果如圖4所示?？瞻捉M小鼠肝小葉及細胞核結構清晰，肝竇無明顯充血，無顯著病變狀況（圖4A）；模型組小鼠肝小葉及細胞核結構被破壞，排列紊亂，出現水腫現象（圖4B），這與Parikh等[26]描述的肝損傷時出現的癥狀相似，具有典型的病理特征，表明急性ALD建模成功。給藥后，與模型組相比，多肽低劑量組（圖4D）和高劑量組（圖4F）在不同程度上有所改善，肝小葉及細胞核結構較清晰、腫脹范圍減小，肝細胞排列紊亂現象減輕；陽性對照組（圖4C）和多肽中劑量組（圖4E）肝細胞形態趨于正常，排列整齊，呈放射狀分布，細胞損傷狀況明顯改善。肝組織病理學分析結果進一步證實VVFP對ALD小鼠肝臟細胞損傷有明顯的改善作用。

圖4 VVFP對小鼠肝組織病理切片的影響（×100）Fig.4 Effect of VVFP on histopathological sections of liver tissues in mice (× 100)

2.6 小鼠腸道菌群有效數據統計

對小鼠盲腸內容物腸道菌群測序進行數據分析，有效數據統計結果如表2所示。樣本的平均有效數據率為98.44%，說明腸道菌群測序的數據可靠，滿足后續分析要求。

2.7 小鼠腸道菌群α多樣性分析

α多樣性是通過單樣品的多樣性分析反映物種的豐度及多樣性。為了探究VVFP對ALD小鼠腸道菌群結構和組成的差異，通過Chao1、Observed_species、Shannon以及Simpson 4 個指標分析6 組之間的物種多樣性差異。

由圖5可知，模型組的Chao1和Observed_species指數均高于其他組，說明小鼠在短時間內大量飲酒會造成腸道菌群紊亂。在中劑量VVFP的干預下，ALD小鼠盲腸菌群豐度降低，更接近于正常水平，改善了ALD小鼠的腸道紊亂；模型組的Shannon指數均低于其他組，說明模型組的物種均勻度較低，在中劑量VVFP的干預下，ALD小鼠盲腸菌群的均勻度提高。由上述結果可知，VVFP的干預能夠改善因酒精影響而發生變化的腸道菌群多樣性。

圖5 腸道菌群α多樣性指數箱形圖Fig.5 α-Diversity indexes of intestinal microbiota

2.8 小鼠腸道菌群物種組成分析

如圖6所示，按門水平分類，小鼠腸道菌群主要由擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）和脫硫弧菌門（Desulfobacterota）組成?？瞻捉M的腸道菌群中擬桿菌門占50.83%，厚壁菌門占34.19%，脫硫弧菌門占7.34%；模型組腸道菌群中擬桿菌門占71.98%，厚壁菌門占21.24%，脫硫弧菌門占2.56%。與空白組相比，模型組的擬桿菌門菌群豐度上升，厚壁菌門和脫硫弧菌門的菌群豐度下降，說明小鼠經過酒精灌胃后，造成了腸道紊亂，與正常小鼠的差異較大。與模型組相比，陽性對照組與中劑量組的擬桿菌門菌群豐度下降，分別達到51.54%和57.26%；厚壁菌門的菌群豐度上升，分別為38.63%和31.73%，均接近正常的小鼠，說明中劑量的VVFP可以達到聯苯雙酯滴丸的干預效果，有效緩解ALD導致的腸道菌群紊亂。

圖6 門水平上微生物菌群的變化Fig.6 Changes in intestinal microbiota composition at the phylum level

小鼠腸道菌群在屬水平上主要由鏈霉菌屬（Streptomyces）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和弧菌屬（Vibrio）組成（圖7）。空白組、模型組、陽性對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組鏈霉菌屬占比分別為26.88%、40.81%、20.54%、23.90%、27.69%和23.46%；乳酸桿菌屬占比分別為22.39%、12.60%、28.02%、14.33%、14.50%和15.55%；弧菌屬占比分別為15.29%、13.14%、20.28%、21.93%、16.75%和12.89%；與空白組相比，模型組鏈霉菌屬菌群豐度上升，乳酸桿菌屬和弧菌屬菌群豐度下降，說明模型組小鼠的腸道菌群失調。經過中劑量VVFP的干預后，與模型組相比，鏈霉菌屬的菌群豐度下降，與空白組接近；乳酸桿菌屬和弧菌屬的菌群豐度在一定程度上有所上升，說明VVFP對患有急性ALD小鼠的腸道菌群有一定的調節功效。

圖7 屬水平上微生物菌群的變化Fig.7 Changes in intestinal microbiota composition at the genus level

2.9 小鼠腸道菌群LEfSe分析

LEfSe分析是一種通過多個分組之間的比較，從而找到組間在豐度上有顯著差異物種的方式，圖8展示了LDA score大于設定值3的差異菌屬，空白組中，有20 個差異菌種對菌群結構影響較大，主要是脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、脫疏弧菌科（Desulfovibrionaceae）、脫氧球菌綱（Desulfovibrionia）、脫硫弧菌目（Desulfovibrionales）和脫硫桿菌門（Desulfobacterota）等；模型組中主要是木桿菌科（Muribaculaceae）、擬桿菌門（Bacteroidota）和擬桿菌綱（Bacteroidia）等5 個差異菌種對菌群結構影響較大；在陽性對照組中，理研菌科（Rikenellaceae）對菌群結構影響最大，其次還有另枝菌屬（Alistipes）等11 個差異菌種具有影響；顫螺旋菌科（Oscillospiraceae）和普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae_NK3B31_group）是低劑量組中的重要菌種；中劑量組中變形菌綱（Gammaproteobacteria）是最顯著的差異菌種，其次是腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、大腸桿菌種（Escherichia_coli）和埃希氏菌-志賀氏菌屬（E._Shigella）等21 個差異菌種；高劑量組中主要有擬桿菌屬（Bacteroides）和類桿菌科（Bacteroidaceae）等11 個差異菌種對菌群結構影響較大。可以看出，在中劑量VVFP的干預下，小鼠腸道菌群的差異性相比于模型組明顯增加，基本恢復至空白組水平，表明VVFP在一定程度上可以修復酒精對腸道的損傷。

圖8 不同處理組菌群差異LEfSe分析柱狀圖Fig.8 LEfSe analysis of differential intestinal microbiota among different treatment groups

3 討論

現代醫學對ALD發病機制的研究已取得較大進步，脂質代謝異常、氧化應激、炎癥反應等被公認為ALD的重要影響因素[27]。ALD在代謝過程中引起的直接或間接的氧化應激、脂質過氧化作用以及多種因素（如腸道菌群失調）相互作用導致的腸道通透性增加[28-29]，對腸道黏膜造成損傷，影響腸道菌群數量，引起細菌和細菌內毒素的位移（經過腸道組織到達肝臟），最終導致肝臟炎癥。雖然通過服用藥物可以起到治療效果，但其毒副作用較大。大量的研究表明，食用菌肽具有豐富的藥理價值，對肝損傷有很好的保護和緩解功效，但對于VVFP的研究仍存在較多的空白。本研究以56°紅星二鍋頭灌胃小鼠建立急性ALD模型，探究VVFP對ALD的預防作用。結果顯示，模型組、陽性對照組以及不同劑量VVFP組小鼠與空白組小鼠體質量均無顯著性差異，說明VVFP無毒副作用。

肝臟是人體中唯一一個沒有痛感神經的器官，極易受有毒化學物質損傷，造成肝臟代謝功能紊亂[2]。在酒精代謝刺激下，肝臟出現氧化應激反應，肝細胞受損。ALT、AST水平是反映肝細胞損傷最直接和最敏感的指標，Dong Qingqing等[30]發現在健康肝臟中ALT、AST很高，而血液中含量很低，一旦肝臟細胞受損，大量ALT和AST會釋放到血清中使血清中含量升高，ALT與AST的水平在一定范圍內反映機體肝細胞的損傷程度。Reddy等[31]通過研究指出，當肝臟脂肪代謝出現能力出現障礙時，血清中TC和TG兩種代謝物含量會升高。湛莉等[32]認為，當肝臟受損時，會分泌大量的炎性細胞因子，尤其是TNF-α、IL-6，二者水平能反映肝細胞炎癥程度。本研究結果顯示，VVPF能極顯著降低血清中TG、TC、ALT和AST水平（P＜0.01），并能降低TNF-α、IL-6炎癥因子水平，說明VVFP可以減緩酒精引起的代謝紊亂。

在大量酒精的干預下，肝臟中脂肪酸的合成和代謝失去穩態平衡[33]。ADH、MDA、T-SOD和GSH-PX水平能夠較好地反映肝臟氧化程度[34]。韓光順等[35]探究茴香提取液對小鼠酒精性肝損傷的保護作用時發現，ADH活力能靈敏地提示肝細胞的損傷及損傷的程度；MDA含量可反映出機體脂質氧化水平，間接表明肝細胞的損傷程度[36]；Forrester等[37]研究發現T-SOD能夠清除過氧化產生的自由基從而調節代謝平衡；GSH-PX作為體內重要的抗氧化劑，可以清除活性氧[38]。本研究結果顯示，與模型組相比，VVFP能夠極顯著降低MDA含量（P＜0.01），明顯提高肝臟中ADH、T-SOD和GSH-PX水平，證實VVFP可以減輕酒精引起的肝損傷，提高人體防御系統的抗氧化活性，從而防止慢性酒精中毒對肝臟的損害。肝組織病理切片也進一步證實了VVFP的保肝活性。

基于16S rDNA高通量測序分析VVFP對ALD小鼠腸道菌群的影響。在VVFP的干預下，門水平上擬桿菌門菌群豐度下降，厚壁菌門的菌群豐度上升，這與韓琳[39]的研究結果一致。Li Koukou等[40]通過高通量測序分析發現，靈芝多糖S3降低了擬桿菌門的相對豐度，提升了厚壁菌門的相對豐度，顯著減輕了小鼠胰腺炎癥狀；在屬水平，VVFP降低了鏈霉菌屬的菌群豐度，增加了乳酸桿菌屬和弧菌屬的菌群豐度。乳酸桿菌是人體腸道內重要的益生菌，不僅可以分解代謝腸道內的益生元，還能維持免疫平衡，增強腸道屏障。范穎等[41]研究了大蒜多糖對ALD小鼠腸道菌群失調的影響，結果表明大蒜多糖組的多樣性指數和均勻度指數最高，優桿菌屬和乳酸桿菌屬細菌增多。上述結果表明，VVFP能夠改善ALD小鼠腸道菌群。

綜上所述，VVFP能極顯著降低血清中TG、TC、ALT、AST和肝臟中MDA水平，并且降低TNF-α與IL-6炎癥因子水平，同時明顯提高肝臟中ADH、T-SOD和GSHPX水平。此外，VVFP可通過調節擬桿菌門、厚壁菌門、鏈霉菌屬乳酸桿菌屬和弧菌屬的豐度減輕小鼠肝臟的損傷程度。本研究結果可為多肽在功能食品領域的應用提供藥效基礎。