紅茶菌發(fā)酵對天麻活性成分及感官品質的影響

王 迎，董明盛, ，張國強，韓月峰

（1.南京農業(yè)大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095；2.江蘇勤善堂健康產業(yè)有限公司，江蘇 南京 210042）

天麻是蘭科天麻屬植物天麻的干燥塊莖，為我國傳統的名貴中藥材，主產于中國貴州、四川、云南等地[1]。中醫(yī)學認為天麻具有平抑肝陽、祛風通絡的功效，臨床上主要用于治療風虛眩暈、頭疼等癥狀[2]。現代研究表明，天麻具有改善認知記憶，改善睡眠，調節(jié)血脂、血糖及血壓，改善肝損傷等功效[3]。天麻主要功效成分包括天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷等，其中對羥基苯甲醇是天麻素的苷元，也稱為天麻苷元。天麻素與對羥基苯甲醇對治療中樞神經系統疾病具有積極作用[4-5]，其作用機制包括調節(jié)神經遞質、抗氧化、抗炎等[6]。目前天麻已被納入藥食同源目錄（國衛(wèi)食品函〔2019〕311號），這為其作為保健食品開發(fā)提供了依據。在天麻產地，天麻主要食用方式包括用于燉肉、入菜、火鍋等，或者將鮮天麻炮制成天麻粉沖飲[7]，但對于沒有天麻食用習慣的消費者，直接食用往往難以接受天麻獨特的令人不愉快的藥材氣味（俗稱“馬尿臭”）[8]。

紅茶菌是一種歷史悠久的酸性保健飲料，它是以糖、茶、水為原料，主要經醋酸菌、酵母菌等多種微生物共同發(fā)酵而成[9]。紅茶菌發(fā)酵受共生微生物驅動，在發(fā)酵過程中會發(fā)生許多生物化學反應，主要包括醇、醛的形成，以及醇、醛向酸、酯的轉化，能產生豐富的營養(yǎng)功能性物質以及甜香的風味物質[10-11]，其主要代謝產物包括醋酸、乙醇、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、氨基酸、維生素等[12]。紅茶菌具有很多對人體有益的保健功能，包括清理腸胃、消除疲勞、增強食欲、幫助消化、防治高血壓和動脈硬化、預防和治療糖尿病，以及防癌抗癌、增強機體免疫力等[13-14]。

已有研究利用紅茶菌改善食品的不良氣味，如王旭冰[15]利用紅茶菌發(fā)酵技術對養(yǎng)殖的美國紅魚去腥，經紅茶菌發(fā)酵后，紅魚肉中的醛類、酮類、烷烴含量均相對減少，同時產生很多具有香氣的新醇類、醛類、烷烴類揮發(fā)性物質，在很大程度上減少了紅魚肉的腥味。Tu Chuanhai等[16]利用紅茶菌發(fā)酵豆腐黃漿水制備飲料，結果表明發(fā)酵不僅提高了黃漿水的功能性，而且賦予黃漿水令人愉快的果香。基于此，本研究利用紅茶菌對天麻進行發(fā)酵，期望改善天麻的不愉快氣味，為天麻食品深度開發(fā)和利用提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶菌由南京農業(yè)大學食品科學與技術學院微生物組實驗室保存，經宏基因組學分析表明紅茶菌菌群主要由醋酸菌、酵母菌、乳酸菌組成[17]；天麻片由江蘇勤善堂健康產業(yè)有限公司提供（試材經中藥材專家鑒定）；紅糖購自廣西馬山南華糖業(yè)有限公司；白糖為市售甘蔗白糖。

纖維素酶 上海吉至生化科技有限公司；苯酚、濃H2SO4、福林-酚 國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖、葡萄糖醛酸、沒食子酸、天麻素、對羥基苯甲醇標準品 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PEN-3型電子鼻 德國Airsense公司；TSQ 8000 Evo三重四極桿氣相色譜-質譜聯用儀 美國賽默飛世爾科技公司；1260型高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 紅茶菌接種液的制備

糖茶水的制備：10 g/L紅茶葉加入至100 g/L的白糖水中煮沸，過濾得到糖茶水。

紅茶菌接種液的制備：向糖茶水中加入體積分數為5%的紅茶菌菌液和30 g/L紅茶菌菌膜，放至30 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵10～15 d，得到紅茶菌接種液。

1.3.2 天麻發(fā)酵體系構建

將天麻片（干基）按料液比1∶10（g/mL）加入80 g/L的紅糖溶液中，121 ℃滅菌20 min，得到紅糖天麻溶液。

實驗組（EG組）：在紅糖天麻溶液中加入體積分數5%的紅茶菌發(fā)酵液以及0.3 g/L纖維素酶；對照組（CG組）：在紅糖天麻溶液中加入0.3 g/L纖維素酶。將實驗組與對照組放入30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，記錄發(fā)酵過程中天麻-紅茶菌發(fā)酵液理化性質和功能性物質的變化。

1.3.3 pH值與總酸質量濃度測定

每24 h取一次樣品，測定pH值。使用NaOH滴定法測定總酸質量濃度，計算公式如下：

式中：X為總酸質量濃度/（g/100 mL）；c為NaOH標準溶液的濃度/（mol/L）；V為滴定消耗NaOH標準溶液的體積/mL；V樣為樣品體積/mL；V0為樣品稀釋液總體積/mL；V1為滴定時吸取的樣品體積/mL；K為換算為主要酸的系數，即1 mmol氫氧化鈉消耗乙酸的質量，為0.060 g/mmol。

1.3.4 有機酸質量濃度測定

使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定[18]。發(fā)酵液使用0.22 μm有機濾膜過濾。色譜條件：Atlanis T3色譜柱，流動相為0.02 mol/L KH2PO4溶液（pH 2.6），流速0.4 mL/min，等度洗脫，柱溫30 ℃、檢測波長210 nm。

1.3.5 微生物生長動力學評價

使用平板涂布計數法對紅茶菌的微生物生長動力學進行評估。每24 h對發(fā)酵液取一次樣，對酵母菌、醋酸菌、乳酸菌分別進行平板涂布計數，細菌37 ℃生長24 h后計數，酵母28 ℃生長48 h后計數。微生物數量最后用lg（CFU/mL）表示。

1.3.6 總糖質量濃度測定

采用苯酚-硫酸法[19]。使用孔徑為1～3 μm的慢速濾紙過濾發(fā)酵液，之后對濾液進行稀釋，取稀釋液1.0 mL加入5.0 mL濃H2SO4和1.0 mL質量分數5%的苯酚溶液，100 ℃水浴15 min后在490 nm波長處測定吸光度，代入標準曲線中計算總糖質量濃度。

1.3.7 多酚與黃酮質量濃度測定

樣品中總多酚質量濃度測定參考王淑珍等[20]的方法。取200 μL樣液加入試管中，再依次加入800 μL去離子水、200 μL福林-酚試劑，振搖混勻，避光保存6 min，再加入2 mL質量分數為7%的Na2CO3溶液和1.6 mL去離子水，避光條件下放置90 min，于760 nm波長處測定吸光度，代入標準曲線計算總酚質量濃度。

樣品中總黃酮含量測定參照Juan等[21]的方法。取5.0 mL樣液加入試管中，加入0.3 mL質量分數為5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，再加入0.3 mL質量分數為5%的Al(NO3)3，搖勻，靜置6 min，再加入4.0 mL質量分數為4%的NaOH溶液、0.4 mL體積分數30%的乙醇溶液，混勻，放置12 min后于510 nm波長處測定吸光度，代入標準曲線計算總黃酮質量濃度。

1.3.8 天麻素與對羥基苯甲醇含量測定

參照Liu Yang等[22]的方法，使用0.22 μm有機濾膜過濾發(fā)酵液后進行HPLC測定。HPLC條件：色譜柱為Thermo BDS C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為乙腈-體積分數0.1%的H3PO4溶液（體積比為3∶97）；流速0.1 mL/min；檢測波長為220 nm；柱溫25 ℃；進樣10 μL。

1.3.9 感官分析

1.3.9.1 揮發(fā)性成分測定

采用PEN-3便攜式電子鼻對實驗組與對照組發(fā)酵5 d的樣品進行揮發(fā)性成分的初步分析。取5 mL樣品放置于20 mL頂空瓶中，60 ℃水浴30 min后進行檢測[23]。結果參照表1對兩組發(fā)酵液進行氣味分析。

表1 電子鼻傳感器物質響應類型Table 1 Performance description of the sensor arrays of the PEN-3 electronic nose

采用固相微萃取-氣相色譜-質譜（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）法對發(fā)酵液的揮發(fā)性成分進行分析[24]。取樣品5 mL置于SPME采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex萃取頭的手動進樣器，在60 ℃平板頂空萃取60 min后，移出萃取頭并立即插入GC儀進樣口（溫度250 ℃）中，熱解吸進樣。氣相色譜條件：HP-5MS（60 mm×0.25 mm，0.25 μm）彈性石英毛細管色譜柱，初始溫度40 ℃，維持2 min，以6 ℃/min升溫至280 ℃；氣化室溫度250 ℃；載氣為高純He（99.999%）；載氣流量1.0 mL/min，不分流。質譜條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度280 ℃；質量范圍29～500 amu。通過質譜計算機數據系統對總離子流圖中的各峰進行檢索及核對NIST數據庫，對揮發(fā)性成分進行定性分析。

1.3.9.2 感官評價

對發(fā)酵5 d的實驗組與對照組進行感官評價，感官評價標準見表2。

表2 天麻-紅茶菌飲料感官評價標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of Gastrodia elata beverage fermented with Kombucha consortium

1.4 數據處理與統計

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵過程中的微生物數量變化

紅茶菌發(fā)酵天麻的微生物菌群主要包括醋酸菌、酵母菌以及乳酸菌3 類，對3 種微生物數量進行計數，結果見圖1。發(fā)酵初始，醋酸菌、酵母菌、乳酸菌的數量分別為6.35、6.02、5.64（lg（CFU/mL））。發(fā)酵2 d，醋酸菌的數量逐漸增加，增至最大值8.33（lg（CFU/mL）），隨后又逐漸降低至7.12（lg（CFU/mL））（5 d）。發(fā)酵3 d，酵母菌與乳酸菌數量均逐漸增加，分別增長至8.84（lg（CFU/mL））和7.38（lg（CFU/mL））；發(fā)酵5 d，二者分別逐漸減少至7.27、6.80（lg（CFU/mL））。紅茶菌天麻在發(fā)酵初期，其醋酸菌數量高于酵母菌與乳酸菌；發(fā)酵2 d，醋酸菌含量逐漸減少，發(fā)酵第3天，酵母菌與乳酸菌數量顯著增加，并且酵母菌數量超過醋酸菌數量；到發(fā)酵后期，微生物數量均相應降低，可能是可利用有機物的減少所致。

圖1 微生物數量在發(fā)酵過程的變化Fig.1 Changes in microbial load during fermentation

由圖2a可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，實驗組的pH值逐漸降低，由4.40降至3.41，變化幅度較大；對照組的pH值最高為4.45，最低為4.35，pH值變化不顯著。由圖2b可以看出，實驗組的總酸質量濃度隨著發(fā)酵時間延長逐漸增加，由29.76 g/100 mL增加到64.14 g/100 mL，并且在發(fā)酵1～2 d顯著增加，推測發(fā)酵前期醋酸菌為發(fā)酵主要菌群。對照組總酸質量濃度在34.10～42.58 g/100 mL之間波動，變化幅度相對于實驗組來說較小。結合pH值與總酸含量變化可以看出，在紅茶菌發(fā)酵過程中，由于微生物作用，會產生大量的酸，導致發(fā)酵液的pH值降低，也進一步影響發(fā)酵液的理化性質與感官品質。

圖2 不同發(fā)酵時間pH值（a）和總酸含量（b）的變化Fig.2 Changes in pH (a) and total acid content (b) during fermentation

2.2 發(fā)酵過程中有機酸含量變化

紅茶菌發(fā)酵過程中會產生大量的有機酸，包括乙酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸等。如表3所示，在發(fā)酵過程中，乙酸與琥珀酸質量濃度分別由4.12、11.37 g/L增長至20.43、45.24 g/L。與發(fā)酵前2 d相比，第3、4、5天的發(fā)酵液中乙酸含量顯著提高（P＜0.05），發(fā)酵5 d增長為原來的4.96 倍；琥珀酸質量濃度在發(fā)酵第5天達到最高值，為原來的3.98 倍；并且發(fā)酵第4、5天的含量顯著高于發(fā)酵前3 d。其次是酒石酸和乳酸，發(fā)酵5 d酒石酸質量濃度增長了2.55 g/L，乳酸質量濃度增長了4.42 g/L。蘋果酸在發(fā)酵過程中含量較穩(wěn)定，質量濃度在2.07～2.70 g/L之間。葡萄糖醛酸作為一種大分子酸，其質量濃度在發(fā)酵過程中有所下降，由36.80 g/L下降至27.54 g/L，主要在發(fā)酵第1天和第3天之間變化顯著，發(fā)酵3～5 d之間變化不顯著。

表3 不同發(fā)酵時間紅茶菌發(fā)酵天麻的有機酸質量濃度變化Table 3 Changes in organic acid concentration during fermentation of G.elata with Kombucha consortium g/L

紅茶菌中醋酸菌作為主要菌株之一[11]，能夠利用有機物產生大量乙酸，因此乙酸的質量濃度增長幅度較大。琥珀酸在發(fā)酵過程中也出現大幅度增長的情況，由于天麻本身含有琥珀酸[25]，在微生物發(fā)酵的作用下，其質量濃度也逐漸升高。紅茶菌中含有較多的葡萄糖醛酸，因此其在發(fā)酵初始階段的含量較高，而在紅茶菌發(fā)酵初期，微生物會利用葡萄糖醛酸中的糖基[26]，因此，其含量隨之降低。發(fā)酵液中乳酸、酒石酸、蘋果酸等有機酸會改善發(fā)酵液的風味，增加發(fā)酵液的營養(yǎng)成分。

2.3 發(fā)酵過程中天麻活性成分變化

2.3.1 發(fā)酵對天麻總糖的影響

在紅茶菌發(fā)酵過程中，微生物可利用多糖進行代謝[27]。從圖3可知，實驗組總糖質量濃度在紅茶菌的作用下，由104.56 g/L降至60.57 g/L，消耗了43.99 g/L；對照組的總糖質量濃度在99.15～112.36 g/L之間。紅茶菌中的醋酸菌、乳酸菌、酵母菌均可利用糖類進行代謝活動，因此，在發(fā)酵過程中，糖類有利于微生物產生多種代謝產物，比如有機酸、乙醇等。

圖3 不同發(fā)酵時間紅茶菌-天麻總糖含量變化Fig.3 Changes in total sugar concentration during fermentation of G.elata with Kombucha consortium

2.3.2 發(fā)酵過程中多酚與黃酮含量變化

多酚與黃酮是天然的抗氧化劑，其含量影響發(fā)酵液的抗氧化性[28]。紅茶菌發(fā)酵天麻會導致發(fā)酵液的多酚與黃酮含量發(fā)生變化。通過表4可知，實驗組發(fā)酵1 d多酚質量濃度并沒有發(fā)生顯著變化，發(fā)酵2～5 d，不同發(fā)酵時間之間的多酚質量濃度均有顯著差異（P＜0.05），并且總酚質量濃度隨著發(fā)酵時間的延長逐漸增加，由685.78 mg/L增加到1070.09 mg/L。對照組的總酚質量濃度在部分發(fā)酵時間之間也存在顯著差異，總體來看，其總酚質量濃度在714.07～792.27 mg/L之間變化，變化幅度相對于實驗組較小。

表4 不同發(fā)酵時間多酚與黃酮的含量Table 4 Total phenolic and flavonoid contents during fermentation

黃酮質量濃度在發(fā)酵過程中變化明顯。實驗組發(fā)酵2～4 d，其黃酮質量濃度顯著增加，發(fā)酵初始黃酮質量濃度為171.08 mg/L，發(fā)酵后達到最大值245.25 mg/L，增長74.17 mg/L；對照組的黃酮質量濃度總體變化不顯著，發(fā)酵時間對黃酮質量濃度影響較小，最大值為184.83 mg/L，最小值為169.42 mg/L。

2.3.3 發(fā)酵過程中天麻素和對羥基苯甲醇質量濃度變化

由圖4可知，天麻經紅茶菌發(fā)酵后，發(fā)酵液中的天麻素與對羥基苯甲醇（天麻苷元）質量濃度發(fā)生明顯變化。發(fā)酵前2 d，實驗組的天麻素質量濃度變化幅度較小，從第3天開始，天麻素質量濃度大幅降低，天麻素質量濃度由835.68 μg/mL降至11.04 μg/mL；對羥基苯甲醇從第3天開始有明顯增加趨勢，發(fā)酵初始質量濃度為78.05 μg/mL，發(fā)酵5 d達到最大值456.66 μg/mL，為初始質量濃度的5.85 倍。對照組的天麻素與對羥基苯甲醇質量濃度分別維持在712.58～891.62 μg/mL和94.86～191.97 μg/mL之間，與實驗組的變化幅度相比，總體變化不顯著，其質量濃度的變化可能是發(fā)酵過程中天麻釋放部分對羥基苯甲醇導致。實驗組的天麻素與對羥基苯甲醇的總質量濃度降低。天麻素屬于小分子酚型糖苷類化合物，部分天麻素經微生物作用后，分解產生對羥基苯甲醇，還有巴利森苷等小分子物質[29]。因此，發(fā)酵過程中，紅茶菌不但會利用多糖，還會利用天麻素中的葡萄糖基，分解產生小分子物質，導致其含量大大減少。

圖4 發(fā)酵過程中天麻素與對羥基苯甲醇含量變化Fig.4 Changes in gastrodin and gastrodigenin contents during fermentation

2.4 感官評價分析

2.4.1 電子鼻分析紅茶菌天麻發(fā)酵液揮發(fā)性成分

紅茶菌發(fā)酵會改變發(fā)酵液的風味，改善天麻不愉快氣味。經電子鼻分析，實驗組發(fā)酵5 d的風味相較于對照組更加明顯（圖5）。其中，發(fā)酵液對W1S（甲基類化合物）、W5S（氮氧化合物）的響應值最大，其次是W2W（芳香成分、有機硫化物）、W2S（醇類、醛酮類化合物）、W1W（硫化物），其余響應值整體沒有明顯變化。這說明紅茶菌-天麻經發(fā)酵后，短鏈烷烴如甲烷、氮氧化合物、芳香物質、醇、醛、酮等物質含量顯著增加，導致實驗組與對照組風味存在明顯差異，使得發(fā)酵液風味更加濃郁。

圖5 電子鼻分析紅茶菌-天麻發(fā)酵液雷達圖Fig.5 Radar map for electronic nose responses to G.elata fermented with Kombucha consortium

2.4.2 SPME-GC-MS分析紅茶菌天麻發(fā)酵液揮發(fā)性成分

使用SPME-GC-MS對發(fā)酵5 d的天麻-紅茶菌實驗組和對照組的揮發(fā)性物質進行分析，共鑒定出39 種揮發(fā)性物質。由表5可以看出，發(fā)酵后，實驗組與對照組的揮發(fā)性物質存在明顯區(qū)別，醇類、酯類等物質相對含量明顯增加，它們能增加發(fā)酵液的風味。其中實驗組的乙醇（20.99%）、異戊醇（3.18%）、苯乙醇（9.70%）、2,3-環(huán)氧-1-丁醇（2.81%）是主要醇類物質，這些物質含量的增加使發(fā)酵液具有明顯的酒香味。

表5 紅茶菌天麻發(fā)酵液的揮發(fā)性物質及其相對含量分析Table 5 Relative contents of volatile compounds in G.elata fermented with Kombucha consortium

天麻經紅茶菌發(fā)酵后，主要變化的酯類物質有乙酸苯乙酯（4.67%）、己酸苯乙酯（1.73%）、辛酸乙酯（11.37%）、癸酸乙酯（2.58%）等，這些酯類物質相對含量相較于對照組明顯增加，使發(fā)酵液具有明顯的果香味。而對照組中主要的風味物質是檸檬烯-6-醇特戊酸酯（55.10%），發(fā)酵后，該物質相對含量大大降低，推測該物質為天麻本身風味物質，發(fā)酵過程中被微生物降解。

烷烴類、酸類、酮類物質經發(fā)酵后，相對含量也發(fā)生變化。發(fā)酵后6-甲基十八烷（6.49%）、2,6,10-三甲基十四烷（4.33%）、2,6-二甲基十一烷（1.21%）這3 種主要的烷烴物質明顯增多；經發(fā)酵后乙酸（2.79%）、丙二酸（2.18%）相對含量也明顯增加。對照組的丙酮相對含量為6.46%，發(fā)酵后未檢測到丙酮，丙酮具有辛辣味，發(fā)酵改善天麻的風味。除此之外，實驗組發(fā)酵液中檢測到的百里香酚（14.00%）也賦予其辛香味；并且2,4-二叔丁基酚相對含量經發(fā)酵后由11.25%降至0.39%，該風味物質的減少也能夠改善天麻的不愉快氣味。

2.4.3 感官評價

由圖6可以看出，經紅茶菌發(fā)酵后，實驗組的口感、滋味、氣味評分均優(yōu)于對照組，色澤與組織狀態(tài)上差別不大，均為棕色較清澈的液體，有少量沉淀。實驗組有明顯的甜香氣，酸與醇味相協調，酸甜適中，而且?guī)缀趼劜怀鎏炻榈牟挥淇煳叮瑯O大地改善天麻的可接受性，提高食用愉悅感。

圖6 天麻-紅茶菌飲料感官評價雷達圖Fig.6 Radar map for sensory evaluation of G.elata fermented with Kombucha consortium

3 結論

研究紅茶菌液態(tài)發(fā)酵天麻后，發(fā)酵液性質的變化以及功能性物質的產生情況。結果表明天麻經過液態(tài)發(fā)酵，其營養(yǎng)、功能、感官性能方面都大大提升。紅茶菌的發(fā)酵使發(fā)酵液中的有機酸更加豐富，其中乙酸與琥珀酸的質量濃度增長為原來的4.96 倍和3.98 倍。發(fā)酵減少天麻中的天麻素含量，但提升了對羥基苯甲醇功能性成分的含量，為原來的5.85 倍。經發(fā)酵后，天麻的總多酚、總黃酮質量濃度也分別達到1070.09 mg/L和245.25 mg/L，與未發(fā)酵對照組比較，分別增加至原來的1.56 倍和1.43 倍，有利于提升其抗氧化性。對揮發(fā)性物質進一步分析，共檢測出39 種揮發(fā)性物質，表明天麻-紅茶菌發(fā)酵液具有較豐富的風味，在一定程度上能夠改善天麻的不愉快氣味。并且經過感官評價，也證實天麻-紅茶菌飲料具有較優(yōu)良的風味。總地來說，對紅茶菌發(fā)酵天麻的研究有助于進一步開發(fā)新型天麻食品，并深入探究其潛在的功能價值。