多頻復合超聲真空煮制對鹵牛肉肌纖維結構及保水性的影響

蔡華珍，戴泓宇，陳建功，陸楷懿，馮騰迅，周 頔，陳 楊

（滁州學院生物與食品工程學院，安徽 滁州 239000）

鹵牛肉是大眾喜愛的傳統肉制品，目前普遍采用傳統常壓熱加工制作，鹵煮環節多采用夾層鍋中溫（99～100 ℃）鹵制，但鹵制后肉質容易發柴，鹵制中蒸汽等排放對環境不友好、能耗增加[1]。超聲波處理作為一種綠色非熱加工技術，具有工藝簡單、效率高、綠色節能環保等優點，廣泛應用于食品加工、食品改性、食品分析等方面[2-3]。在肉制品加工中，功率超聲波能夠破壞肌纖維蛋白結構，改善其功能特性[2]，在肉類嫩化、腌制、烹飪等方面發揮作用[4]。功率超聲波與其他技術聯合具有良好的協同增效作用，超聲波（40 kHz）與氯化鈣聯合處理牛肉，超聲作用可促進肌纖維中鈣離子向肌纖維內部運動，使得鈣激活酶亞基發生更大程度的降解，導致肌纖維骨架蛋白結構降解，從而使牛肉顯著嫩化[5]；研究表明，超聲（28 kHz）協同真空鹵煮牛肉可降低蛋白質二級結構中α-螺旋含量，增加β-折疊含量，并出現了19.84%的無規卷曲，而單獨超聲鹵煮組、真空鹵煮組則未見無規卷曲結構[6]。此外，超聲處理能夠改變肉中水分分布，有利于提高產品品質和產品得率[7]。

單頻超聲易形成駐波，存在聲場分布不均等問題，多頻復合超聲具有多頻率、多層次、多方向等特點，可消除駐波，使輻射能量更加均勻，產生的空化效應、剪切效應、微擾作用等顯著強于單頻超聲，因此其化學產額高于甚至遠高于單頻超聲[8-9]。早在20世紀90年代，馮若等[8]研究發現，28 kHz與0.87 MHz的雙頻正交輻照系統的空化產額遠大于兩個單頻超聲輻照產額之和，多頻復合超聲在食品加工等領域應用具有顯著優勢，這種優勢在后來的研究中均得到證實[10-12]。真空低溫熱加工具有改善食品品質、減少營養素損失、安全環保等優勢[13-15]，多頻超聲協同真空煮制牛肉技術鮮見報道，本研究基于多頻超聲波及真空的特點，探討其對鹵牛肉肌纖維結構及保水性的影響，以期為醬鹵肉制品的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍牛腱子肉購自安徽徽食食品有限公司；食鹽、味精、冰糖、料酒、醬油等調味料，八角、桂皮等香辛料均購自當地農貿市場。

氯化鉀、氯化鎂、鹽酸、氯化鈉 國藥集團化學試劑有限公司；磷酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉天津市科密歐化學試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt-2Na，EDTA-2Na）西隴化工股份有限公司；偏磷酸、戊二醛 上海麥克林生化科技股份有限公司；氫氧化鈉、硫酸銅 南京化學試劑股份有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

智能超聲真空煮制鍋 滁州學院動物性食品綠色加工團隊自行設計開發；ME55/02分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TA.XT-plus物性儀 英國Stable Micro Systems公司；Chirascan圓二色光譜儀英國Applied Photophysics公司；UV-27001紫外-可見分光光度計 日本島津公司；JSM-6510LV掃描電子顯微鏡日本電子株式會社；NMI20-015V低場核磁共振儀上海紐邁電子科技有限公司；H3-20KR臺式高速冷凍離心機 湖南可成儀器設備有限公司；MIX-2500迷你混合儀 杭州佑寧儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制作

工藝流程：牛腱子肉→解凍→清洗→切塊→超聲真空低溫鹵制→鹵牛肉樣品。

選取冷凍牛腱子肉于密封袋中，自來水浸泡解凍至－5～－3 ℃，將牛肉切成約20 mm×20 mm×20 mm塊狀，用流水清洗表面血水，取組織結構相似的肉塊作為原料，每塊質量約40 g，將處理好的牛肉塊與含鹽量為2.5%、溫度約18 ℃的鹵湯按肉液比1∶5（m/m）先后加入智能超聲真空煮制鍋中制備鹵牛肉。

超聲真空煮制鍋結構：圓柱形鍋體（10 L），在圓柱形側面上區域排布頻率為40/52/68 kHz振子，各頻率振子分別占120°弧面區域，相同頻率振子豎向并聯排布在一起；各頻率超聲波最大功率1200 W，大小可調，設備超聲波總功率3600 W；采用底部加熱；鍋蓋上安裝有溫度探頭，抽真空裝置，以及冷凝液回流裝置。鍋蓋開關、超聲波頻率與功率、溫度、真空度等控制采用PLC自動控制。

真空煮制時，自動開蓋，加入待煮制牛肉和鹵湯，設置好各參數，自動關閉鍋蓋啟動運行，至煮制結束。

1.3.2 鹵煮實驗設計

鹵煮參數設置：真空度－0.043 MPa，鹵煮溫度85 ℃，升溫速率4.75 ℃/min，超聲波總功率900 W，其中三頻、二頻的功率比分別為1∶1∶1和1∶1，超聲頻率分組：三頻復合超聲組（40/52/68 kHz）、雙頻復合超聲組（40/52、40/68、52/68 kHz），以單頻超聲組（40、52、68 kHz）和未超聲真空組（0 kHz）為對照，復合超聲是指2 種或2 種以上頻率同時工作的模式（復合超聲組合的個數，簡稱復合超聲頻數或復合頻數）。超聲真空鹵煮為3 個連續階段：室溫真空超聲10 min；85 ℃真空煮制90 min；85 ℃超聲真空10 min，獲得鹵牛肉樣品，冷卻至室溫，取樣測定鹵牛肉的肌原纖維小片化指數（myofibril fragmentation index，MFI）、蛋白質二級結構、微觀結構、質構、水分分布以及蒸煮損失率與出品率，研究多頻復合超聲輔助真空煮制對鹵牛肉肌纖維結構及保水性的影響。

1.3.3 MFI測定

采用文獻[16]方法略作修改。取1 g處理后的牛肉加入20 mL 4 ℃的預冷緩沖液（0.1 mol KCl、0.02 mol/L K3PO4、0.001 mol/L MgCl2、0.001 mol/L EDTA，pH 7.1），勻漿2 次，每次15 s，中間間隔10 s。然后以1000 r/min離心15 min，去上清液，重懸，離心4 次。之后再將沉淀重懸，用雙縮脲法測定蛋白質量濃度，稀釋至0.5 mg/mL，在540 nm波長處測定吸光度。MFI為該吸光度乘以200。

1.3.4 蛋白質二級結構測定

參考申輝[17]方法并略作修改，采用圓二色光譜分析鹵牛肉肌原纖維蛋白二級結構。提取肌原纖維蛋白后，用溶劑將提取的蛋白質溶液稀釋至0.1 mg/mL，取200 μL稀釋后的蛋白溶液加入石英比色皿（1 mm）中，使用圓二色光譜儀在（24±1）℃條件下掃描，掃描波長范圍190～240 nm，掃描速率為5 nm/min。每個樣品掃描3 次，結果為3 次掃描的平均值并扣除相應溶劑背景。在獲得圓二色光譜后，利用二級結構分析軟件CNDD對數據進行分析，計算各條件下肌原纖維蛋白二級結構的相對含量。

1.3.5 微觀結構觀察

采用文獻[1]方法并略作修改。在距鹵牛肉表面2～3 mm處切取約8 mm×4 mm×2 mm大小的肉塊，在4 ℃用體積分數2.5%戊二醛溶液浸泡24 h。然后用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.3）清洗3 次，每次10 min，在27 ℃環境中放置2 h后用蒸餾水沖洗，再分別使用體積分數25%、50%、70%、96%的乙醇溶液及無水乙醇梯度脫水2 次（乙醇溶液每次15 min、無水乙醇每次1 h），再冷凍干燥備用。

電鏡掃描：將凍干鹵牛肉塊用導電膠帶粘到樣品處理臺上，抽真空、噴金后，于掃描電子顯微鏡上進行掃描。掃描條件：工作電壓20 kV，工作距離13 mm，放大200 倍。

1.3.6 質構特性測定

參考文獻[18]方法并略作修改，將加工后的鹵牛肉，切成10 mm×10 mm×10 mm的正方體小塊，采用探頭P/36R、測前速率1.00 mm/s、測中速率4.00 mm/s、測試后速率4.00 mm/s、測試間隔時間5 s、壓縮比30%進行測定。

1.3.7 水分分布的測定

采用文獻[19]方法，樣品橫向弛豫時間（T2）測定：剔除樣品表面筋腱，使其結構盡量一致，稱取20 g樣品放入直徑25 mm的核磁管中進行檢測，測試條件：共振頻率23.315 MHz，磁體溫度32 ℃，90°脈沖時間22 μs，180°脈沖時間40 μs，采樣點數149494，重復掃描次數32，回波數5000，回波時間0.31 ms，使用核磁共振分析軟件及CPMG序列采集牛肉樣品T2信號，反演后，對所有數據進行歸一化處理。T2分布曲線縱坐標信號強度除以相應樣品質量得到歸一化T2分布曲線。

1.3.8 蒸煮損失率測定

采用文獻[6]方法并略作修改，初始牛肉塊質量記為m1/g，鹵煮過程中的質量變化記為Δm，鹵煮后的鹵牛肉質量記為m2/g，通過下式計算質量變化率：

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 多頻復合超聲輔助真空煮制對牛肉MFI的影響

MFI是表征肌原纖維斷裂程度的參數，是衡量肉類嫩度的重要指標之一[20]。如圖1所示，各處理組MFI大小為三頻＞雙頻＞單頻＞未超聲組，不同復合頻數間的MFI差異顯著（P＜0.05）。在雙頻超聲處理組中，雙頻之和較低的MFI（40/68 kHz）顯著高于雙頻之和較高的MFI（52/68 kHz）（P＜0.05）；在單頻超聲處理組中，隨著頻率增加，MFI呈下降趨勢，其中40 kHz與68 kHz之間差異顯著（P＜0.05）。結果表明，超聲處理能顯著破壞牛肉肌纖維結構，隨著復合頻數的增加，頻率復合效應愈加顯著，其破壞程度亦愈大。隨著復合頻數的增加，超聲聲場分布更加均勻、無空化死角，頻率復合的疊加效應增強了空化效應和機械作用，更能引起牛肉蛋白質結構的變化[21-22]，因而三頻復合超聲的MFI最大；這與Feng Ruo等[23]的研究結果一致。李倩[24]比較不同頻率超聲波對淀粉結構的影響發現，隨著復合頻數的增加，超聲產生的空化事件越來越多；單頻超聲時，隨著超聲波頻率的增大，空化閾值隨頻率的增大而增大，空化事件減少[25-26]，因而隨著超聲頻率的增加對肌纖維的破壞減小，MFI相應減小。

圖1 多頻復合超聲輔助真空煮制鹵牛肉的MFIFig.1 Effect of multifrequency ultrasound-assisted vacuum cooking on MFI of stewed marinated beef

2.2 多頻復合超聲輔助真空煮制對牛肉蛋白質二級結構的影響

蛋白質二級結構是多肽鏈通過氫鍵沿一定方向盤旋、折疊而形成有規則的重復構象，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲結構[27]。由圖2可知，各處理組牛肉肌原纖維蛋白質在波長208 nm和222 nm附近有兩個強負吸收峰，這是α-螺旋結構的特征吸收峰[28-29]，該特征吸收峰峰形隨著超聲波頻數的增加漸趨平緩。

圖2 多頻復合超聲輔助真空煮制鹵牛肉的蛋白質二級結構Fig.2 Effect of multifrequency ultrasound-assisted vacuum cooking on secondary structures of protein in stewed marinated beef

利用軟件進一步定量分析，由表1可知，隨著復合超聲頻數的增加，α-螺旋、β-折疊含量均呈下降趨勢，其含量排序為未超聲組＞單頻＞雙頻＞三頻，而β-轉角、無規卷曲含量的趨勢則相反，其中，三頻組與雙頻組比較，除了β-轉角含量差異不顯著外，其他二級結構含量均差異顯著（P＜0.05）；在三頻組與單頻組間，除了β-轉角含量差異顯著外（P＜0.05），其他二級結構含量的差異均達極顯著水平（P＜0.01）；三頻組與未超聲對照組相比差異尤其凸顯，三頻組的α-螺旋含量只有未超聲對照組的39.3%，β-折疊含量約是未超聲對照組的38.7%，同時，三頻組的β-轉角、無規卷曲含量大幅上升，分別是未超聲對照組的1.76、3.28 倍。結果表明，超聲處理能減弱/破壞維持α-螺旋、β-折疊結構穩定的氫鍵，并轉變為β-轉角和無規卷曲，使肌原纖維蛋白結構從有序逐漸轉向無序[30-31]，多頻率復合加劇了空化效應、機械振動，產生了大量氣泡，真空下靜壓力下降，降低了空化閾值，加劇氣泡內爆，從而增加了空化效應和機械作用的強度，加強了對肌纖維蛋白結構的破壞[25]，因此，多頻復合超聲處理組的α-螺旋、β-折疊結構含量遠低于真空未超聲對照組，而無規卷曲和β-轉角含量則大大增加。

表1 多頻復合超聲真空煮制鹵牛肉的二級結構含量Table 1 Effect of multifrequency ultrasound-assisted vacuum cooking on contents of protein secondary structures in stewed marinated beef

2.3 多頻復合超聲輔助真空煮制對牛肉微觀結構的影響

由圖3可見，未超聲對照組肌纖維排列緊密而規整，而所有超聲組的肌纖維均出現裂縫，并且隨著復合頻數的增加，肌纖維表面結締組織附屬物逐漸減少甚至消失、光潔度增加，肌纖維出現分離、斷裂現象，尤其是三頻超聲組，肌纖維斷裂明顯。這種現象的出現是超聲作用的結果，且頻率效應顯著，由于肌纖維被結締組織包圍成肌束聚集在一起[32]，超聲真空煮制過程中，超聲的空化效應、機械效應、微擾效應、湍動效應等[9,33]均會加快傳熱、傳質[1]，加快結締組織分解[34]，這與鄒云鶴[35]的研究結果一致，復合超聲頻數的增加加速了這種進程。

圖3 多頻復合超聲真空煮制鹵牛肉的微觀結構Fig.3 Effect of multifrequency ultrasound-assisted vacuum cooking on microstructure of stewed marinated beef

2.4 多頻復合超聲輔助真空煮制對牛肉質構特性的影響

如表2所示，超聲波處理對鹵牛肉質構特性有很大影響，隨著復合超聲頻數的增加，其硬度、咀嚼性、內聚性隨之降低，不同復合頻數的硬度、咀嚼性、內聚性大小排序均為三頻＜雙頻＜單頻＜未超聲組，其中多頻組的硬度、咀嚼性大幅下降，三頻組的硬度、咀嚼性降幅最大，分別降為雙頻組的87%、65.8%，單頻組的61.7%、52%，只有未超聲對照組的40.7%、40.3%；內聚性雖然也呈降低趨勢，但總體降幅不明顯，各組間僅多頻組的降幅與未超聲對照組間差異顯著（P＜0.05），這些結果說明，多頻超聲比單頻超聲產生的機械作用更強烈，對蛋白質的影響更大[22-24]，使其剛性結構減弱，因而鹵牛肉硬度大幅度降低，MFI以及二級結構的研究結果也證實了這點，但是由于多頻復合超聲引起蛋白質與水結合力的增強，抵消了部分機械作用引起的蛋白纖維結合力減弱，因而其內聚性雖然降低，但降幅不大。彈性隨復合頻數的增加有增大趨勢，總體增幅不大，但三頻組（40/52/68 kHz）、雙頻（40/52 kHz）組與未超聲對照組間均有顯著差異（P＜0.05），其他各組間差異不顯著（P＞0.05）。超聲對蛋白質結構的破壞，使更多的親水基團暴露到蛋白質表面，增加了蛋白質與水的相互作用[36]，此外，肌纖維的破壞增加了肉與水的結合幾率，因而彈性增加[20,35]。

2.5 多頻復合超聲輔助真空煮制對牛肉保水性的影響

2.5.1 水分分布

肉中水分的存在狀態與產品品質、出品率有關。肉中水分以自由水、不易流動水（準結合水）、結合水3 種狀態存在[32]，水分子的不同存在狀態可以通過低場核磁的弛豫時間T2反映。一般肉中與T2對應水分3 種存在狀態為結合水（T210～1 ms）、不易流動水（T221～100 ms）、自由水（T23＞100 ms），P21、P22、P23是與T2對應3 種不同狀態水分含量的峰面積[19]。圖4為多頻復合超聲與對照組的弛豫時間。由表3可見，超聲處理對鹵牛肉的T2影響顯著，與未超聲對照相比，各超聲處理組的T2均比未超聲處理組短，且均向左遷移。其中，三頻超聲處理組向左遷移幅度最大，雙頻超聲處理組次之，單頻超聲處理組左遷最少，結果表明，超聲處理增加了肉與水的結合力，這與高飛[6]研究結果一致，這種變化存在顯著的頻率效應，復合超聲頻數越多效應越顯著，肉與水的結合越緊密。

圖4 多頻復合超聲真空煮制鹵牛肉水分的T2分布Fig.4 Effect of multifrequency ultrasound-assisted vacuum cooking on distribution of T2 of water in stewed marinated beef

由表4可知，多頻復合超聲處理使鹵牛肉水分重新分布，隨著超聲復合頻數的增加，結合水峰面積P21以及自由水峰面積P23逐漸增大，其峰面積大小為三頻＞雙頻＞單頻＞未超聲組；對結合水來說，各超聲處理組與未超聲組間峰面積均有顯著差異（P＜0.05）。其中，三頻復合超聲組與雙頻組間差異顯著（P＜0.05），與單頻組及未超聲組間差異極顯著（P＜0.01），三頻復合超聲組的P21是未超聲組的2.41 倍；對自由水來說，多頻組與未超聲對照組間均有顯著差異，尤其是三頻復合超聲組，其峰面積是未超聲對照組的4.1 倍。準結合水峰面積P22的趨勢則相反，隨著超聲復合頻數的增加，峰面積呈下降趨勢；多頻組峰面積最小，與單頻組間差異顯著（P＜0.05），與未超聲組間差異極顯著（P＜0.01），多頻組中三頻P22最小。高飛[6]在研究超聲真空煮制時也發現，超聲真空鹵煮增加了峰面積P23，P22相應減小。分析認為，可能兩次間隔多頻復合超聲處理產生了強烈的空化效應與機械效應，導致肌原纖維小片化以及二級結構的改變較大，增加了蛋白質分子與水分子間相互作用的幾率[21,23,25]，使得準結合水向結合水遷移，這種遷移具有明顯的頻率效應，結合水含量隨著復合超聲頻數的增加而增加，不易流動水含量則隨之減少。又因為在一定真空條件下，兩次間隔超聲處理導致肌纖維間隙進一步增大，且頻率效應顯著，肌纖維間隙隨著復合頻數的增加而增大、小片化增多，因而被縱橫交織的小片化肌纖維包圍的自由水隨復合頻數的增加而增加。另外，鹵煮好后破真空的反向壓力在一定程度上對肉中水分的保持起穩定或鞏固作用；由于低溫鹵制，未超聲組肌纖維結構完整，因而滯留的自由水相對較少，這與鹵牛肉微觀結構的掃描電鏡分析結果一致。

表4 多頻復合超聲真空煮制鹵牛肉不同狀態水分的峰面積Table 4 Effect of multifrequency ultrasound-assisted vacuum cooking on peak area of water at different states in stewed marinated beef

2.5.2 蒸煮損失率與出品率

蒸煮損失率反映肌肉的保水性，蒸煮損失率越低，保水性越好。表5結果顯示，多頻超聲蒸煮損失率最小，損失由大到小順序為未超聲組＞單頻＞雙頻＞三頻，其中三頻組蒸煮損失率顯著低于雙頻組和單頻組（P＜0.05），極顯著低于未超聲組（P＜0.01）；多頻組出品率均顯著高于未超聲對照組（P＜0.05），三頻復合超聲組的出品率最高，顯著高于雙頻組和單頻組（P＜0.05），極顯著高于未超聲對照組（P＜0.01）。這種變化與肌原纖維小片化的結果相對應，此外，多頻復合超聲水分分布的結果也從側面證實了保水性的頻率效應。

表5 多頻復合超聲處理對鹵牛肉出品率和蒸煮損失率的影響Table 5 Effect of multifrequency ultrasound-assisted treatment on yield and cooking loss of stewed marinated beef

3 結論

多頻復合超聲處理對鹵牛肉肌纖維結構和保水性影響顯著。具體表現為隨著復合超聲頻數的增加，MFI、β-轉角與無規卷曲結構含量均升高，α-螺旋、β-折疊結構含量則降低；復合頻數越多，肌纖維表面結締組織附屬物溶解越多，肌纖維分離、斷裂越明顯，三頻超聲組纖維斷裂最顯著。鹵牛肉的硬度、咀嚼性、內聚性隨著復合頻數的增加而降低，多頻組的硬度、咀嚼性大幅下降，三頻組的降幅最大，而彈性隨復合頻數的增加而增大。在保水性上，各超聲處理組的T2均比未超聲處理組縮短，且均向左遷移，其中，三頻處理組向左遷移幅度最大，雙頻次之，單頻左遷最少；此外，多頻超聲處理使得準結合水向結合水遷移，復合頻數越多準結合水遷移越多，結合水和自由水含量越多。相應地，在蒸煮損失率和出品率方面，三頻組蒸煮損失率顯著低于雙頻組和單頻組，出品率的趨勢則相反，三頻復合超聲組的出品率最高。因此，多頻超聲處理能顯著破壞鹵牛肉肌纖維結構，增加肉與水的結合力，降低鹵牛肉的硬度、咀嚼性、內聚性，增加彈性，提高肉制品的保水性和出品率，這種變化具有明顯的頻率效應，復合頻數越多，頻率效應越顯著。