通過式固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源性食品中30 種食源性興奮劑

劉 川，李佳佳，吳雪瑩，陳燕秋，石培育，宋 娟,，戴 琴,

（1.成都市食品檢驗研究院，四川 成都 611130；2.國家市場監管重點實驗室（營養與健康化學計量及應用），北京 100029）

為加快動物生長速率、提高肌肉比例、降低疾病發生率、保證運輸順應性等，在動物飼養、運輸、屠宰等環節可能存在人為添加或殘留蛋白同化劑、糖皮質激素和利尿劑等類型食源性興奮劑的現象[1-3]。消費者長期食用含有該類物質的動物源性食品可能會導致內分泌紊亂、身體抵抗力下降甚至引發癌癥[4]。運動員等特殊群體在食用含有該類物質的動物源性食品后會暴露食源性興奮劑風險，進而影響體育成績和比賽公平[5-6]，以我國為例，體反興奮劑字〔2021〕584號中對60 種食源性興奮劑的限量要求、檢測方法均提出了嚴格要求[7]。目前，我國針對食源性興奮劑的檢測標準主要有農業部1031號公告—2—2008《動物源性食品中糖皮質激素類藥物多殘留檢測 液相色譜-串聯質譜法》、農業部1031號公告—1—2008《動物源性食品中11 種激素殘留檢測 液相色譜-串聯質譜法》和SN/T 5167—2019《出口動物源食品中氫氯噻嗪等10 種利尿劑殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法》等國家檢測標準。584號文中規定的60 種食源性興奮劑分散在以上檢測標準中，且適用的基質也較少，在實際檢測過程中可能導致檢測周期過長、需要大量檢測人員、不能完全覆蓋實際工作的檢測等問題，難以滿足大型體育賽事用食品檢測的時效性要求。

現已有部分針對多種食源性興奮劑的檢測研究，如Shi Yanjing等[3]使用QuEChERS（quick,easy,cheap,effective,rugged,safe）凈化結合高分辨質譜同時測定牛奶和乳制品中的48 種興奮劑殘留；馮月超等[8]使用QuEChERS凈化，部分同位素內標法定量檢測44 種食源性興奮劑和6 種孕激素；張海超等[9]使用QuEChERS凈化，基質曲線測量46 種食源性興奮劑。以上檢測標準和檢測方法多使用基質曲線或少量內標進行測定，在測定復雜基質樣品時存在基質效應差異較大、難以獲得同類型空白基質樣品，且睪酮、氫化可的松等興奮劑屬于內源性興奮劑，針對該類物質的檢測過程恐難以制得基質曲線等問題，以上情況導致該類方法在實際使用過程中存在檢測效率較低、結果不準確等不足。本研究在對動物源性食品中30 種食源性興奮劑的檢測過程中，對提取和凈化流程進行優化，并使用同位素內標進行定量，建立普適性強、靈敏度高、檢驗結果準確可靠的檢測方法，實現同時對10 種蛋白同化劑（美雄酮、司坦唑醇、甲基睪酮、勃地龍、睪酮、丙酸睪酮、諾龍、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、群勃龍），8 種糖皮質激素（潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、氟氫可的松、氫化可的松）和12 種利尿劑（氫氯噻嗪、乙酰唑胺、氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、芐氟噻嗪、氨苯蝶啶、螺內酯、坎利酮、精磺胺、托拉塞米、布美他尼）的檢測分析，旨在為保障大型體育賽事的運行提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、氟氫可的松、氫化可的松、美雄酮、司坦唑醇、甲基睪酮、勃地酮、睪酮、丙酸睪酮、諾龍、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、群勃龍、氫氯噻嗪、乙酰唑胺、氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、芐氟噻嗪、氨苯蝶啶、螺內酯、坎利酮、精磺胺、托拉塞米、布美他尼，美雄酮-D3、司坦唑醇-D3、甲基睪酮-D3、勃地酮-D3、睪酮-D3、丙酸睪酮-D3、諾龍-D3、丙酸諾龍-D3、群勃龍-D3、氨苯蝶啶-D5、坎利酮-D6、托拉塞米-D7、布美他尼-D5、潑尼松-D8、潑尼松龍-D6、甲基潑尼松龍-D3、地塞米松-D5、倍他米松-D5、倍氯米松-D5、氟氫可的松-D5、氫化可的松-D3、氫氯噻嗪-D2、乙酰唑胺-D3、氯噻嗪-13C,15N2、氯噻酮-D4、呋塞米-D5、卞氟噻嗪-D5、精磺胺-15N2均為100～1000 μg/mL的標準品溶液 天津阿爾塔科技有限公司。

甲酸、甲醇、乙腈（色譜純）德國Merck公司；氯化鈉、正己烷（分析純）重慶川東化工（集團）有限公司；PRiME HLB固相萃取小柱（500 mg/6 mL）美國Waters公司；陶瓷均質子（50 mL離心管用）上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗用水符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規格和實驗方法》實驗室一級用水。

豬肉、雞肉、蝦、雞蛋、牛奶以及部分相關制品共50余批次樣品均購自于市場。

1.2 儀器與設備

ExionLC-Triple Quad? 6500＋超高效液相色譜-串聯質譜儀 美國AB SCIEX公司；Centrifuge 5810 R高速離心機 德國Eppendorf公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；BP211D型天平 德國Sartorius公司；ME203型天平 瑞士Mettler Toledo公司；Atlantis C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）美國Waters公司；ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 標準物質的配制

1.3.1.1 混合標準中間溶液配制

分別準確吸取不同體積的潑尼松、潑尼松龍等標準品溶液于同一棕色容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻得混合標準中間溶液（美雄酮、司坦唑醇、甲基睪酮、丙酸睪酮、諾龍、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、勃地酮、群勃龍、睪酮質量濃度為100 ng/mL，潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、地塞米松、倍他米松、倍氯米松質量濃度為125 ng/mL，氟氫可的松、精磺胺質量濃度為250 ng/mL，氫化可的松、氯噻嗪、氫氯噻嗪質量濃度為500 ng/mL，氯噻酮、氨苯蝶啶、乙酰唑胺、螺內酯、呋塞米、坎利酮、芐氟噻嗪、托拉塞米、布美他尼質量濃度為1250 ng/mL）。

1.3.1.2 同位素內標標準溶液配制

分別準確吸取不同體積的美雄酮-D3、司坦唑醇-D3等標準品溶液至同一棕色容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻得同位素內標標準溶液（美雄酮-D3、司坦唑醇-D3、甲基睪丸酮-D3、丙酸睪酮-D3、諾龍-D3、丙酸諾龍-D3、勃地酮-D3、群勃龍-D3、睪酮-D3、潑尼松-D8、潑尼松龍-D8、甲基潑尼松龍-D2、地塞米松-D4、倍他米松-D5、倍氯米松-D5質量濃度為100 ng/mL，氟氫可的松-D、氫化可的松-D3、精磺胺-15N2、氯噻嗪-13C,15N2、氫氯噻嗪-D2、氯噻酮-D4、氨苯蝶啶-D5、乙酰唑胺-D3、呋塞米-D5、坎利酮-D6、芐氟噻嗪-D5、托拉塞米-D7、布美他尼-D5質量濃度為1000 ng/mL）。

1.3.1.3 標準曲線工作溶液配制

分別吸取10、20、50、100、200、400 μL混合標準中間溶液和50 μL同位素內標標準溶液于不同1 mL容量瓶中，用30%甲醇溶液（含4%甲酸）定容至刻度，搖勻，得到標準曲線工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 提取

準確稱取均質樣品5 g（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中并加入100 μL同位素內標標準溶液，加入均質子和5 mL水，渦旋混勻5 min。加入20 mL 5%甲酸-乙腈，渦旋混勻15 min，超聲30 min，再加入8 g氯化鈉，渦旋混勻5 min，于4 ℃、9500 r/min條件下冷凍離心5 min，取上清液于另一離心管中，加入10 mL乙腈飽和正己烷溶液，渦旋混勻5 min，于4 ℃、9500 r/min條件下離心5 min，棄去正己烷層，下層溶液待凈化。

1.3.2.2 凈化

取10 mL下層溶液過PRiME HLB小柱，加入2 mL 5%甲酸-乙腈進行洗脫，收集濾液于氮吹管中，45 ℃氮吹至近干，加入1.0 mL 30%甲醇溶液（含4%甲酸）溶解殘渣，渦旋混合1 min，超聲2 min，過0.22 μm濾膜，濾液于超高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.3.2.3 條件優化

本研究選擇乙腈作為基礎提取溶劑，考察乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.5%甲酸-乙腈、1%甲酸-乙腈、2%甲酸-乙腈、5%甲酸-乙腈和6%甲酸-乙腈對不同基質中30 種食源性興奮劑的提取效率。同時對PRiME HLB（200 mg/6 mL）、PRiME HLB（500 mg/6 mL）、EMR（300 mg/3 mL）、EMR（500 mg/6 mL）、lipono和Nano QuEChERS凈化管與未經凈化的提取液對目標物凈化效果進行考察。

1.3.3 液相色譜-串聯質譜條件

1.3.3.1 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）；流動相：A為5 mmol/L甲酸銨溶液（含0.1%甲酸），B為0.1%甲酸-甲醇溶液；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures

1.3.3.2 質譜條件

離子源類型：電噴霧電離源；氣簾氣（氮氣）壓力：35 psi；噴霧氣（氮氣）壓力：55 psi；輔助加熱氣（氮氣）壓力：55 psi；離子源溫度：400 ℃；離子化電壓：5000 V/－4500 V；掃描模式：多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式。監測離子對和質譜參數見表2。

表2 30 種食源性興奮劑的質譜條件與保留時間Table 2 Mass spectrometric parameters and retention time of 30 foodborne stimulants

1.3.3.3 色譜條件優化

選擇超高效液相色譜柱為研究對象，以提高色譜分離效果并節約流動相。考察了Atlantis C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）4 種色譜柱對待測化合物的分離效果。

以甲醇和乙腈為有機相，以0.1%甲酸溶液、0.5%甲酸溶液、5 mmol/L甲酸銨溶液、10 mmol/L甲酸銨溶液、5 mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）溶液、10 mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）溶液和20 mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）溶液為流動相水相，分別考察不同有機相和流動相對各目標物的分離效果和響應差異。

1.3.3.4 質譜條件優化

在流動注射方式下分別對30 種食源性興奮劑以及同位素內標進行質譜參數優化，根據對比各目標物母離子響應強度選擇各自適宜的正負離子掃描模式，并確定各目標物的m/z。以此為基礎選取該母離子響應相對較高、專屬性較強的2 個子離子建立MRM通道，并對去簇電壓和碰撞電壓優化，同時在接入流動相后繼續優化氣簾氣、噴霧氣、輔助加熱氣、離子源溫度、離子化電壓等條件。

1.3.4 基質效應考察

分別稱取不同品種且適量份數的空白基質樣品，除不加入同位素內標標準溶液外均按照1.3.2節獲取空白樣品提取液。分別使用空白樣品提取液和30%甲醇溶液（含4%甲酸）稀釋成標準曲線工作液，以基質標準曲線斜率與溶劑標準曲線斜率的比值考察30 種興奮劑的基質效應。

2 結果與分析

2.1 提取條件優化

乙腈具有沉淀蛋白、與油脂相容性較差等特性，是提取動物源性食品中有關物質最為常見的提取溶劑[10]，本研究按照1.3.2.3節所述分別考察了乙腈和不同比例甲酸-乙腈的提取效率，結果表明，不同含酸量的乙腈其提取效率表現出較大差異（圖1）。以豬肉為例，不同酸度的甲酸-乙腈對糖皮質激素和大部分利尿劑提取效率差異并不明顯，但對于司坦唑醇、丙酸睪酮、諾龍、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、氯噻酮、布美他尼、芐氟噻嗪等極性較小的食源性興奮劑，提取效率與甲酸-乙腈的酸度呈正相關，且表現出較大差異，5%甲酸-乙腈和6%甲酸-乙腈對以上幾種物質的提取效率差異不大。為兼顧30 種興奮劑的提取效率，本研究選擇5%的甲酸-乙腈作為提取溶劑。

圖1 6 種提取溶劑的提取效率對比Fig.1 Comparison of extraction efficiencies of six solvents

2.2 凈化方式考察

由于動物源性食品中含有大量脂溶性雜質、色素等干擾物，容易干擾儀器檢測，因此，對凈化方法進行優化。目前主流的凈化方式有固相萃取、QuEChERS、液液分散萃取等。而通過式固相萃取小柱凈化具有免活化、操作簡單等優點[11-12]，本研究按照1.3.2.3節所述對不同凈化方式的凈化效果進行考察，結果見表3。PRiME HLB小柱（500 mg/6 mL）凈化后回收率較高，對去除基質效應的效果更好，因此選擇PRiME HLB小柱（500 mg/6 mL）為凈化所用。

表3 不同凈化方式的回收率Table 3 Comparison of recoveries of different purification methods

2.3 色譜條件優化

2.3.1 色譜柱選擇

4 種色譜柱在同一流動相條件下對待測物的色譜保留性能相似，其中ACQUITY UPLC HSS C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）色譜柱對30 種物質的分離效果、峰型和對稱度更好。

2.3.2 流動相選擇

對流動相的有機相考察研究結果表明，由于螺內酯和坎利酮為同分異構體，選擇乙腈作為有機相時，化合物不能完全分離；選擇甲醇作為流動相的有機相時，化合物均可分離且分離度較好。同時比較了甲醇、0.1%甲酸-甲醇和0.5%甲酸-甲醇對30 種食源性興奮劑信號響應的差異，有機相為含酸甲醇時大部分化合物響應均高于甲醇，結合色譜條件的普適性，選擇0.1%甲酸-甲醇作為流動相的有機相[13-14]。

同時在流動相水相考察研究中發現，群勃龍、甲基睪酮、美雄酮、諾龍、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍等蛋白同化劑在甲酸銨溶液作為流動相水相時的響應情況明顯高于甲酸溶液，繼續在甲酸銨溶液中加入甲酸，布美他尼、精磺胺等利尿劑響應得到提升。結合目標物響應與峰形等因素，選擇5 mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）溶液作為流動相的水相[14]。

30 種興奮劑在使用0.1%甲酸-甲醇和5 mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）溶液作為流動相時的色譜圖見圖2，地塞米松和倍他米松在該色譜條件下無法分離，在檢出時，可通過調整色譜條件后進行單獨測定。

圖2 30 種食源性興奮劑標準溶液提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of 30 foodborne stimulant standard solutions

2.4 質譜條件優化

各目標物母離子、子離子等相關參數見表2。質譜條件優化結果表明，蛋白同化劑在正離子掃描模式下響應更高[15-16]，氨苯喋啶、螺內酯、坎利酮、托拉塞米、布美他尼在正離子模式下響應高于負離子模式；正離子模式下以上物質母離子均呈現[M＋H]＋離子峰。而糖皮質激素和其余利尿劑在負離子模式下響應更高[8-9,17-19]，其母離子為[M－H]－離子峰。各目標物的定量子離子和定性子離子均在權衡靈敏度和專屬性等方面后進行選擇。

2.5 復溶溶劑優化

在保證其他條件不變的情況下，對不同比例的甲醇溶液進行考察。結果表明，當有機相比例大于30%時，氨苯蝶啶峰形較差，具有較為明顯的溶劑效應。在保證有機相比例不變的情況下，考察含有不同比例甲酸的復溶效果，由于丙酸睪酮、諾龍、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍等化合物的脂溶性較強，其回收率與復溶溶劑中甲酸酸度呈正相關[20]。但當甲酸含量大于4%時，該類化合物的回收率基本不變，因此，選擇30%甲醇溶液（含4%甲酸）作為復溶溶劑。

2.6 基質效應的優化

使用液相色譜-串聯質譜法檢測動物源性食品過程中可能帶入不同程度的基質效應，基質效應的存在直接影響檢測結果的準確性[21-22]，因此，本研究按照1.3.4節所述對基質效應進行評估。若基質標準曲線斜率與溶劑標準曲線斜率的比值在0.85～1.15之間，則認為不存在基質效應，反之則存在基質效應。30 種目標物的基質效應結果見表4。結果表明，檢測不同基質中的食源性興奮劑時均存在較明顯的基質效應，且由于部分預制型動物源性食品的基質更為復雜，本研究為減少基質效應對實際樣品測定的干擾，采用同位素內標法做定量分析[13]。

2.7 線性關系、檢出限與定量限優化

對1.3.1.3節所配制的標準曲線工作溶液進行測試，并建立不同物質的標準曲線，不同物質的線性范圍和對應同位素內標見表4。采取在空白試樣中逐級稀釋加標濃度的方式確定30 種食源性興奮劑的檢出限和定量限[23]。同時在不同基質中加入檢出限和定量限水平的標準物質，按照1.3.2.1節和1.3.2.2節的方法進行檢測。結果表明，不同基質中檢出限水平的各食源性興奮劑其定性離子對、定量離子對信噪比均大于3；定量限水平的各食源性興奮劑其定性離子對、定量離子對信噪比均大于10[24]。

2.8 方法回收率與精密度

依據GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》，分別稱取豬肉、雞肉、蝦、牛奶、雞蛋空白基質樣品，按照定量限、兩倍定量限和10 倍定量限進行3水平添加實驗（n＝6），按照1.3.2.1節和1.3.2.2節方法對樣品進行處理和檢測，考察所確定方法的回收率和精密度[25]。如表5所示，本研究的平均回收率在67.5%～114.3%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.7%～16.1%。

2.9 實際樣品測試

采用本方法對購于市場的豬肉、雞肉、蝦、雞蛋、牛奶以及部分相關制品共50余批次樣品進行30 種食源性興奮劑的檢測，在1 批次豬肉制品中檢出4.52 μg/kg的氫化可的松，采用農業部1031號公告—2—2008進行技術驗證，氫化可的松的測定結果為4.28 μg/kg，兩種方法測得結果的RSD為5.20%。另有1 批次牛肉中檢出1.78 μg/kg的睪酮，采用農業部1031號公告—1—2008對以上樣品進行技術驗證，睪酮的測定結果為1.68 μg/kg，兩種方法測定結果的RSD為5.88%。綜上，本方法在有效縮減提取凈化步驟、節省檢驗時間、增加檢測通路、提高檢驗效率的同時依然能夠保證數據的準確度。

3 結論

本研究針對動物源性食品中30 種食源性興奮劑的檢測需求，通過優化儀器條件、提取溶劑、凈化方式和定量方法等建立了通過式固相萃取-液相色譜-串聯質譜的檢測方法。該方法能有效消除不同復雜基質樣品檢測過程中的基質效應，具有靈敏度高、檢測通量較大、操作簡單、普適性高等優點，能夠滿足賽事用動物源性食品中10 種蛋白同化劑、8 種糖皮質激素和12 種利尿劑的檢測需求。