實驗室自繁大豆菌核萌發影響因素研究

李易初 孟慶林 石鳳梅 馬立功 劉佳 蘇保華 于良斌

摘要 采用人工繁育菌核進行萌發試驗，研究人工繁育菌核與自然菌核萌發區別及培養時間、形成菌核的菌齡和保存方式對菌核萌發的影響。結果表明，PDA平板培養菌核萌發時間較少，采集菌核萌發時間最長及萌發率最低；PDA平板15 d形成菌核萌發時間短，培養30和45 d菌核萌發時間無明顯差異；不同菌齡形成菌核萌發無差異；繁育菌核直接培養萌發時間最短，干燥儲存時間越長，后續萌發培養時間越長。

關鍵詞 核盤菌；大豆；菌核萌發；人工繁育

中圖分類號 S435.651? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）03-0122-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.029

Study on Influencing Factors of the Sclerotiums Germination in Laboratory Artificial Culture on Soybean

Abstract The artificial breeding sclerotiums were used for germination test. The germination difference between artificial breeding sclerotiums and natural sclerotiums， the influence of sclerotiums of several generations funguses and preservation methods on the germination of sclerotiums was studied.The results showed that the germination time of sclerotiums cultured by PDA substrate was less，the natural sclerotiums germination time was the longest and germination rate was the lowest， the germination time of sclerotiums which culture for 15 days in PDA substrate was shorter ， and there was no significant difference between 30 days and 45 days. There was no difference between sclerotiums from different age funguses groups. The germination time of fresh breeding sclerotiums was the shortest， and the longer the dry storage time， the longer the subsequent germination culture time.

Key words Sclerotinia sclerotiorum;Soybean;Sclerotiums germination;Artificial culture

大豆菌核病是由核盤菌Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）be Bary引起的主要真菌病害，核盤菌世界范圍內可以侵染上百種植物，侵染力強，寄主廣泛［1］。有關部門對我國大豆菌核病發生年份統計發現，大豆產量整體減產近34%，嚴重時減產50%，如遇特殊年份甚至絕收［2］。全球范圍內暫未發現免疫大豆品種，對大豆菌核病侵染機理等方面的研究仍是解決核盤菌防治問題的重要研究方向。

核盤菌主要通過2種方式侵染大豆，一種是菌絲直接侵入，一種是通過菌核萌發形成子囊盤彈射子囊孢子侵染［3-4］。野外采集菌核數量有限且存在地域差異，核盤菌子囊孢子致病機理的研究多采用實驗室自繁菌核萌發收集子囊孢子為接種菌，試驗過程中發現自繁菌核萌發情況多樣，菌核間萌發狀態難以達成一致，影響子囊孢子的收集時間和數量，進而影響后續試驗順利進行。與此同時，人工繁殖菌核與自然采集菌核萌發情況是否存在差異仍未明確。筆者研究人工培養菌核與自然形成菌核是否存在萌發差異，并初步探索人工繁育的菌核在室內萌發培養的影響因素，為后續菌核萌發機制及子囊孢子致病力研究等提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。

實驗室內常規方法分離收集自黑龍江省不同地區的菌核JH001、JH002和JH003，得到對應的致病菌株4 ℃保存斜面備用。田間采集菌核常溫干燥環境留存，部分菌核按照試驗方法直接試驗；菌株JH001、JH002和JH003轉接在PDA平板，待菌落氣生菌絲糾結成團形成菌核，鑷子摘取PDA平板表面菌核用于試驗；3種菌塊分別接種于馬鈴薯胡蘿卜培養基恒溫20 ℃培養20 d，形成菌核取出洗凈、陰干備用。

1.1.2 試驗儀器。

超凈工作臺（WT-2N）、生化培養箱（SPX-420B）、恒溫干燥箱（DGX-9623 BC-1）、樣品保存柜（FYL-YS-430L）等。

1.2 方法

1.2.1 菌核來源對萌發的影響。

選擇3個菌株3種不同來源的菌核進行萌發試驗，挑選合適菌核相同條件培養。觀察菌核萌發時間，培養20 d調查每個發芽盒菌核萌發數量，計算萌發率。菌核分別來自PDA平板菌絲團形成菌核，馬鈴薯胡蘿卜培養基培養得到，野外病株體上采集。

1.2.2 培養時間對菌核萌發的影響。

首次分離得到的菌株接種于馬鈴薯胡蘿卜培養基，25 ℃培養15、30、45 d，取出培養時間不同的菌核，洗凈備用。

1.2.3 菌齡對菌核萌發的影響。

第一次分離得到的菌株，再次轉接得到的第二代、第三代菌株通過室內人工自繁（馬鈴薯胡蘿卜培養基培養）方法獲得菌核，沖洗干凈后直接進行萌發試驗。

1.2.4 保存狀態對菌核萌發的影響。

馬鈴薯胡蘿卜培養基培養得到菌核沖洗干凈后直接進行萌發試驗；菌核陰干后再進行萌發試驗；菌核陰干并儲存30 d再用于萌發試驗。

按照試驗設計培養選擇不同狀態大小均勻菌核，完全浸泡在5%次氯酸鈣溶液中，表面消毒30 min，無菌水沖洗3遍，擺放在鋪有完全濕潤滅菌沙的培養盒中，20 ℃恒溫明暗交替條件培養，隨時觀察菌核的萌發情況，記錄萌發時間。

2 結果與分析

2.1 菌核來源對萌發的影響

不同來源菌核萌發情況見圖1。由圖1可知，馬鈴薯胡蘿卜培養的菌核部分形狀不規則，處理組中JH001菌核的萌發率可達70%，3種菌株菌核的萌發率平均高于59%，3個來源菌核的平均萌發率最高；PDA平板形成菌核形狀多為圓形和橢圓形，菌核一側接觸玻璃皿或培養基，形態扁平，飽滿程度不高，其中JH002菌核萌發率最高為30.67%，仍明顯低于其他2組處理；野外采集菌核萌發情況介于前2組處理之間，平均萌發率為53.56%。對比發現PDA平板培養的菌核平均萌發率最低，馬鈴薯胡蘿卜培養基培養的菌核平均萌發率最高。

試驗菌核的萌發時間比較發現，培養皿培養的菌核萌發所需時間均超過28 d，JH003菌核萌發時間為32.67 d；野外采集的菌核需連續培養近20 d才開始萌發；馬鈴薯胡蘿卜培養基繁育的菌核萌發時間為16.33～19.67 d（圖2）。

結合萌發時間及萌發率試驗結果可知，PDA培養基培養形成菌落后菌核所需萌發時間較長，相同培養時間菌核的萌發率最低，且在試驗中觀察到菌核在培養過程中未形成子囊柄及子囊盤，而是形成菌絲，菌核呈菌絲型萌發。野外采集菌核的萌發時間及萌發率次之，推測戶外的自然環境影響了菌核本身的水分含量，采集的菌核均十分干燥，萌發需要較長時間。馬鈴薯胡蘿卜培養基培養的菌核萌發時間最短、萌發率最高，是比較穩定的實驗室繁育菌核的方法。

2.2 培養時間對菌核萌發的影響

按照試驗方法培養菌核，觀察記錄其萌發時間。由表1可知，萌發時間在15～20 d，不同培養時間的菌核萌發天數相差較小，PDA平板培養15 d得到菌核，需平均培養16.22 d后逐個萌發。JH002所需培養時間最長為17.33 d，較其他2組相對時間較短；對試驗數據進行分析，培養30和45 d菌核萌發時間差異不顯著。培養15 d的菌核萌發時間最短，培養超過30 d的菌核萌發時間需要18 d以上。

2.3 菌齡對菌核萌發的影響

菌核的萌發率和萌發時間見表2。由表2可知，一代分離菌株菌核平均需要19.00 d，萌發率可達49.33%；第二代菌株形成菌核萌發平均需要18.89 d，與首次分離得到菌株菌核萌發時間無顯著差異，萌發率為50.67%，略高于首次分離菌株菌核；第三代繁育的菌核萌發率為50.78%，萌發時間為18.22 d，菌齡不同形成的菌核在培養時間及萌發率方面差異不顯著。

2.4 保存狀態對菌核萌發的影響

選擇3種實驗室常見保存方式的菌核進行試驗，干燥30 d后的菌核需要培養22 d以上萌發；繁育菌核直接取出培養只需6 d左右即可萌發；陰干7 d的菌核所需萌發時間在10～11 d（圖3）。剛剛培養得到的新鮮菌核，沒有干燥過程直接培養萌發僅需6 d，隨著干燥時間延長，再次萌發培養時間延長，干燥儲存時間越長，菌核萌發所需時間越長。

3 討論

該試驗結果表明，通過馬鈴薯胡蘿卜培養基培養的菌核，直接取出清洗，立即進行萌發培養，菌核萌發速度快，萌發率較高；野外采集的菌核和人工繁育存儲時間較長的菌核萌發時間較長，間接證明菌核內部含水量與菌核的萌發有十分重要的關系［5-7］。馬鈴薯胡蘿卜培養基繁育的菌核，萌發時間與菌核儲存時間［8］及干燥程度有直接關系，剛剛繁育的菌核萌發所需時間僅為6～7 d。PDA平板上形成的菌核較小，萌發時間較長，且部分菌核不形成子囊柄，多數菌核繼續菌絲型萌發［9-10］。用于繁育菌核的菌株與形成菌核的萌發時間無明顯相關性，不同傳代菌株形成的菌核不影響其萌發。

綜上所述，PDA平板培養的菌核形狀均勻，萌發時間長，還受到形成數量和體積偏小限制，不利于在后續培養中形成子囊柄及子囊盤；馬鈴薯胡蘿卜培養基更適合大量繁育菌核，培養得到菌核數量充足、體積較大，干燥條件封閉保存，提前預留出培養時間，可以保證后續試驗順利進行，是實驗室內較為理想的繁育菌核方法。

參考文獻

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