興安杜鵑3種主要成分的HPLC測(cè)定及其對(duì)大鼠氣管平滑肌的舒張作用

張穎慧 王晨蔚 周苑婷 陳思淼 張怡然 孫宇婷 張琳

摘要 ［目的］建立同時(shí)測(cè)定興安杜鵑中金絲桃苷、槲皮素和杜鵑素含量的高效液相色譜法（HPLC），并探討興安杜鵑提取物及3種主要成分對(duì)大鼠氣管平滑肌舒張作用的影響及其作用機(jī)制。［方法］采用HPLC法測(cè)定興安杜鵑中金絲桃苷、槲皮素和杜鵑素的含量并進(jìn)行方法學(xué)考察。采用離體氣管灌流法取大鼠氣管環(huán)，將氣管環(huán)固定于麥?zhǔn)显∶笾校褂脫錉柮簟⑦胚崦佬痢⒏窳斜诫濉⒆笮趸彼峒柞ィ↙-NAME）、硝苯地平和普萘洛爾進(jìn)行預(yù)孵育，待氣管環(huán)張力穩(wěn)定后，加入60 mmol/L KCl溶液收縮氣管環(huán)，進(jìn)行興安杜鵑對(duì)氣管環(huán)的舒張?jiān)囼?yàn)，觀察大鼠氣管平滑肌張力變化。［結(jié)果］興安杜鵑中3種主要成分HPLC測(cè)定方法考察結(jié)果顯示，3種成分均在2～80 μg/mL線性關(guān)系良好，平均回收率分別為金絲桃苷100.3%（RSD=2.63%）、槲皮素102.7%（RSD=2.89%）、杜鵑素102.1%（RSD=2.36%）。在吲哚美辛、格列本脲和普萘洛爾孵育組織中，興安杜鵑提取物及3種單體成分的舒張作用與未孵育組相比沒(méi)有顯著差異；在撲爾敏、L-NAME和硝苯地平孵育的組織中，興安杜鵑及金絲桃苷與未孵育的組織相比有顯著差異，舒張作用有所降低。這種現(xiàn)象可能是通過(guò)抑制組胺H1受體、一氧化氮合酶途徑和鈣離子通道介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流實(shí)現(xiàn)的。［結(jié)論］該試驗(yàn)建立的方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，能快速測(cè)定興安杜鵑中金絲桃苷、槲皮素和杜鵑素的含量，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制提供了有效的分析手段；并且這3種成分與興安杜鵑舒張氣管的作用有關(guān)，可作為支氣管擴(kuò)張劑開(kāi)發(fā)的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 興安杜鵑；HPLC；金絲桃苷；槲皮素；杜鵑素；含量測(cè)定；氣管平滑肌；舒張作用

中圖分類號(hào) R285? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2024）03-0163-08

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.040

HPLC Determination of Three Main Components of Rhododendron dauricum L. and Their Relaxing Effects on Rat Tracheal Smooth Muscle

Abstract ［Objective］To establish a method for the simultaneous determination of hyperin， quercetin and farrerol in Rhododendron dauricum by HPLC， and to discuss the effects of Rhododendron dauricum extract and its three main components on the relaxation of rat tracheal smooth muscle and the mechanism. ［Method］ The contents of hypericin， quercetin and farrerol in Rhododendron dauricum were determined by HPLC and the methodology was investigated. Rat tracheal rings were obtained by in vivo air tube perfusion method， and fixed in a Mack’s bath. The tracheal rings were pre-incubated with chlorphenamine， indometacin， glibenclamide， L-nitroarginine methyl ester （L-NAME）， nifedipine and propranolol. After the tension of the tracheal ring stabilized， 60 mmol/L KCl solution was added to shrink the tracheal ring. The relaxation experiment of tracheal ring by Rhododendron dauricum was conducted to observe the changes of tracheal smooth muscle tension in rats.［Result］The investigation results of the HPLC determination method for three main components in Rhododendron dauricum showed that the linear relationship between the three components was good in the range of 2-80 μg/mL. The average recovery rates were 100.3% （RSD=2.63%） of hypericin， 102.7% （RSD=2.89%） of quercetin and 102.1% （RSD=2.36%） of farrerol. The diastolic effects of the extract and the three main components of Rhododendron dauricum in the incubated tissue of indometacin， glibenclamide and propranolol were not significantly different from those in the unincubated group. The diastolic effects of Rhododendron dauricum and hypericin in the tissues incubated with chlorphenamine， L-NAME and nifedipine were significantly different from those in the unincubated tissues. This phenomenon may be achieved through inhibition of histamine H1 receptors， nitric oxide synthase pathways， and calcium channel mediated calcium influx.［Conclusion］ The established method is simple， accurate， and can quickly determine the content of hypericin， quercetin and farrerol in Rhododendron dauricum， providing an effective analytical means for quality evaluation and control. In addition， these three components are related to the effect of diastolic trachea of Rhododendron dauricum L.， and can be used as a theoretical basis for the development of bronchodilators.

Key words Rhododendron dauricum;HPLC;Hypericin;Quercetin;Farrerol;Content determination;Tracheal smooth muscle;Relaxation

興安杜鵑（Rhododendron dauricum L.）屬杜鵑花科杜鵑花屬，為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物，其主要有效成分包括黃酮類、揮發(fā)油類和有機(jī)酸類等［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，興安杜鵑具有鎮(zhèn)咳、祛痰的臨床作用，常應(yīng)用于急性、慢性支氣管炎、支氣管哮喘等病癥的治療［4］。我國(guó)研究人員發(fā)現(xiàn)興安杜鵑提取物、金絲桃苷、槲皮素、杜鵑素可以濃度依賴性舒張鼠胸主動(dòng)脈［5-8］。支氣管哮喘（bronchial asthma）簡(jiǎn)稱哮喘，常以氣道炎癥反應(yīng)為主要特征，氣管平滑肌（tracheal smooth muscle，TSM）的收縮特性在哮喘發(fā)作中起重要作用［9］。興安杜鵑在哮喘的臨床治療中應(yīng)用較多［10-11］，但其作用機(jī)理仍不明確。為此，該研究建立興安杜鵑3種主要成分含量測(cè)量方法，采用離體氣管環(huán)灌流試驗(yàn)，考察興安杜鵑提取物及3種主要成分對(duì)大鼠離體TSM張力的影響，并初步探討興安杜鵑舒張氣管平滑肌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器。

LC-20AT型高效液相色譜儀（Shimadzu公司）；H1650R型高速離心機(jī)（湘儀公司）；AB120型電子分析天平、DXY-6恒溫加熱水浴鍋（SanLiang公司）；生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、ZH-HX-Z生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)、192203張力換能器（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；BT100蠕動(dòng)泵（北京東南儀城）；麥?zhǔn)显∶螅ㄕ袢A生物醫(yī)藥有限公司）；UP-400S超聲波細(xì)胞破碎儀（上海熙揚(yáng)儀器有限公司）。

1.1.2 藥品與試劑。

興安杜鵑葉購(gòu)自北京同仁堂哈爾濱藥房；撲爾敏、吲哚美辛（Indo）、格列苯脲（Gli）、左旋硝基精氨酸甲酯（L-NAME）、硝苯地平、普萘洛爾、茶堿，均購(gòu)自上海Macklinl公司；金絲桃苷、槲皮素、杜鵑素，均購(gòu)自成都Desite公司，純度≥98%；甲醇，購(gòu)自J&K Scientific；磷酸、甲基亞砜（DMSO）、氯化鉀（KCl）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、氯化鈉（NaCl）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、氯化鈣（CaCl2）、氯化鎂（MgCl2）、葡萄糖（Glucose），均購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

清潔級(jí)SD雄性大鼠［12］ 60只，體重220～250 g，購(gòu)自哈爾濱市雙城區(qū)新興鎮(zhèn)見(jiàn)林養(yǎng)殖場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（黑）2019-001，飼養(yǎng)時(shí)光照周期為0.5 d明、0.5 d暗，期間自由飲水、進(jìn)食。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 興安杜鵑提取物的制備及其3種主要成分的含量測(cè)定。

1.2.1.1 興安杜鵑樣品溶液的制備。

取興安杜鵑粉末（過(guò)60目篩）5 g，精密加入100%乙醇100 mL，采用超聲細(xì)胞破碎提取法提取，重復(fù)2次，合并濾液。12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制。

分別精確稱取5 mg金絲桃苷、槲皮素、杜鵑素標(biāo)準(zhǔn)品，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，于4 ℃保存。

1.2.1.3 HPLC條件。

采用HPLC分析興安杜鵑中的3種主要成分。液相色譜柱為Diamonsil反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，40%A；5～15 min，40%～50%A；15～20 min，50%～60%A；20～30 min，60%～65%A；30～40 min，65%A），在297和360 nm處同時(shí)檢測(cè)，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速為1.0 mL/min。

1.2.2 方法學(xué)考察。

1.2.2.1 線性關(guān)系考察。

將“1.2.1.2”中3種標(biāo)準(zhǔn)品溶液等比例混合，并用甲醇稀釋為2、10、20、40、60、80 μg/mL，分別按“1.2.1.3”中HPLC條件測(cè)定（平行3次），以樣品濃度和峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 精密度試驗(yàn)。

將“1.2.1.2”中3種標(biāo)準(zhǔn)品溶液等比例混合，按照“1.2.1.3”中HPLC條件測(cè)定，單日內(nèi)平行進(jìn)樣6組，得出3種主要成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)。

取室溫放置的興安杜鵑樣品溶液，于48 h內(nèi)不同時(shí)間進(jìn)樣，按照“1.2.1.3”中HPLC條件測(cè)定，得出3種主要成分峰面積的RSD。

1.2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)。

取6份“1.2.1.1”制備的興安杜鵑樣品溶液，按照“1.2.1.3”HPLC條件測(cè)定，得出3種主要成分峰面積的RSD。

1.2.2.5 加樣回收率試驗(yàn)。

取3組已知興安杜鵑含量的樣品溶液，分別混入高、中、低濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照“1.2.1.1”方法制備樣品溶液，按照“1.2.1.3”中HPLC條件測(cè)定，得出3種主要成分的回收率及RSD。

1.2.2.6 樣品含量測(cè)定。

將“1.2.1.1”制備的興安杜鵑樣品按照“1.2.1.3”中HPLC條件對(duì)3種主要有效成分進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算興安杜鵑樣品中3種主要成分的含量。

52卷3期????????? 張穎慧等 興安杜鵑3種主要成分的HPLC測(cè)定及其對(duì)大鼠氣管平滑肌的舒張作用

1.2.3 興安杜鵑樣品及其3種主要成分受試樣品的制備。

采用超聲細(xì)胞破碎提取法提取，提取液經(jīng)減壓濃縮及真空干燥制備成浸膏（1 g浸膏相當(dāng)于2 g生藥）。臨用前，用克雷伯-亨斯雷特溶液（Kerbs-H）配制成濃度為10 mg/mL的受試樣品，并在進(jìn)行氣管舒張?jiān)囼?yàn)時(shí)，麥?zhǔn)显∶笾械慕K濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL。

分別將金絲桃苷、槲皮素、杜鵑素配制成0.46、0.30、0.30 mg/mL的受試藥物母液，臨用前，用Kerbs-H溶液稀釋，使其在麥?zhǔn)显∶笾械慕K濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 mg/mL。

1.2.4 氣管舒張?jiān)囼?yàn)裝置及條件。

將試驗(yàn)裝置依次連接，如圖1，麥?zhǔn)显∶笾屑尤牒銣豄rebs-H溶液，打開(kāi)氧氣閥門(mén)持續(xù)通入氧氣（氣泡大小以不影響張力換能器為宜）。然后打開(kāi)生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)，設(shè)置張力為30 g，采樣通道1，放大倍數(shù)100 mV，上限30 Hz，下限直流。預(yù)熱儀器30 min。

1.2.5 大鼠氣管環(huán)的制備［13］。

利用頸椎脫臼法處死大鼠，取出完整氣管，將氣管迅速放入充氧、預(yù)冷的Kerbs-H溶液（NaH2PO4 1.18 mmol/L、MgCl2 1.20 mmol/L、NaHCO3 24.80 mmol/L、CaCl2 2.52 mmol/L、KCl 4.70 mmol/L、NaCl 118.30 mmol/L、Glucose 11.10 mmol/L）中，裁制成長(zhǎng)度3～4 mm的氣管環(huán)，剪掉包覆其上的結(jié)締組織和脂肪，備用。

1.2.6 大鼠氣管環(huán)張力的測(cè)定。

通過(guò)2個(gè)鐵鉤將氣管環(huán)固定在裝有10 mL Kerbs-H溶液的麥?zhǔn)显∶笾小erbs-H溶液溫度控制在（37.0±0.5）℃，5%CO2～95%O2穩(wěn)定充氣。調(diào)節(jié)靜息張力為1 g，平衡90 min，每15 min更換一次新鮮的Kerbs-H溶液。平衡結(jié)束后，用60 mmol/L KCl溶液刺激氣管環(huán)，重復(fù)3次，使其發(fā)生最大幅度收縮，待氣管環(huán)穩(wěn)定30 min后，開(kāi)始?xì)夤苁鎻堅(jiān)囼?yàn)。

1.2.7 興安杜鵑對(duì)TSM的舒張作用。

1.2.7.1

興安杜鵑提取物及其3種主要成分對(duì)KCl預(yù)收縮的氣管環(huán)張力的影響。為了研究興安杜鵑提取物及其3種主要成分對(duì)氣管環(huán)平滑肌的舒張作用，首先用收縮劑60 mmol/L的KCl使氣管環(huán)預(yù)收縮7 min，然后依次加入興安杜鵑提取液、金絲桃苷、杜鵑素、槲皮素、茶堿和DMSO，其中茶堿和DMSO分別為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，試驗(yàn)濃度設(shè)計(jì)如表1所示，記錄氣管最大舒張值，并按以下公式計(jì)算舒張率：

1.2.7.2

撲爾敏對(duì)興安杜鵑舒張氣管平滑肌的影響。首先向浴皿中加入10-5 mol/L撲爾敏組胺H1受體拮抗劑，孵育30 min，當(dāng)氣管環(huán)張力維持常態(tài)時(shí)，加入60 mmol/L的KCl用于預(yù)收縮氣管環(huán)，當(dāng)氣管環(huán)張力達(dá)到峰值時(shí)，再分別加入興安杜鵑提取液、金絲桃苷、杜鵑素、槲皮素，設(shè)置對(duì)照組為未孵育的氣管環(huán)，整體試驗(yàn)濃度設(shè)計(jì)如表2所示，并記錄氣管最大舒張值。

1.2.7.3 Indo對(duì)興安杜鵑舒張氣管平滑肌的影響。

首先向浴皿中加入10-5 mol/L Indo環(huán)氧合酶抑制劑，孵育時(shí)間與加樣方式同“1.2.7.2”，并記錄氣管最大舒張值。

1.2.7.4 Gli對(duì)興安杜鵑舒張氣管平滑肌的影響。

首先向浴皿中加入10-5 mol/L Gli KATP 通道阻斷劑，孵育時(shí)間與加樣方式同“1.2.7.2”，并記錄氣管最大舒張值。

1.2.7.5 L-NAME對(duì)興安杜鵑舒張氣管平滑肌的影響。

首先向浴皿中加入10-4 mol/L L-NAME一氧化氮合酶抑制劑，孵育時(shí)間與加樣方式同“1.2.7.2”，并記錄氣管最大舒張值。

1.2.7.6 硝苯地平對(duì)興安杜鵑舒張氣管平滑肌的影響。

首先向浴皿中加入10-5 mol/L硝苯地平鈣通道阻滯劑，孵育時(shí)間與加樣方式同“1.2.7.2”，并記錄氣管最大舒張值。

1.2.7.7 普萘洛爾對(duì)興安杜鵑舒張氣管平滑肌的影響。

首先向浴皿中加入10-5 mol/L普萘洛爾β2腎上腺素受體阻滯劑，孵育時(shí)間與加樣方式同“1.2.7.2”，并記錄氣管最大舒張值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均以“±S”表示，采用Excel 2019軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩樣本進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC色譜分析

“1.2.1.3”HPLC條件下得到金絲桃苷、槲皮素、杜鵑素的混合標(biāo)準(zhǔn)品與提取樣品分析圖譜如圖2所示，金絲桃苷、槲皮素、杜鵑素保留時(shí)間分別為18.05、26.48、36.06 min，標(biāo)準(zhǔn)品溶液與樣品溶液目標(biāo)峰的保留時(shí)間相吻合，靈敏度高，峰形符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察。

根據(jù)“1.2.2.1”中線性關(guān)系考察方法，計(jì)算得出3種主要成分的回歸方程及決定系數(shù)，見(jiàn)表3。

2.2.2 精密度試驗(yàn)。

根據(jù)“1.2.2.2”中精密度試驗(yàn)考察方法，求得各標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的RSD。結(jié)果顯示，金絲桃苷、槲皮素、杜鵑素峰面積的RSD分別為1.23%、1.57%、0.96%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)。

根據(jù)“1.2.2.3”中穩(wěn)定性試驗(yàn)考察方法，求得樣品中3種主要成分峰面積的RSD。結(jié)果顯示，金絲桃苷、槲皮素、杜鵑素峰面積的RSD分別為1.15%、1.33%、1.27%，表明供試品溶液中金絲桃苷、槲皮素、杜鵑素在48 h內(nèi)表現(xiàn)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)。

根據(jù)“1.2.2.4”中重復(fù)性試驗(yàn)考察方法，求得3種主要成分峰面積的RSD。結(jié)果顯示，金絲桃苷、槲皮素、杜鵑素峰面積的RSD分別為1.95%、1.13%、1.61%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn)。

根據(jù)“1.2.2.5”中回收率試驗(yàn)考察方法，求得各興安杜鵑樣品中3種主要成分的平均回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.6 含量測(cè)定。

根據(jù)“1.2.1.3”中HPLC條件對(duì)3種主要成分含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得金絲桃苷、槲皮素、杜鵑素含量分別為1.58、1.81、1.77 mg/g（圖3）。

2.3 興安杜鵑對(duì)TSM的舒張作用

2.3.1 興安杜鵑提取物及其3種主要成分對(duì)KCl預(yù)收縮的氣管環(huán)張力的影響。

大鼠氣管環(huán)用收縮劑60 mmol/L的KCl預(yù)收縮7 min后，不同濃度的樣品溶液、陽(yáng)性對(duì)照液和空白對(duì)照液分別對(duì)預(yù)收縮的氣管環(huán)進(jìn)行舒張，舒張結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，對(duì)于以KCl預(yù)收縮后的氣管環(huán)，興安杜鵑提取物包括其3種主要成分均有不同程度的舒張作用，并呈濃度依賴性關(guān)系，處理⑥、處理⑦和處理⑧各受試樣品舒張率不低于93.4%，舒張作用與茶堿相當(dāng)。

2.3.2 撲爾敏對(duì)興安杜鵑舒張氣管平滑肌的影響。

大鼠氣管環(huán)經(jīng)撲爾敏預(yù)孵育和KCl預(yù)收縮后，不同濃度的樣品溶液和空白對(duì)照液分別對(duì)預(yù)收縮的氣管環(huán)進(jìn)行舒張，舒張結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，在預(yù)孵育的組織中，興安杜鵑提取物包括其3種主要成分均有不同程度的舒張作用，并呈濃度依賴性關(guān)系，當(dāng)樣品溶液終濃度在0.10 mg/mL以上（處理⑥～⑧）時(shí)，槲皮素組和杜鵑素組與未孵育組無(wú)顯著差異（P>0.05）；提取物組和金絲桃苷組與未孵育組均有顯著差異（P<0.001）且舒張作用明顯減弱，這說(shuō)明興安杜鵑舒張TSM可能受組胺H1受體影響，且發(fā)揮作用的活性成分可能是金絲桃苷。

2.3.3 Indo對(duì)興安杜鵑舒張氣管平滑肌的影響。

大鼠氣管環(huán)經(jīng)Indo預(yù)孵育和KCl預(yù)收縮后，不同濃度的樣品溶液和空白對(duì)照液分別對(duì)預(yù)收縮的氣管環(huán)進(jìn)行舒張，舒張結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知，在預(yù)孵育的組織中，興安杜鵑提取物包括其3種主要成分均有不同程度的舒張作用，并呈濃度依賴性關(guān)系，與未孵育組相比，處理⑦和處理⑧各樣品對(duì)TSM的舒張作用無(wú)顯著差異（P>0.05）。這說(shuō)明興安杜鵑舒張TSM可能不受環(huán)氧合酶（COX）抑制劑影響。

2.3.4 Gli對(duì)興安杜鵑舒張氣管平滑肌的影響。

大鼠氣管環(huán)經(jīng)Gli預(yù)孵育和KCl預(yù)收縮后，不同濃度的樣品溶液和空白對(duì)照液分別對(duì)預(yù)收縮的氣管環(huán)進(jìn)行舒張，舒張結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知，在預(yù)孵育的組織中，興安杜鵑提取物包括其3種主要成分均有不同程度的舒張作用，并呈濃度依賴性關(guān)系，與未孵育組相比，處理處理⑦和處理⑧各樣品（除杜鵑素組處理⑦外）對(duì)TSM的舒張作用無(wú)顯著差異（P>0.05）。這說(shuō)明興安杜鵑舒張TSM可能不受鉀離子通道影響。

2.3.5 L-NAME對(duì)興安杜鵑舒張氣管平滑肌的影響。

大鼠氣管環(huán)經(jīng)L-NAME預(yù)孵育和KCl預(yù)收縮后，不同濃度的樣品溶液和空白對(duì)照液分別對(duì)預(yù)收縮的氣管環(huán)進(jìn)行舒張，舒張結(jié)果見(jiàn)表9。由表9可知，在預(yù)孵育的組織中，興安杜鵑提取物包括其3種主要成分均有不同程度的舒張作用，并呈濃度依賴性關(guān)系。與未孵育組相比，各濃度提取物及金絲桃苷對(duì)TSM的舒張作用有顯著差異（P<0.05）；當(dāng)樣品溶液終濃度在0.08 mg/mL以上時(shí)（處理⑤～⑧），槲皮素組（除處理⑥外）和杜鵑素組無(wú)顯著差異（P>0.05）。這說(shuō)明興安杜鵑舒張TSM可能與一氧化氮合酶途徑有關(guān)，且發(fā)揮作用的活性成分可能是金絲桃苷。

2.3.6 硝苯地平對(duì)興安杜鵑舒張氣管平滑肌的影響。

大鼠氣管環(huán)經(jīng)硝苯地平預(yù)孵育和KCl預(yù)收縮后，不同濃度的樣品溶液和空白對(duì)照液分別對(duì)預(yù)收縮的氣管環(huán)進(jìn)行舒張，舒張結(jié)果見(jiàn)表10。由表10可知，在預(yù)孵育的組織中，興安杜鵑提取物包括其3種主要成分均有不同程度的舒張作用，并呈濃度依賴性關(guān)系。各濃度提取物及金絲桃苷對(duì)TSM的舒張作用顯著低于未孵育組（P<0.001）；在樣品溶液終濃度0.12 mg/mL以上（處理⑦、⑧）時(shí)，槲皮素組和杜鵑素組與未孵育組無(wú)顯著差異（P>0.05）。這說(shuō)明興安杜鵑對(duì)TSM的舒張可能與鈣離子內(nèi)流有關(guān)，且發(fā)揮作用的活性成分可能是金絲桃苷。

2.3.7 普萘洛爾對(duì)興安杜鵑舒張氣管平滑肌的影響。

大鼠氣管環(huán)經(jīng)普萘洛爾預(yù)孵育和KCl預(yù)收縮后，不同濃度的樣品溶液和空白對(duì)照液分別對(duì)預(yù)收縮的氣管環(huán)進(jìn)行舒張，舒張結(jié)果見(jiàn)表11。由表11可知，在預(yù)孵育的組織中，興安杜鵑提取物包括其3種主要成分均有不同程度的舒張作用，并呈濃度依賴性關(guān)系。與未孵育組相比，在處理⑥中提取物及金絲桃苷的舒張作用顯著高于未孵育組，處理⑦、處理⑧中提取物及3種主要成分與未孵育組沒(méi)有顯著差異（P>0.05），這說(shuō)明興安杜鵑舒張TSM可能不受β2受體影響。

3 結(jié)論與討論

該研究設(shè)立了同時(shí)測(cè)定興安杜鵑中金絲桃苷、槲皮素、杜鵑素3種主要成分的雙波長(zhǎng)-梯度洗脫高效液相色譜方法。所設(shè)立的含量測(cè)定方法靈敏度高、專屬性好，準(zhǔn)確度和精密度均符合規(guī)范，測(cè)得金絲桃苷、槲皮素、杜鵑素含量分別為1.58、1.81、1.77 mg/g。

TSM與其細(xì)胞上的多種受體和離子通道以及復(fù)雜的受體機(jī)制有關(guān)［13］。有研究報(bào)道，組胺H1受體拮抗劑對(duì)組胺引起的血管擴(kuò)張、平滑肌收縮、血壓下降等表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用［14］。興安杜鵑各樣品在撲爾敏孵育的大鼠氣管環(huán)上有明顯的濃度依賴性舒張作用，各濃度的興安杜鵑提取物及金絲桃苷的舒張作用明顯低于未孵育的組織，這表明興安杜鵑可能對(duì)組胺H1受體產(chǎn)生抑制作用，推測(cè)興安杜鵑發(fā)揮氣管舒張作用的活性成分可能是金絲桃苷。環(huán)氧合酶（COX）抑制劑可以抑制氣管內(nèi)皮細(xì)胞釋放前列環(huán)素（PGI2）引起平滑肌收縮［15］。興安杜鵑各樣品在Indo孵育的大鼠氣管環(huán)上有明顯的濃度依賴性舒張作用，當(dāng)樣品溶液終濃度在第6個(gè)濃度以上（處理⑦、⑧）時(shí)，各樣品溶液的舒張作用與未孵育組無(wú)顯著差異，表明興安杜鵑可能不會(huì)通過(guò)COX通道誘導(dǎo)TSM舒張。鉀離子通道阻斷劑通過(guò)抑制細(xì)胞的ATP敏感鉀通道使細(xì)胞膜去極化，觸發(fā)肌細(xì)胞的收縮［16］。興安杜鵑各樣品在Gli孵育的大鼠氣管環(huán)上有明顯的濃度依賴性舒張作用，當(dāng)樣品溶液終濃度在第6個(gè)濃度以上（處理⑦、⑧）時(shí)，各樣品溶液（除杜鵑素組處理⑦外）的舒張作用與未孵育組無(wú)顯著差異，表明興安杜鵑可能不會(huì)通過(guò)鉀離子通道誘導(dǎo)TSM舒張。

一氧化氮合酶可通過(guò)cGMP升高，促使平滑肌舒張［17］。興安杜鵑各樣品在L-NAME孵育的大鼠氣管環(huán)上有明顯的濃度依賴性舒張作用，各濃度的興安杜鵑提取物及金絲桃苷的舒張作用明顯低于未孵育組，表明興安杜鵑可能對(duì)NO的形成有增強(qiáng)作用，推測(cè)興安杜鵑發(fā)揮氣管舒張作用的活性成分可能是金絲桃苷。鈣離子通道阻滯劑可通過(guò)降低鈣離子（Ca2+）內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)的Ca2+減少，從而引起平滑肌收縮［18-19］。興安杜鵑各樣品在硝苯地平孵育的大鼠氣管環(huán)上有明顯的濃度依賴性舒張作用，各濃度的興安杜鵑提取物及金絲桃苷的舒張作用均顯著低于未孵育組，表明興安杜鵑對(duì)鈣離子通道可能存在抑制作用，推測(cè)興安杜鵑發(fā)揮氣管舒張作用的活性成分可能是金絲桃苷。β2受體拮抗劑可引起血漿腎素活性降低、血管收縮、支氣管痙攣［20］。興安杜鵑各樣品在普萘洛爾孵育的大鼠氣管環(huán)上有明顯的濃度依賴性舒張作用，當(dāng)樣品溶液終濃度在第6個(gè)濃度以上（處理⑦、⑧）時(shí)，各樣品溶液的舒張作用與未孵育組無(wú)顯著差異，表明興安杜鵑可能不會(huì)通過(guò)β2受體誘導(dǎo)TSM舒張。

該研究結(jié)果表明，興安杜鵑對(duì)由KCl收縮的未孵育的TSM具有明顯的濃度依賴性的舒張作用。其中，在撲爾敏、L-NAME、硝苯地平預(yù)孵育組中，金絲桃苷對(duì)TSM的舒張作用顯著低于未孵育組，推測(cè)興安杜鵑發(fā)揮氣管舒張作用的活性成分可能是金絲桃苷。并且這種強(qiáng)烈的舒張作用可能是通過(guò)抑制組胺H1受體、一氧化氮合酶途徑和鈣離子通道介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流來(lái)實(shí)現(xiàn)的。該研究可能存在以下局限性，興安杜鵑對(duì)TSM舒張作用可能在磷酸二酯酶、毒蕈堿受體、糖皮質(zhì)激素受體激活和可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶的刺激等方面起作用［21］，以上途徑將是下一步的研究?jī)?nèi)容。

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