真菌發(fā)酵銀杏葉產(chǎn)纖維素酶效果的比較

劉秋晨 單春?jiǎn)?劉恩 劉星 雷梓倫 劉艷 莊國(guó)宏

摘要 為獲得銀杏葉飼料纖維素酶高產(chǎn)菌株，對(duì)從古銀杏土壤中分離出的40株真菌進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明：在供試各類真菌中，曲霉菌產(chǎn)生的纖維素酶分解銀杏葉中的纖維素能力最強(qiáng)，其次是青霉，再其次是毛霉和木霉。若用于真菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的生產(chǎn)中，曲霉和青霉是比較優(yōu)良的菌種，其中編號(hào)為YX201040C的黑曲霉和編號(hào)為YX2010216的焦曲霉最為合適。

關(guān)鍵詞 真菌；纖維素酶； 酶活力；葡萄糖

中圖分類號(hào) S816.7? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2024）03-0187-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.045

Comparation of Cellulase Activity from Fungus Fermenting Gingko Leaves

Abstract To obtain fungus that can generate cellulase productively，the fermentation experiment of 40 strains of fungi isolated from ancient ginkgo soil was carried out.According to the experiment，we found that cellulose generated by Aspergillus can degradate the cellulose in ginkgo leaf fastest，Penicillium is in the next place，mucoraceae and trichoderma are in the third place. If we want to apply fungus to generate cellulose， Aspergillus and Penicillium are good selection， among them， Aspergillus niger named YX201040C and Aspergillus ustus named YX2010216 are the best choice.

Key words Fungus;Cellulase;Enzymatic activity;Glucose

銀杏又稱白果、公孫樹(shù)，國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，為銀杏科銀杏屬銀杏種，屬于裸子植物門(mén)，為我國(guó)獨(dú)有的樹(shù)種。在我國(guó)，銀杏分布范圍廣，20多個(gè)省市（區(qū)）都有銀杏的自然分布，銀杏資源非常豐富［1］。銀杏營(yíng)養(yǎng)豐富，含有淀粉、糖類、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素C、核黃素、胡蘿卜素和鈣、磷、鐵、鉀、鎂等礦質(zhì)元素，以及銀杏酸、白果酚［2］。銀杏葉多皺折，完整者呈扇形，上緣呈不規(guī)則的波狀彎曲，具二叉狀平行葉脈，細(xì)而密，光滑無(wú)毛，易縱向撕裂，多呈黃綠色或淺棕色［3］。作為藥材多用于治療肺虛咳喘、冠心病、心絞痛等［4］。銀杏葉中的主要活性成分有黃酮、萜內(nèi)酯、花青素和多糖等，且以黃酮為主。

銀杏黃酮不僅對(duì)機(jī)體的免疫細(xì)胞、體液及非特異性免疫功能有影響，而且還能增強(qiáng)機(jī)體的免疫器官功能［5］。黃酮類化合物中抗菌成分較多，對(duì)多種細(xì)菌有廣泛的抗菌譜。研究表明，黃酮對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌、豬霍亂沙門(mén)氏桿菌、大腸桿菌等均有抑制效果，并且其對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌的效果好于紅霉素［6］。黃酮通過(guò)影響體內(nèi)促性腺激素釋放激素（GnRH）、黃體生成素（LH）、阿片肽受體等與生殖相關(guān)的激素，提高動(dòng)物的生殖能力。禽類產(chǎn)蛋高峰期及其后期添加適量黃酮可提高產(chǎn)蛋率，可能與血液中T3、T4水平增高有關(guān)［7］。大量研究表明，黃酮還可通過(guò)作用于動(dòng)物的下丘腦—垂體—靶器官生長(zhǎng)調(diào)節(jié)軸，發(fā)揮促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用［8］。銀杏葉提取物可明顯抑制丙二醛（MDA）生成和紅細(xì)胞溶血作用，并且在清除自由基方面，銀杏葉提取物效率比維生素E還要高，能防止高脂肪的細(xì)胞膜被氧化［9］。研究表明，在肉仔雞中添加0.06%～0.12%的銀杏葉提取物，能顯著或極顯著降低血清甘油三酯，并有提高高密度脂蛋白含量，降低血清膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇含量的趨勢(shì)［10］。說(shuō)明銀杏葉提取物在提高機(jī)體對(duì)脂肪代謝能力方面有較明顯的效果。

銀杏葉具有多種保健功能，但銀杏葉的主要組分是木質(zhì)纖維素，這部分物質(zhì)的存在，大大降低了動(dòng)物對(duì)功能物質(zhì)的吸收利用［11］。 對(duì)木質(zhì)纖維素有較強(qiáng)降解能力的多為絲狀真菌，如瑞氏木霉（Trichoderma reesei） 的纖維素酶能有效地將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖； 康氏木霉 （T.koningii）、擬康氏木霉 （T.pseudokoningii） 和綠色木霉 （T.viride） 等也都具有很強(qiáng)的纖維素降解能力。

為獲得銀杏葉飼料纖維素酶高產(chǎn)菌株，對(duì)從古銀杏土壤中分離出的40株真菌進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，旨在為銀杏葉的深加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種：從湖北古銀杏森林公園古銀杏土壤中分離出真菌，共40株，主要為曲霉菌、青霉菌、木霉、毛霉和少數(shù)其他種屬菌種。

銀杏葉：由邳州銀杏研究所提供，為2011年秋季收獲，經(jīng)晾干后粉碎成40目左右的粉末。

1.2 銀杏葉固體培養(yǎng)基的制作、接種和培養(yǎng)

稱取30 g銀杏葉粉末，放入250 mL錐形瓶中，加入一定量的蒸餾水，調(diào)節(jié)蒸餾水到需要的pH，用玻璃棒攪拌均勻。用無(wú)菌培養(yǎng)封口膜封口，放入立式壓力蒸汽滅菌鍋中，121 ℃滅菌30 min后冷卻至室溫。采用相同的方法按需要制作培養(yǎng)基若干。在無(wú)菌條件下，用接種針挑取培養(yǎng)2 d的菌種菌體，接種到已滅菌的銀杏葉培養(yǎng)基中，并盡量混合均勻。將各接種后的培養(yǎng)基置于25 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 總纖維素酶活性的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［12］的方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 曲霉菌發(fā)酵銀杏葉產(chǎn)纖維素酶的效果

曲霉菌是食品和飼料中廣泛使用的真菌菌種，尤其是黑曲霉應(yīng)用最為廣泛，安全性好。目前我國(guó)允許使用黑曲霉生產(chǎn)飼料酶制劑，世界上一些國(guó)家，如美國(guó)已把黑曲霉列為動(dòng)物安全飼料微生物，允許應(yīng)用于生產(chǎn)飼用微生物飼料。筆者將從銀杏土壤中分離獲得的真菌用于銀杏葉的發(fā)酵，以期具有更好的適應(yīng)性，獲得更好的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力。使用從土壤中分離得到的曲霉菌對(duì)銀杏葉進(jìn)行發(fā)酵，曲霉的產(chǎn)酶能力見(jiàn)表1。

由表1可知， 參與試驗(yàn)的曲霉產(chǎn)生的纖維素酶活力在0.469～1.881 U/g，其中大部分集中在1.000～1.881 U/g，僅有個(gè)別品種產(chǎn)生的纖維素酶的活性低于對(duì)照組。

對(duì)照組中纖維素酶的活力為0.599 U/g左右，根據(jù)這個(gè)對(duì)照值可以看到，在曲霉屬中，編號(hào)為YX201040C的黑曲霉產(chǎn)生的纖維素酶的活性最強(qiáng)，達(dá)到了1.881 U/g；其次是編號(hào)為YX2010236的黑曲霉，它產(chǎn)生的纖維素酶活力是1.802 U/g；這2個(gè)品種曲霉產(chǎn)生的纖維素酶的活性較強(qiáng)，均為對(duì)照組中酶活性的3倍以上。

花斑曲霉產(chǎn)生的纖維素酶活力為1.404 U/g左右，焦曲霉產(chǎn)生的纖維素酶活力為1.517 U/g左右，僅次于編號(hào)為YX2010236的黑曲霉。

綜上所述，曲霉屬中，除了編號(hào)為YX2010027的黑曲霉、棒曲霉以及采色曲霉產(chǎn)生的纖維素酶活力低于對(duì)照組外，其余曲霉產(chǎn)生的纖維素酶活性均高于對(duì)照組，而且都在1.000～1.881 U/g。

雖然該試驗(yàn)中曲霉產(chǎn)生的纖維素酶活力最高也達(dá)到了1.881 U/g左右，但相對(duì)于現(xiàn)有文獻(xiàn)所測(cè)得的曲霉產(chǎn)生的酶類450 U/g 左右的活力［13］還是較低的，這可能是由于測(cè)定和計(jì)算方法不同所致。

2.2 青霉菌發(fā)酵銀杏葉產(chǎn)纖維素酶的效果 用從土壤中分離出的14株青霉屬菌種對(duì)銀杏葉進(jìn)行發(fā)酵，考察青霉菌株產(chǎn)生的纖維素酶活力，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，在青霉中，各品種產(chǎn)生的纖維素酶活性在0.300～1.458 U/g。小刺青霉和編號(hào)為YX2010324的青霉產(chǎn)生的纖維素酶活力遠(yuǎn)低于對(duì)照組，均在0.300 U/g左右，其余的青霉品種產(chǎn)生的纖維素酶活力均高于對(duì)照組。編號(hào)為YX2010201的青霉和編號(hào)為YX2010310的爪哇正青霉產(chǎn)生的纖維素酶活力是青霉屬中最高的，均在1.400～1.500 U/g；僅次于這2種青霉的是編號(hào)為YX2010227的紫青霉，其產(chǎn)生的纖維素酶活力為1.336 U/g；剩下的青霉品種產(chǎn)生的纖維素酶活力主要在0.600～1.200 U/g。總體而言，青霉產(chǎn)生的纖維素酶的活力比曲霉產(chǎn)生的纖維素酶活力要低，而且各品種間的差異也比曲霉大。因此，曲霉比青霉更適合發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，其產(chǎn)生的纖維素酶活性也相對(duì)較大。

2.3 毛霉菌和木霉菌發(fā)酵銀杏葉產(chǎn)纖維素酶的效果

用從土壤中分離出的毛霉屬和木霉屬菌株對(duì)銀杏葉進(jìn)行發(fā)酵，考察毛霉和木霉屬菌株產(chǎn)生的纖維素酶活力，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，毛霉菌產(chǎn)生的纖維素酶的活性均高于對(duì)照組，編號(hào)為YX2010050的多分枝毛霉菌產(chǎn)生的纖維素酶活性為0.995 U/g，編號(hào)為YX2010305的多分枝毛霉菌產(chǎn)生的纖維素酶活性為0.638 U/g。可見(jiàn)，編號(hào)為YX2010050的多分枝毛霉菌產(chǎn)生的纖維素酶活性比編號(hào)為YX2010305的多分枝毛霉菌要高出0.300 U/g。木霉菌產(chǎn)生的纖維素酶活性也都高于對(duì)照組，均在0.600～1.700 U/g，品種之間的差距偏大。其中，木霉產(chǎn)生的纖維素酶活性最大，達(dá)到了1.620 U/g；其次是康氏木霉和哈茨木霉，它們產(chǎn)生的纖維素酶活性分別為1.308和1.238 U/g 。李氏木霉和綠色木霉產(chǎn)生的纖維素酶活性均高于對(duì)照組，但是都低于1.000 U/g。其中，李氏木霉產(chǎn)生的纖維素酶活性為0.906 U/g ，綠色木霉產(chǎn)生的纖維素酶活性為0.744 U/g。

綜上所述，木霉產(chǎn)生的纖維素酶活性最高，甚至比所有青霉都高，在進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)和生產(chǎn)時(shí)，木霉可以作為除一些曲霉以外的選擇。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，金屬離子是許多菌種生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程中必不可少的物質(zhì)，尤其對(duì)毛霉而言［14］，在該試驗(yàn)中，毛霉產(chǎn)生的纖維素酶活性雖然都高于對(duì)照組，但都未超過(guò)1.000 U/g，應(yīng)該是存在一些因素影響了毛霉產(chǎn)纖維素酶活性。

2.4 其他真菌發(fā)酵銀杏葉產(chǎn)纖維素酶的效果

用從土壤中分離出的少量其他種屬菌株對(duì)銀杏葉進(jìn)行發(fā)酵，考察它們產(chǎn)生的纖維素酶活性，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，供試菌種產(chǎn)生的纖維素酶活性均高于對(duì)照組，主要集中在0.700～1.600 U/g。其中，編號(hào)為YX2010048的鐮刀霉產(chǎn)纖維酶的活性最高，達(dá)到了1.561 U/g ，高于大部分菌種；其次是弗基克羅（氏）赤霉，其產(chǎn)生的纖維素酶活性達(dá)到了1.411 U/g；鏈格孢菌產(chǎn)生的纖維素酶活性相對(duì)較低，只有0.728 U/g；其余菌種產(chǎn)生的纖維素酶活性大多集中在0.900～1.200 U/g，這與大部分菌種都很相似。

3 結(jié)論

供試菌種中，曲霉屬中除了編號(hào)YX2010027的黑曲霉外，其他黑曲霉產(chǎn)生的纖維素酶的活性相對(duì)較高，均在1.000 U/g以上，有些甚至在1.800 U/g以上；其余曲霉中，花斑曲霉和焦曲霉產(chǎn)生的纖維素酶活性與大部分黑曲霉產(chǎn)生的纖維素酶活性相當(dāng)，而泡盛曲霉、棒曲霉、采色曲霉產(chǎn)生的纖維素酶活性均較低，都與對(duì)照組相差不多。

在青霉屬中，編號(hào)為YX2010310的爪哇正青霉、編號(hào)為YX2010227的紫青霉以及編號(hào)YX2010201的青霉產(chǎn)生的纖維素酶活性較高，其余的青霉品種產(chǎn)生的纖維素酶活性大多低于曲霉產(chǎn)生的纖維素酶活性，其中以小刺青霉產(chǎn)生的纖維素酶活性最低，只有0.300 U/g左右，甚至低于對(duì)照組。

在毛霉屬和木霉屬中，編號(hào)為YX2010050的多分枝毛霉菌和李氏木霉產(chǎn)生的纖維素酶的活性均在0.900～1.000 U/g，差距很小；編號(hào)為YX2010305的多分枝毛霉菌和綠色木霉產(chǎn)生的纖維素酶的活性則相對(duì)較低，均在0.650 U/g左右，只比對(duì)照組稍高一些。

綜上所述，供試各類真菌中，曲霉菌產(chǎn)生的纖維素酶分解銀杏葉中的纖維素能力最強(qiáng)，其次是青霉，再其次是毛霉和木霉。若用于真菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的生產(chǎn)中，曲霉和青霉是比較優(yōu)良的菌種，其中編號(hào)為YX201040C的黑曲霉和編號(hào)為YX2010216的焦曲霉最為合適。

參考文獻(xiàn)

［1］曹福亮.中國(guó)銀杏［M］.南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2002.

［2］ 曹春月.銀杏葉綜合利用工藝研究開(kāi)發(fā)［D］.貴陽(yáng)： 貴州大學(xué)，2020.

［3］ 戴寶合.野生植物資源學(xué)［M］.2版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003.

［4］ 周珺瑤.銀杏葉提取物成分分析及其活性成分對(duì)肺癌一碳代謝的調(diào)控作用研究［D］.北京： 中央民族大學(xué)，2022.

［5］ ZHANG X H，ZHAO L G，CAO F L，et al.Effects of feeding fermented Ginkgo biloba leaves on small intestinal morphology，absorption，and immunomodulation of early lipopolysaccharide-challenged chicks［J］.Poultry science，2013，92（1）：119-130.

［6］ 施雅娜，伍振煌，王俊龍.植物黃酮類化合物的提取工藝、生物活性功能及在畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.飼料研究，2022，45（11）：128-133.

［7］ KSE K，DOGˇ P，A瘙塁IOGˇLU M，et al.In vitro antioxidant effect of Ginkgo biloba extract（EGb 761） on lipoperoxidation induced by hydrogen peroxide in erythrocytes of Beht’s patients［J］.Japanese journal of pharmacology，1997，75（3）：253-258.

［8］ 霍鋒，張渝皎，馬培貴，等.銀杏的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展［J］.四川林業(yè)科技，2008，29（5）：17-20.

［9］ 呂平，林明濤，楊柳枝.銀杏黃酮對(duì)活性氧自由基和過(guò)氧化氫清除作用的研究［J］.遼寧林業(yè)科技，2008（4）：17-19.

［10］ 陳國(guó)有，齊鶴，徐東花.黃酮類化合物的生物活性研究進(jìn)展［J］.黑龍江醫(yī)藥，2008，21（3）：81-83.

［11］ WANG J H，CAO F L，SU E Z，et al.Improvement of animal feed additives of Ginkgo leaves through solid-state fermentation using Aspergillus niger［J］.International journal of biological sciences，2018，14（7）：736-747.

［12］ 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).飼用纖維素酶活性的測(cè)定 濾紙法：GB/T 23881—2009［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

［13］ 董強(qiáng)，董云玲，錢(qián)凱先，等.黑曲霉菊糖酶的分離純化及其活性測(cè)定［J］.微生物學(xué)通報(bào)，1998，25（4）：195-198.

［14］ 賈翠英，張玉輝，張杰.金屬離子對(duì)毛栓菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶影響［J］.飼料研究，2012（3）：40-43.