宮頸癌患者血清miR-651、miR-630水平及臨床意義

張永珍 王珊珊 趙海靈 徐麗偉

新鄉市中心醫院（新鄉醫學院第四臨床學院）1檢驗科，2婦瘤科 （河南新鄉 453000）；3河南大學第一附屬醫院婦產科（河南開封 475000）

宮頸癌是女性相關癌癥死亡的主要原因之一，與宮頸癌發展相關的風險因素包括高危人乳頭瘤病毒（high-risk human papillomavirus， hrHPV）感染、年齡、吸煙、分娩、口服避孕藥和飲食，其中持續感染hrHPV 是宮頸癌的主要危險因素［1-2］。目前早期宮頸癌患者主要采用手術治療，晚期患者為綜合治療，但部分患者預后較差、復發率高，導致臨床治療效果不佳［3］。宮頸癌的早期診斷可降低發病率和病死率，宮頸細胞學檢查、HPV 檢測為主要檢測手段，但檢測較為麻煩，且特異度或靈敏度不高［4］。因此，尋找更簡單、更方便的檢測方法，如血清腫瘤標志物檢測，對早期發現宮頸癌，以改善宮頸癌的診斷和治療至關重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是20 ～ 22 個核苷酸的內源性非編碼RNA，在生物過程中發揮重要的調節作用，通過負向介導其靶基因調控細胞的增殖、凋亡和分化過程，有研究［5-6］表明具有致癌和腫瘤抑制功能的miRNA 參與包括宮頸癌在內的癌癥的形成和進展。已經確定宮頸癌的多種miRNA 標志物，miR-651 是一種癌癥相關miRNA，研究發現，外泌體miR-651 抑制可以抑制宮頸癌的耐藥性，可能作為宮頸癌的治療劑［7］。miR-630 參與多種癌癥的發生發展，研究［8］表明，miR-630在宮頸癌中低表達，與宮頸癌的發生和發展密切相關。miR-651、miR-630均可能與宮頸癌的發生發展有關，但二者在宮頸癌中的進展及預后中的臨床價值鮮見報道。因此本研究通過檢測miR-651、miR-630 的水平變化，為臨床評估宮頸癌的進展和預后提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2017 年6 月至2020 年5 月入院治療的宮頸癌患者108 例為宮頸癌組，年齡36 ～ 72歲，平均（44.82 ± 5.61）歲，其中＜ 50歲49例，≥ 50 歲59 例；HPV 感染者70 例，無HPV 感染者38 例；FIGO 宮頸癌分期：Ⅰ-Ⅱ期61 例、Ⅲ-Ⅳ期47 例；有淋巴結轉移42 例、無淋巴結轉移66 例；分化程度：低分化32 例，中高分化76 例；腫瘤直徑＜ 4 cm 者43 例、≥ 4 cm 者65 例。另選取在我院治療的宮頸上皮內瘤變（CIN）患者100 例為CIN組，年齡33 ～ 70 歲，平均（45.63 ± 5.38）歲，以及同期在我院健康體檢者110 例為對照組，年齡33 ～75 歲，平均（43.95 ± 5.44）歲。3 組年齡差異無統計學意義（P＞ 0.05），具有可比性。

納入標準：（1）經病理學診斷為宮頸癌患者，且符合國際婦產科聯合會（FIGO）分期標準［9］；（2）術前未接受任何抗腫瘤治療；（3）臨床資料完整。排除標準：（1）有其他嚴重疾病如免疫系統或內分泌系統疾病的婦女；（2）依從性差的婦女；（3）孕婦或哺乳期婦女；（4）合并其他宮頸疾病者；（5）既往腫瘤病史。本研究經醫院倫理委員會批準通過（編號：2017032），研究對象及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血清收集采集研究對象靜空腹脈血5 mL，離心分離出上清，保存于-80 ℃。

1.2.2 實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR， qRT-PCR）檢測血清miR-651、miR-630 水平使用TRIzol 試劑盒（美國Sigma 公司）提取血清中總RNA，對RNA 濃度定量后用逆轉錄試劑盒（日本Takara 公司）得到cDNA，隨后使用miRcute Plus miRNA qPCR Kit（北京天根生化科技有限公司）在ABI 7500 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）中進行基因表達定量分析。反應條件為：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，40 個循環。miR-651、miR-630 以U6 為內參，采用2-△△Ct法計算miR-651、miR-630 相對表達量。所有引物由上海生工公司合成。引物序列如下：miR-651：正向引物：5'-TGGGTAAAGTGCTTATAGTGC-3'，反向引物：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；miR-630：正向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGAGTATTCTGTACCA-3'，反向引物：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6：正向引物：5'-CATCACCATCAGGAGAGTCG-3'，反向引物：5'-TGACGCTTGCCCAGCCTT-3'。

1.2.3 隨訪術后對所有患者進行為期36 個月的隨訪，隨訪截止至2023 年5 月或患者死亡，以電話或復查形式記錄患者預后情況。

1.3 統計學方法SPSS 25.0 軟件進行數據分析，用例表示計數資料，采用χ2檢驗；用（±s）表示計量資料，兩組間采用t檢驗，三組間比較采用單因素方差分析。相關性分析采用Pearson 法。生存分析采用Kaplan-Meier 法。以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組血清miR-651、miR-630 表達比較相比于對照組，宮頸癌組、CIN 組患者血清miR-651、miR-630 表達顯著下降（P＜ 0.05），相比于CIN 組，宮頸癌組患者血清miR-651、miR-630 表達顯著下降（P＜ 0.05）。見表1。

表1 3 組血清miR-651、miR-630 表達水平比較Tab.1 Comparison of serum miR-651 and miR-630 expression in three groups ±s

表1 3 組血清miR-651、miR-630 表達水平比較Tab.1 Comparison of serum miR-651 and miR-630 expression in three groups ±s

注：與對照組相比，*P ＜ 0.05；與CIN組相比，#P ＜ 0.05

組別宮頸癌組CIN組對照組F值P值例數108 100 110--miR-651 0.32 ± 0.10*#0.68 ± 0.21*1.00 ± 0.32 239.305＜ 0.001 miR-630 0.41 ± 0.12*#0.73 ± 0.22*1.02 ± 0.34 168.773＜ 0.001

2.2 宮頸癌患者血清miR-651 與miR-630 表達相關性分析根據Pearson 相關性分析，血清miR-651與miR-630 呈正相關（r= 0.660，P＜ 0.05）。

2.3 宮頸癌患者血清miR-651、miR-630 表達與臨床特征的關系宮頸癌患者血清miR-651、miR-630 表達與HPV 感染、分化程度、淋巴結轉移、FIGO 分期有關（P＜ 0.05），其中有HPV 感染、低分化、有淋巴結轉移、FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期的宮頸癌患者血清miR-651、miR-630 表達水平顯著低于無HPV 感染、中高分化、無淋巴結轉移、FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期的患者（P＜ 0.05）；而與年齡、腫瘤大小無關（P＞ 0.05）。見表2。

表2 宮頸癌患者血清miR-651、miR-630 表達與臨床特征的關系Tab.2 Relationship between serum miR-651， miR-630 expression and clinical features in patients with cervical cancer ±s

表2 宮頸癌患者血清miR-651、miR-630 表達與臨床特征的關系Tab.2 Relationship between serum miR-651， miR-630 expression and clinical features in patients with cervical cancer ±s

臨床病理特征年齡＜ 50歲≥ 50歲HPV感染有無FIGO分期Ⅰ-Ⅱ期Ⅲ-Ⅳ期淋巴結轉移有無分化程度低分化中高分化腫瘤大小＜ 4 cm≥ 4 cm例數49 59 70 38 61 47 42 66 32 76 43 65 miR-651相對表達量0.31 ± 0.10 0.33 ± 0.09 0.29 ± 0.06 0.38 ± 0.10 0.36 ± 0.08 0.27 ± 0.04 0.28 ± 0.06 0.35 ± 0.08 0.27 ± 0.06 0.34 ± 0.07 0.31 ± 0.05 0.33 ± 0.07 t值1.093 5.848 7.058 4.864 4.941 1.619 P值0.277＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001 0.108 miR-630相對表達量0.40 ± 0.11 0.42 ± 0.12 0.35 ± 0.08 0.52 ± 0.14 0.45 ± 0.12 0.36 ± 0.10 0.34 ± 0.09 0.45 ± 0.13 0.33 ± 0.08 0.44 ± 0.09 0.40 ± 0.10 0.42 ± 0.12 t值0.895 8.041 4.149 4.797 5.987 0.904 P值0.373＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001 0.368

2.4 血清miR-651、miR-630 表達與宮頸癌患者預后的關系對所有的宮頸癌患者隨訪36 個月，108 例宮頸癌患者69 例生存，39 例死亡，總生存率為63.89%。分別以宮頸癌患者血清miR-651、miR-630 相對表達量中位數為標準，分為miR-651高表達患者54 例，miR-651 低表達患者54 例，miR-630 高表達患者54 例，miR-630 低表達患者54例。miR-651低表達患者總生存率（26/54，48.15%）明顯低于miR-651 高表達患者（43/54，79.63%）（χ2= 11.599，P= 0.001），miR-630 低表達總生存率（24/54，44.44%）明顯低于miR-630 高表達患者（45/54，83.33%）（χ2= 17.699，P＜ 0.001）。見圖1、2。

圖1 血清miR-651 表達與宮頸癌患者生存率的關系Fig.1 Relationship between serum miR-651 expression and survival of patients with cervical cancer

圖2 血清miR-630 表達與宮頸癌患者生存率的關系Fig.2 Relationship between serum miR-630 expression and survival of patients with cervical cancer

2.5 Cox 回歸分析影響宮頸癌患者預后的危險因素以宮頸癌患者生存情況（存活=0，死亡=1）為因變量，以HPV 感染（有=1，無=0）、淋巴結轉移（有=1，無=0）、FIGO 分期（Ⅰ-Ⅱ期=0、Ⅲ-Ⅳ期=1）、分化程度（低分化=1，中高分化=0）、miR-651（低表達=1，高表達=0）、miR-630（低表達=1，高表達=0）進行Cox 生存回歸分析。結果發現，HPV 感染、低分化程度、淋巴結轉移、FIGO 分期為Ⅲ-Ⅳ期、miR-651 低表達、miR-630 低表達，為宮頸癌患者預后的危險因素（P＜ 0.05）。見表3。

表3 Cox 回歸分析影響宮頸癌患者預后的危險因素Tab.3 Cox regression analysis of the risk factors affecting the prognosis of patients with cervical cancer

3 討論

宮頸癌是臨床常見的婦科惡性腫瘤，具有易轉移和復發的特性，導致宮頸癌的發病率和死亡率都很高，尤其是晚期患者5年生存率低于40%［10］。由于早期宮頸癌無明顯臨床癥狀，當患者因陰道異常出血、盆腔疼痛或性交困難而確診時已處于晚期，且經常伴有淋巴結轉移，臨床干預手段有限，導致患者預后較差。近些年從多方面對宮頸癌進行診斷治療，推行宮頸癌篩查計劃，廣泛使用HPV 疫苗，放療技術的進步也使宮頸癌治療相關毒性降低，但受復發和轉移的影響其發病率和病死率在一直上升。研究［11］發現，宮頸癌的長期生存與腫瘤診斷時的臨床分期、分化程度和遠處轉移密切相關，雖然遠處轉移和FIGO 分期可以預測宮頸癌患者的臨床結果，但它們可能不足以評估患者預后。因此，尋找更靈敏的早期診斷生物標志物和更有效、更安全的治療方法，對宮頸癌的防治和預后都有重要意義。

miRNA 作為廣泛研究的腫瘤標志物，是癌基因、腫瘤抑制因子或調節腫瘤發生途徑的重要組成部分，在腫瘤中異常表達，通過上調癌基因或下調腫瘤抑制因子參與調節細胞增殖、分化、周期進程、凋亡，還與癌癥病因、進展、轉移和預后相關［12-13］。miRNA失調影響宮頸癌疾病的發生、發展、轉移甚至預后，其中血清miRNA 較穩定可作為宮頸癌早期診斷和預后的生物指標［14］。miR-651 作為miRNA 家族的一員，在不同癌癥類型中充當腫瘤抑制因子。研究［15］發現，過表達miR-651-5p 通過靶向E 盒結合鋅指蛋白2 抑制紫外線輻射誘導的皮脂腺癌細胞惡性生物學行為。miR-651-3p 在肝癌組織和細胞系中顯著下調，可通過靶向自噬相關蛋白3（autophagy-related 3，ATG3）調節自噬，增強肝癌細胞對順鉑的敏感性［16］。還有研究［17］發現，miR-651-3p 在膠質瘤組織和細胞中顯著下調，通過負向調節特異性蛋白2 表達，抑制膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲和血管生成形成，發揮腫瘤抑制基因作用。miR-651 在宮頸癌中也發揮重要作用，過表達miR-651 可誘導宮頸癌細胞凋亡并削弱增殖［7］。本研究顯示，宮頸癌患者血清中miR-651 表達水平顯著低于CIN 組、對照組，表明miR-651 參與宮頸癌的發病。進一步研究發現，miR-651 表達水平與HPV 感染、分化程度、淋巴結轉移、FIGO 分期有關。說明miR-651 低表達可能與宮頸癌的發生發展有一定關系。可能是由于miR-651 在宮頸癌中發揮抑癌功能，靶向負調節ATG3 進而抑制ATG3 介導的細胞自噬，抑制宮頸癌細胞的增殖侵襲能力，促進凋亡。因此，宮頸癌中miR-651 表達下降，導致其對ATG3 的抑制能力減弱，促進宮頸癌細胞的惡性行為。

miR-630 是位于15q24.1 上的MIR630 基因，主要與免疫系統中的細胞因子信號傳導有關，在癌癥中發揮重要作用。miR-630 在不同癌癥類型中充當癌基因或腫瘤抑制因子，miR-630 在非小細胞肺癌中下調，其模擬物抑制細胞遷移、侵襲和增殖，促進凋亡［18］。miR-630 還在食管癌中低表達，其過表達可減少食管癌細胞侵襲和遷移［19］。研究［20］發現，miR-630 參與宮頸癌細胞的轉移和進展，可能作為宮頸癌的潛在生物標志物和治療靶點。還有研究［8］發現，miR-630 在宮頸癌細胞中表達降低，其通過靶向YES 相關蛋白1（Yes associated protein 1，YAP1）參與宮頸癌胞的增殖和遷移。本研究顯示，宮頸癌患者血清中miR-630 的表達水平顯著低于CIN 組、對照組，表明miR-630 參與宮頸癌發病。進一步研究發現，宮頸癌患者血清miR-630與有HPV 感染、低分化、有淋巴結轉移、FIGO 分期Ⅲ-Ⅳ期顯著相關。說明miR-630 低表達可能與宮頸癌的發生發展有一定關系。可能是由于在宮頸癌中miR-630 通過調節其靶基因YAP1，抑制YAP1的上調，進而抑制其對腫瘤侵襲、遷移和發生的促進作用。因此，在宮頸癌中miR-651 表達下降促進宮頸癌的發生發展。Pearson 相關性分析顯示，宮頸癌患者血清miR-651 與miR-630 呈正相關，表明二者共同調節宮頸癌的發生發展。

本研究Kaplan-Meier 生存曲線顯示，miR-651、miR-630 低表達患者3 年總生存率低于高表達患者，當miR-651、miR-630 同時下調時，宮頸癌的預后生存更差。進一步多因素Cox 回歸分析表明，miR-651、miR-630 低表達是影響宮頸癌患者不良預后的危險因素，表明宮頸癌不良預后與miR-651、miR-630 低表達有關，推測兩者表達可作為判斷宮頸癌者預后的標志物，用于臨床輔助工作。

綜上所述，宮頸癌患者血清miR-651、miR-630水平降低，兩者與HPV 感染、分化程度、淋巴結轉移、FIGO 分期及預后有關。然而miR-651、miR-630 在宮頸癌中發生發展的具體調控機制為深入探究，后續將增加動物實驗繼續研究。

【Author contributions】ZHANG Yongzhen performed the experiments and wrote the article. WANG Shanshan performed the experiments. ZHAO Hailing revised the article.XU Liwei designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.