溶酶體相關(guān)膜蛋白3通過(guò)VEGF/AKT通路抑制PC-3細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及血管生成

陳燦偉 廖壯文 范子文 黃帥 黃彥 陳斌偉

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科（廣州 510260）

前列腺癌（prostate cancer， PCa）是男性第二大的惡性腫瘤之一，合并骨轉(zhuǎn)移是PCa 患者的主要死因，研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性PCa 患者的5 年相對(duì)生存率為99%，而遠(yuǎn)處骨轉(zhuǎn)移灶患者的5 年相對(duì)生存率不超過(guò)30%。此外，當(dāng)PCa 轉(zhuǎn)移到骨后會(huì)引起包括高鈣血癥、頑固性劇烈疼痛、病理性骨折或神經(jīng)壓迫綜合征等相關(guān)并發(fā)癥［1-3］。溶酶體相關(guān)膜蛋白3（lysosome-associated membrane protein 3，LAMP3）是一種調(diào)控腫瘤細(xì)胞溶酶體功能的特異性膜蛋白，LAMP3 在骨肉瘤、卵巢癌、直腸癌及食管癌中發(fā)揮重要調(diào)控作用，但國(guó)內(nèi)外關(guān)于LAMP3在PCa 骨轉(zhuǎn)移的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道［4-7］。因此本研究將重點(diǎn)探索LAMP3 對(duì)PCa 骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞的影響及機(jī)制，為其作為潛在的治療靶點(diǎn)之一提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人PC-3細(xì)胞購(gòu)于ATCC細(xì)胞庫(kù)，HUVEC細(xì)胞及ECM 培養(yǎng)基購(gòu)于ScienCell 公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清雙抗購(gòu)自美國(guó)Gbico 公司；Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences 公司，CCK8 試劑盒購(gòu)自美國(guó)AbMole 公司；單克隆體體LAMP3、VEGF、GAPDH 均購(gòu)自美國(guó)Elabscience 公司，cyclin D1、c-myc、p-AKT、AKT 購(gòu)自美國(guó)CST 公司，BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒、ECL 發(fā)光液購(gòu)于碧云天公司，ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó) R&D system，Trizol 購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司，Prime ScriptTMRT Master Mix 試劑盒、SYBR?Select Master Mix 試劑盒購(gòu)于日本Takara 公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將PC-3 細(xì)胞以1 × 105個(gè)/孔的密度接種至6 孔平板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至70%時(shí)，使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑將Vector 及LAMP3-siRNA（序列如下5'-CACGAUGGCAGUCAAAUGATT-3' 和5'-UCAUUUGACUGCCAUCGUGTT-3'）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PC-3 細(xì)胞中，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后添加G418繼續(xù)篩選，24 h 后停止篩選繼續(xù)培養(yǎng)及傳代。

1.3 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖將轉(zhuǎn)染后的PC-3 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液并以4 × 103個(gè)/孔接種至96 孔板，貼壁后每孔加入100 μL CCK8稀釋液（含10 μL CCK8 原液），孵育2 h 后在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定細(xì)胞吸光度，設(shè)置5 個(gè)副孔并重復(fù)3 次。

1.4 劃痕試驗(yàn)將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞按1 × 105個(gè)/孔接種至6 孔板中，待細(xì)胞匯合到80%時(shí)用200 μL無(wú)菌移液器尖端劃痕，培養(yǎng)基洗滌后繼續(xù)培養(yǎng)，24 h 后通過(guò)使用顯微鏡拍照并使用Image J 軟件測(cè)量和計(jì)算間隙寬度。

1.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)用無(wú)血清培養(yǎng)基將轉(zhuǎn)染的PC-3 細(xì)胞重懸后，以5 × 105個(gè)/孔的密度接種至Transwell 上室中，下室加入含20% FBS 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后用4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗2 次用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，拍照后隨機(jī)選擇5 個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.6 條件培養(yǎng)液制備及血管分化試驗(yàn)取轉(zhuǎn)染si-LAMP3 后繼續(xù)培養(yǎng)2 代的PC-3 細(xì)胞，胰酶消化后分瓶培養(yǎng)至70 %時(shí)各取培養(yǎng)液6 mL，3 000 r/min離心15 min后收集上清液，制備條件培養(yǎng)基Vector-CM 及LAMP3-CM，使用孔徑為0.22 μm 的濾過(guò)膜濾過(guò)后-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。血管分化在Matrigel基質(zhì)膠上進(jìn)行，將預(yù)冷的Matrigel 膠預(yù)涂至96 孔板上并放入培養(yǎng)中聚合30 min，然后HUVEC 細(xì)胞以1 × 104個(gè)接種至培養(yǎng)孔中，然后分別每孔加入100 μL 上述條件培養(yǎng)基。24 h 后在顯微鏡下拍照并進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

1.7 ELISA使用 ELISA 檢測(cè)試劑盒定量測(cè)定條件培養(yǎng)基中的MMP9 和VEGF 表達(dá)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)檢測(cè) TGF-β1 和 VEGF 的表達(dá)，使用96 孔酶標(biāo)儀在450 nm 處進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)檢測(cè)組設(shè)置4 個(gè)副孔，結(jié)果取平均值并表示為 pg/mL。

1.8 RT-qPCR提取細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以1 μg 經(jīng)RNase 活性的DNA 酶預(yù)處理的RNA作為模板制備cDNA 文庫(kù)，然后使用實(shí)時(shí)PCR 試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為對(duì)照，通過(guò)2-ΔΔCq法計(jì)算LAMP3、VEGF、AKT 及p-AKT的mRNA 表達(dá)量。

1.9 Western blot將離心后的細(xì)胞PBS 洗滌后加入含有PMSF 和RIPA 的裂解液提取總蛋白，使用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。將樣品在10%的SDSPAGE 中電泳2 h，PVDF 膜電轉(zhuǎn)1.5 h 后用5%脫脂牛奶中封閉60 min。將PVDF 膜放在相應(yīng)的一抗（1∶1 000）中過(guò)夜孵育。搖床低速震蕩1 h 后TBST洗膜液洗滌3 次，放入二抗（1∶5 000）中低速震蕩1 h，孵育完成后TBST 液洗滌3 次，然后用ECL 發(fā)光液曝光條帶。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)由SPSS 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和GraphPad 作圖，計(jì)量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，使用t檢驗(yàn)評(píng)估組間差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α = 0.05，P ＜0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LAMP3 在PCa 細(xì)胞中的表達(dá)高于前列腺上皮細(xì)胞PCa 細(xì)胞LNCaP、C4-2B 及PCa 骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞PC-3 中LAMP3 的表達(dá)水平明顯高于前列腺上皮細(xì)胞REPE-1，且PCa 骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞PC-3 中LAMP3的表達(dá)水平最高（P ＜0.05，圖1）。

圖1 PCa 細(xì)胞與正常細(xì)胞中LAMP3 的表達(dá)水平Fig.1 The expression levels of LAMP3 were determined in prostate cancer cells compared with normal prostate epithelial cells

2.2 LAMP3 抑制PC-3 細(xì)胞的增殖我們構(gòu)建了穩(wěn)定沉默LAMP3 的PC-3 細(xì)胞，WB 結(jié)果表明成功沉默PC-3 細(xì)胞中LAMP3 基因表達(dá)，下調(diào)LAMP3能抑制與細(xì)胞周期相關(guān)的基因cyclin D1、c-myc 的表達(dá)（圖2A）。進(jìn)一步檢測(cè)LAMP3 對(duì)PC-3 細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組及空載對(duì)照組相比，沉默LAMP3 明顯抑制PC-3 細(xì)胞的增殖能力（P＜0.01，圖2B）。

圖2 沉默LAMP3 抑制PC-3 細(xì)胞的增殖Fig.2 LAMP3-silencing inhibited the cell proliferation of PC-3 cells

2.3 LAMP3 抑制PC-3 細(xì)胞的遷移與對(duì)照組及空載組相比，沉默LAMP3 的PC-3 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞的遷移能力明顯被抑制（P ＜0.01，圖3）。

圖3 沉默LAMP3 抑制PC-3 細(xì)胞的遷移亡（× 50）Fig.3 LAMP3-silencing inhibited the cell migration of PC-3 cells

2.4 LAMP3 抑制PC-3 細(xì)胞的侵襲為了探索LAMP3 對(duì)PC-3 細(xì)胞侵襲的影響，我們使用了Transwell試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明與對(duì)照組及空載對(duì)照組相比，沉默LAMP3的PC-3細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，PC-3細(xì)胞的侵襲能力明顯被抑制（P ＜0.01，圖4）。

圖4 沉默LAMP3 抑制PC-3 細(xì)胞的侵襲（× 50）Fig.4 LAMP3-silencing inhibited the cell invasion of PC-3 cells

2.5 LAMP3 抑制血管生成因子表達(dá)及血管生成為了探索LAMP3 對(duì)腫瘤誘導(dǎo)血管生成的影響，我們用沉默LAMP3 的PC-3 細(xì)胞制備的條件培養(yǎng)基si-LAMP3-CM 處理HUVEC 并在Matrigel 基質(zhì)膠模型中培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMP3 抑制了HUVEC的血管生成（圖5A），ELISA 結(jié)果也表明條件培養(yǎng)基si-LAMP3-CM 中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF、MMP9 的分泌明顯減少（P ＜0.05，圖5B-D）。

圖5 沉默LAMP3-CM 抑制MMP9、VEGF 表達(dá)及HUVEC 細(xì)胞的血管生成（× 50）Fig.5 Angiogenesis of HUVEC and the expression of both VEGF and MMP9 is inhibited under si-LAMP3-CM

2.6 LAMP3 通過(guò)下調(diào)VEGF/AKT 通路抑制LAMP3 的促血管生成作用為了探索LAMP3 對(duì)血管生成影響的分子機(jī)制，我們檢測(cè)了條件培養(yǎng)基si-LAMP3-CM 處理HUVEC 后相關(guān)分子的表達(dá)，結(jié)果表明LAMP3 抑制了VEGF 的表達(dá)，并下調(diào)AKT 的磷酸化，提示LAMP3 通過(guò)下調(diào)VEGF/AKT抑制了HUVEC 的血管生成（P ＜0.05，圖6）。

圖6 LAMP3 抑制PC-3 細(xì)胞的VEGF 及AKT 通路的表達(dá)Fig.6 LAMP3 inhibited the expression of VEGF and AKT signaling pathway in PC-3 cells

3 討論

前列腺癌是全球男性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，遠(yuǎn)處骨轉(zhuǎn)移是PCa 患者死亡的主要原因，盡管局部PCa 的治療取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，但轉(zhuǎn)移性PCa仍無(wú)法治愈，因此探索PCa 轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制對(duì)于尋找PCa 骨轉(zhuǎn)移的預(yù)防或治療策略至關(guān)重要［8-9］。LAMP3 作為一種溶酶體相關(guān)膜蛋白，最初發(fā)現(xiàn)其參與感染反應(yīng)過(guò)程中成熟樹(shù)突細(xì)胞 （CD208、DCLAMP）的抗原呈遞，是形成溶酶體和維持溶酶體功能的關(guān)鍵蛋白［10-11］。此外，LAMP3 還與細(xì)胞自噬密切相關(guān)，如可通過(guò)誘導(dǎo)溶酶體膜透化或組織蛋白酶重分布而引發(fā)細(xì)胞自噬性死亡［12-14］。最近的研究表明LAMP3 作為一種腫瘤相關(guān)特異性蛋白與腫瘤遷移、侵襲及耐藥有關(guān)，WU 等［15］發(fā)現(xiàn)與鄰近的正常組織相比，LAMP3 在喉部鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著升高，體內(nèi)外研究表明LAMP3可調(diào)控LAMP3/LAMC2/TNC通路抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，且LAMP3 與喉癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。LIU 等［16］發(fā)現(xiàn)下調(diào)LAMP3 能增加抑癌基因TP53 在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)并促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，抑癌基因TP53是LAMP3下游的關(guān)鍵調(diào)控基因。在本研究中，我們通過(guò)PCR及WB實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了LAMP3在PCa 細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常前列腺上皮細(xì)胞，其中以PC-3 及C4-2B 細(xì)胞上調(diào)最為明顯。隨后我們構(gòu)建了siRNA 以抑制LAMP3 在PC-3 細(xì)胞的表達(dá)并進(jìn)行了細(xì)胞增殖試驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)及Transwell 試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)LAMP3后PC-3的增殖、遷移和侵襲能力均明顯被抑制，與其他LAMP3 調(diào)控腫瘤的研究結(jié)果相似，該結(jié)果提示LAMP3 可能在PCa 骨轉(zhuǎn)移中起重要調(diào)控作用。

腫瘤誘導(dǎo)的異常血管生成是腫瘤快速發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)，在腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中會(huì)分泌大量促血管生成因子并募集內(nèi)皮細(xì)胞形成異常的新生血管，這些新生血管會(huì)誘發(fā)缺氧微環(huán)境以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲并阻礙免疫細(xì)胞的殺傷，因此腫瘤誘導(dǎo)的新生血管是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素和治療靶點(diǎn)［17-19］。Matrigel 基質(zhì)已廣泛應(yīng)用于體外研究血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成，其主要是通過(guò)Matrigel 基質(zhì)膠構(gòu)建生物培養(yǎng)平臺(tái)，以模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞在組織間的遷移和誘導(dǎo)形成管狀血管樣結(jié)構(gòu)，在體外可根據(jù)小管形成率和管樣結(jié)構(gòu)評(píng)估血管生成效果［20-21］。在本研究中，我們首先收集了沉默LAMP3 后PC-3細(xì)胞的上清液并制備成條件培養(yǎng)基LAMP3-CM，然后利用Matrigel 培養(yǎng)平臺(tái)在體外檢測(cè)了條件培養(yǎng)基LAMP3-CM 對(duì)HUVEC 細(xì)胞血管生成的影響，結(jié)果表明條件培養(yǎng)基LAMP3-CM 可明顯抑制HUVEC 細(xì)胞的血管生成，與對(duì)照組相比LAMP3-CM組HUVEC 細(xì)胞的血管樣小管數(shù)量明顯減少，該結(jié)果提示LAMP3 可能是抑制PC-3 細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成的靶點(diǎn)之一。

研究發(fā)現(xiàn)多種關(guān)鍵生成因子和信號(hào)通路調(diào)控腫瘤誘導(dǎo)的血管生成，其中由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF 及AKT 信號(hào)通路尤為重要［22-23］。AKT 信號(hào)通路中多個(gè)基因是誘導(dǎo)血管生成和維持血管通透性的重要分子，如VEGF、HIF-1α 與MMP9 是調(diào)節(jié)血管生成的關(guān)鍵基因，在多種基因和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下會(huì)刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)形成新血管［24-25］。DUAN 等［26］在發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可能通過(guò)激活PI3K/AKT-eNOS 信號(hào)通路傳導(dǎo)參與調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中的血管生成。YU 等［27］發(fā)現(xiàn)山奈酚通過(guò)下調(diào)VEGF/AKT 信號(hào)通路以抑制LPS 和TNF-α 誘導(dǎo)的大鼠腸道血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，同時(shí)AKT 和VEGF 形成自分泌回路來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成。在本研究中，我們的結(jié)果表明LAMP3 不僅下調(diào)了PC-3 細(xì)胞中VEGF 的分泌和表達(dá)，同時(shí)下調(diào)了AKT 的磷酸化水平從而抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成。

綜上所述，LAMP3 通過(guò)下調(diào)VEGF/AKT 通路抑制PC-3 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及血管生成，表明LAMP3 對(duì)PCa 的進(jìn)展具有重要的調(diào)控作用，但該結(jié)果僅為體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，LAMP3 對(duì)其他PCa 細(xì)胞如C4-2B 的影響及其在體內(nèi)的抑制作用尚未探索，因此下一步將在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證其抗瘤活性，為L(zhǎng)AMP3 作為新的PCa 轉(zhuǎn)移瘤治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【Author contributions】CHEN Canwei wrote the article. CHEN Canwei， LIAO Zhuangwen and FAN Ziwen performed the experiments.HUANG Shuai and HUANG Yan collected data. CHEN Binwei designed the study. All authors read and aplproved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.