羥基壬烯醛通過抑制內皮細胞焦亡減輕新生兒膿毒癥誘導的急性肺損傷

武周游 李婷 張騰偉 房巧燕 楊劉 黎巧

湖南省婦幼保健院新生兒一科（長沙 410008）

急性肺損傷（acute lung injury， ALI）是常見的膿毒癥臨床并發癥，具有較高的發病率和死亡率，其特征是肺的上皮層和內皮層均受損，導致肺水腫和急性呼吸衰竭［1-2］。因此，內皮細胞（epithelial cells， ECs）損傷或死亡被認為是ALI 的主要病理特征之一。目前，越來越多的證據表明細胞焦亡與ALI 有關。細胞焦亡由炎癥小體（NLRP3）觸發，并依賴于胱天蛋白酶-1（Caspase-1）激活和gasdermin D （GSDMD）裂解，誘導IL-1β 和IL-18 成熟［3］。臨床研究［4］發現，膿毒癥患者外周單核細胞中Caspase-1 的表達顯著增加，并與膿毒癥的發生和不良預后相關。此外，激活的NLRP3 炎性小體通過直接激活Caspase-1 介導的細胞焦磷酸轉移和間接釋放的促炎細胞因子而加重膿毒癥小鼠肺損傷［5-6］。因此，細胞焦亡被認為是維持肺內皮完整性和治療ALI 的潛在治療靶點。最近的數據［7］表明，內源性脂質或其氧化產物可以激活或抑制 NLRP3 的組裝。在由脂質過氧化產生的活性醛中，4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal， HNE）是最豐富的終產物。已證實，HNE 產生有益的效果，包括刺激內源性抗氧化防御機制、抑制炎癥和巨噬細胞焦亡［8］。然而，尚不清楚HNE 是否有助于減輕新生兒膿毒癥誘導的ALI。在本研究中，我們通過盲腸漿液（cecal slurry， CS）在野生型和GSDMD-/-新生小鼠中建立了ALI 模型，并通過腹腔注射HNE 治療，結果顯示HNE 可以通過下調NLRP3/caspase-1 信號來抑制ECs 細胞焦亡，進而有助于減輕肺部損傷。

1 材料與方法

1.1 動物和分組新生（5 ～ 7 d）C57BL/6J 雄性小鼠（野生型）和C57 GSDMD-/-雄性小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。小鼠飼養于SPF級實驗動物中心，室溫保持在大約22 ℃。研究經湖南省婦幼保健院倫理委員會審批通過（編號：2021-012-05）。將它們隨機分成5 只小鼠/籠，在12 h 的晝夜循環中正常喂食和飲水。將所有小鼠隨機分為5 組：（1）假手術組（Sham 組）；（2）假手術小鼠接受HNE 治療組（Sham+HNE 組）；（3）盲腸漿液（cecal slurry，CS）處理組（CS 組）；（4）CS 處理的GSDMD-/-小鼠組（CS + GSDMD-/-組）；（5）CS 小鼠接受HNE 治療組（CS + HNE 組）。根據文獻［9］描述的方法建立了CS 模型以誘導新生兒膿毒癥。具體操作為：處死成年小鼠，收集盲腸內容物并與5%葡萄糖溶液混合以產生CS 溶液（80 mg/mL）。在Sham 組和Sham + HNE 組中，小鼠接受0.9%鹽水的腹膜內注射。在其他組中，小鼠接受濃度為1.3 mg/g 體質量（BW）的CS 腹膜內注射。在CS +HNE 組，小鼠接受了腹腔注射CS 和6 μmol/L HNE（美國Sigma 公司）［8］。每12 h 記錄1 次小鼠的存活狀態，計算72 h 內小鼠的存活率，存活小鼠使用過量（150 mg/kg BW）的戊巴比妥鈉處死。收集肺組織進行蘇木精-伊紅（H&E）染色，以評估膿毒癥小鼠肺的病理損傷，從而確定建模是否成功。

1.2 肺組織病理學將肺組織固定在4%多聚甲醛中，包埋在石蠟中，切成5 μm 厚的切片，然后用H&E 染色。使用RX51 顯微鏡（日本Olympus 公司）進行組織病理學檢查。根據國際標準評估肺損傷評分［10］。從每個切片中隨機選擇6 個區域，根據5 個標準評估肺損傷的嚴重程度：（1）肺泡中性粒細胞積聚；（2）間質中性粒細胞積聚；（3）透明膜形成；（4）肺泡蛋白滲出；（5）肺泡間隔厚度。每個項目的得分為0 - 4，如下所示：0，無損傷；1，輕傷；2，中度損傷；3，重傷；4，非常嚴重的損傷。累積損傷的分數定義為ALI 的總分數。

1.3 肺濕/干重量比分離新鮮肺并稱重以測量濕重。然后，將它們在80 ℃的烘箱中干燥48 h，稱重以確定干重。最后，計算肺濕/干重比來評估肺水腫。

1.4 CT 圖像每組隨機抽取5 只小鼠，胸部CT掃描由廣州瑞舒生物科技有限公司完成。選擇在獲得的連續圖像中具有最小冠狀心包陰影圖像的橫截面圖像。

1.5 蛋白質印跡法用含有放射免疫沉淀分析緩沖液（美國Thermo Fisher 公司）的蛋白酶抑制劑混合物提取總肺蛋白，用BCA 試劑盒（美國Thermo Fisher 公司）測定濃度。將蛋白質濃度稀釋至3 μg/μL，并在100 ℃的恒溫水浴中煮沸10 min，使蛋白質樣品完全變性。使用8% ～ 12% SDSPAGE 凝膠分離蛋白，并轉移到0.45 μm 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。將PVDF 膜與第一抗體在4 ℃下孵育過夜，用含吐溫緩沖液的Tris 緩沖鹽水沖洗后，膜與第二抗體在室溫下孵育2 h。使用化學發光過氧化物酶底物（美國Millipore 公司）觀察蛋白質條帶。利用Image J 軟件進行定量光密度分析。本研究中使用了以下抗體：抗HNE、抗NLRP3、抗Caspase-1、抗GSDMD-N、抗IL-1β、抗IL-18、山羊抗兔IgG、β-Actin 和GAPDH（均購自英國Abcam 公司）。

1.6 RNA 測序和生物信息學分析使用RNAiso Plus（日本Takara 公司）從CS 組和CS + HNE 組小鼠的肺組織中提取總RNA。在定量和定性后，每個樣品1 μg RNA 用作RNA 樣品制備的輸入材料。使用NEB next ultraTMRNA Library Prep Kit（美國NEB 公司）在Illumina 系統上生成測序文庫。索引代碼被添加到每個樣品的屬性序列中。然后使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBotHS 在cBot-Cluster 生成系統上對索引編碼的樣品進行聚類。在Illumina Novaseq 平臺上對文庫制備物進行測序，產生了150 bp 的成對末端讀數。

用fastp（版本0.19.8）檢測和修剪接頭序列，然后進行原始閱讀質量過濾。通過HISAT2（版本2.1.0）將處理后的讀數與參考基因組（ENSEMBL基因組）進行比對。從ENSEMBL 數據庫的GTF file 下載創建用于描述基因組特征的模型。在R中使用DEseq2 分析差異表達基因（Differentially expressed genes， DEG）。在R 中使用kohonen 軟件包（版本3.0.10）進行聚類分析。使用R 軟件包clusterprofler（版本3.14.3）進行基因本體（GO）分析和基因集合富集分析（GSEA）。校正P＜ 0.05 的GO 術語或基因集分別認為是顯著富集的術語和途徑。

1.7 肺ECs 培養和分組在膿毒癥小鼠麻醉后，用無菌PBS 緩沖液灌注右心室，直到肺無血。隨后，將肺切成1 mm 的小片，用0.25%胰蛋白酶在37 ℃溶解45 min。用血小板內皮細胞粘附分子-1包被的磁珠分選所得細胞懸液。將分離的肺ECs鋪在纖連蛋白包被的T-25 燒瓶上。此外，用Dulbecco 氏改良Eagle 培養基培養ECs。使用流式細胞儀用抗CD-31 鑒定ECs，細胞＞ 90%未被污染。將ECs 分為Ctrl 組、LPS + ATP 組、LPS + ATP +HNE-L 組和LPS + ATP + HNE-H 組。除Ctrl 組外，其他組細胞用LPS（100 ng/mL，美國Sigma 公司）預處理細胞3 h，然后加入ATP（2 mmol/L，美國Sigma 公司）處理細胞60 min。對于LPS + ATP +HNE-L 組。

LPS + ATP + HNE-H組，在細胞暴露于LPS時，同時分別加入0.3 μmol/L HNE 或3 μmol/L HNE。Ctrl 組加入等量的DMSO 溶媒處理［8］。

1.8 免疫熒光將肺冷凍切片用甲醇固定。對于培養的細胞，將細胞鋪在蓋玻片上并用4%多聚甲醛固定。用山羊血清封閉后，將初級抗體加入切片中，在4 ℃孵育過夜。隨后，將切片在黑暗中與含有DAPI 和第二抗體的封閉緩沖液一起溫育2 h。使用RX51 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）獲得圖像。本研究中使用了以下抗體：抗HNE、抗GSDMD、抗Caspase-1 和Cy3 綴合的山羊抗兔IgG（均購自英國Abcam 公司）。

1.9 統計學方法使用SPSS 25.0 對數據進行統計分析。結果表示為平均值±標準偏差。通過方差分析和Newman-Keuls 檢驗分析組間差異。通過Kaplan-Meier 檢驗繪制生存曲線，通過log-rank檢驗分析組間差異。P＜ 0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膿毒癥小鼠肺組織中HNE水平顯著增加CS小鼠肺組織中的HNE 以時間依賴性方式逐漸降低。此外，我們在CS 小鼠中腹腔注射HNE，結果顯示小鼠肺組織中HNE 水平明顯增加（圖1）。

2.2 HNE 對CS 小鼠肺病變和死亡率的影響H&E 染色顯示，與CS 組相比，CS + HNE 組和CS +GSDMD-/-組小鼠的肺組織評分顯著降低（P＜ 0.05）（圖2A）。計算機斷 層掃描證實了HNE 和GSDMD基因缺失可以減輕肺損傷，并且CS + HNE 組和CS + GSDMD-/-組小鼠肺組織的濕和干重量比顯著低于CS 組（圖2B-C）。小鼠72 h 存活率觀察結果顯示，與CS 組相比，CS + HNE 組和CS + GSDMD-/-組小鼠的存活率顯著提高（P＜ 0.05）。

圖2 HNE 對CS 小鼠肺病變和死亡率的影響Fig.2 The effect of HNE on lung disease and mortality in CS mice

2.3 小鼠肺的 RNA 測序分析對標準化的基因計數進行差異表達分析，以確定各組之間的DEG。圖3A 顯示了CS 組和CS + HNE 組中P＜ 0.05 且差異倍數≥ 1.0 的DEG。在GSEA 研究中發現HNE下調了炎癥反應和氧化應激（圖3B-C）。DEG 的GO 分析揭示了HNE 在膿毒癥誘導的ALI 中的保護作用機制涉及細胞焦亡通路（圖3D）。

圖3 小鼠肺組織的RNA 測序分析Fig. 3 RNA sequencing analysis of mouse lung tissue

2.4 HNE 對 CS 小鼠肺細胞焦亡的影響CS 顯著上調小鼠肺組織中GSDMD 的表達，而HNE 顯著下調CS 小鼠肺組織中GSDMD 的表達（圖4A）。與Sham 組相比，CS 組肺ECs 中GSDMD-N 表達（GSDMD 的活性形式）顯著增加（P＜ 0.05）。CS +HNE組和CS + GSDMD-/-組小鼠的肺ECs中GSDMDN表達顯著低于CS組（P＜ 0.05）（圖4B）。與Sham組相比，CS 組肺ECs 中C-caspase-1、NLRP3、IL-18、IL-1β表達顯著增加（P＜ 0.05）。CS + HNE 組和CS+ GSDMD-/-組小鼠的肺ECs中C-caspase-1、NLRP3、IL-18、IL-1β 表達顯著低于CS 組（P＜ 0.05）（圖4C、D）。

圖4 HNE 對膿毒癥小鼠細胞焦亡激活的影響Fig.4 Effect of HNE on activation of cell apoptosis in septic mice

2.5 HNE 對ECs 細胞焦亡的影響在細胞實驗中，與Ctrl 細胞相比，LPS + ATP 顯著降低細胞活力（P＜ 0.05），和增加了GSDMD、C-caspase-1、NLRP3、IL-18、IL-1β的蛋白表達（P＜ 0.05），而這些作用也被HNE 抑制（圖5），表明HNE 通過NLRP3/Caspase-1 途徑調節ECs 細胞的焦亡作用。

圖5 HNE 在體外抑制了ECs 的細胞焦亡Fig.5 HNE inhibited the cell death of ECs in vitro

3 討論

ALI 是膿毒癥最常見的并發癥之一，病死率高。嚴重感染可導致過度炎癥反應和內皮屏障破壞，最終導致感染性ALI 的高死亡率［2］。因此，有效維持膿毒癥時ECs 的功能仍然是一個亟待解決的問題。先前研究［8］發現，HNE 不僅是脂質過氧化的產物，而且還作為信號分子發揮重要作用，通過調節NLRP3 炎癥小體的激活抑制炎癥。在這項研究中，HNE 在CS 誘導的新生膿毒癥小鼠肺組織中的表達顯著降低。體內和體外研究表明，HNE 通過抑制ECs 細胞焦亡減少ALI。

HNE 是一種多效性脂質過氧化標記物，其能夠干擾誘導炎癥的主要生物分子的信號轉導和活性并充當自由基的第二信使，因此參與各種病理生理過程［11］。最近的數據［8］表明，當細胞在LPS 刺激前用高劑量HNE（25 μmol/L）處理時，HNE 通過單核細胞和巨噬細胞中的NF-κB 信號調節IL-1β分泌，減輕肺損傷。近年來，在各種炎癥疾病模型中發現HNE 在調節炎癥和細胞凋亡中發揮重要作用［12-13］。這項研究發現，HNE 表達在膿毒癥小鼠肺組織中顯著降低，通過腹腔注射HNE 可在CS 誘導的ALI 小鼠模型中發揮保護作用。

細胞焦亡被認為是ALI 中內皮功能損傷的重要機制，也是ALI 治療的重要靶點［5］。因此，本研究分析了GSDMD 缺失和HNE 對膿毒性ALI 的影響。結果顯示，HNE 和GSDMD 基因缺失顯著減輕了ALI肺組織損傷，并提高了膿毒癥小鼠的存活率。通過對小鼠肺的RNA 測序分析，我們發現HNE 在膿毒癥誘導的ALI 中的保護作用機制涉及細胞焦亡通路。研究發現，生理濃度（3 μmol/L）的HNE阻斷了nigericin 和ATP 誘導的細胞焦亡［8］。此外，HNE 可顯著降低肺組織中促炎細胞因子水平和ECs 焦亡，并通過抑制Cas-11 的表達來減輕潰瘍性結腸炎的癥狀并改善的預后［14］。根據上述結果，我們推測HNE 通過抑制細胞焦亡在ALI 中發揮保護作用。

炎癥性胱天蛋白酶的激活是介導細胞焦亡的關鍵途徑［15-17］。NLRP3/Caspase-1 依賴型細胞焦亡在ALI 中起重要作用，并被認為是ALI 的潛在治療靶點［18-19］。LPS 可以通過TLR4-NLRP 3 信號通路誘導ECs 中Caspase-1 的激活［20］。研究［21-22］表明，Caspase-1 的激活不僅誘導ECs 焦亡，而且誘導IL-1β 產生，IL-1β 是增加毛細血管通透性和促進炎癥反應的重要因素。值得注意的是，最近研究證實HNE 是NLRP3 炎癥小體激活和隨后炎癥的一種新的內源性抑制劑，調節 HNE 的形成可能是抑制NLRP3 炎癥小體激活、IL-1β 分泌和組織炎癥的一種新的治療方法［8］。在這項研究中，HNE 的表達水平降低可能通過NLRP3/Caspase-1 途徑促進細胞焦亡。在體外研究中，我們采用LPS + ATP聯合刺激的方法模擬肺ECs 膿毒癥。與LPS + ATP組相比，HNE 抑制了NLRP3/Caspase-1 的激活以及GSDMD、IL-1β 的成熟，并增加了ECs 的活性。因此，HNE 可以阻止細胞焦亡，從而保護ECs 的完整性，維持屏障功能，抵抗致病因子的入侵。

總之，我們的結果表明，HNE 的表達在膿毒癥新生小鼠中降低，其可以通過抑制NLRP3/caspase-1信號傳導來抑制肺ECs 細胞焦亡，并改善小鼠的ALI。這些發現揭示了內源性脂質或其氧化產物在保護新生兒ALI 中的作用，提示了一種新的潛在治療策略。然而，這項研究并不是全面的，需要進一步研究以揭示內源性脂質或其氧化產物的深層調控機制，如HNE 的其他靶信號作為進一步研究的目標。

【Author contributions】WU Zhouyou performed the experiments and wrote the article. LI Ting and ZHANG Tengwei performed the experiments. FANG Qiaoyan and YANG Liu revised the article. LI Qiao designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.