熒光PCR 熔解曲線法在耐多藥結核病診治中的應用及分析

秦 萬 王明棟 歐維正 徐 勇

耐多藥結核病（multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB）是指同時耐異煙肼和利福平兩種以上抗結核藥物的結核分枝桿菌引起的結核病[1］，其防治已成為結核病防控的重點和難點之一，并引起有關結核防控專家的高度重視。WHO 于2020 年發布的《全球結核病報告》顯示，2019 年全球范圍內估計有1 000 萬例新發結核病患者，約3.3% （46.5 萬例）的初治患者和18%的復治患者對利福平耐藥，其中MDR-TB 患者約占78%，為 36.3 萬例[2］。MDR-TB 患者的治療時間長達2 年，治療藥品由多種二線抗結核藥品組成，副作用強，但治療成功率僅為54.0%[3-4］。

及時對結核病患者進行藥物敏感性試驗檢測（簡稱“藥敏檢測”）能夠及早發現耐藥，并提高MDR-TB 患者的治療成功率[5］。目前的藥敏檢測方案除了“金標準”表型藥物敏感性試驗（簡稱“表型藥敏”）外，臨床中用得較多的便是對耐藥基因進行檢測的分子生物學試驗，該技術在檢測時間上比表型藥敏更短，可在4～6小時內完成檢測并報告結果，為患者及時診斷和制定有效的治療方案帶來了極大的便捷。本研究對新引進的結核分枝桿菌耐藥基因檢測的PCR 熒光熔解曲線法（簡稱“熔解曲線法”）在貴陽市的開展情況進行探討，以期為MDR-TB 的診斷及全新治療方案的調整提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源與藥敏檢測 標本來源：收集2021 年1～7 月貴陽市公共衛生救治中心門診和住院結核患者經羅氏培養為陽性的84 種菌株。使用微孔板藥敏檢測法（以下簡稱“微孔板法”）檢測上述菌株對RFP、INH、EMB、FQs[包括左氧氟沙星（Lfx）和莫西沙星（Mfx）］的耐藥性。參考試劑盒說明書，將待測菌株的菌液稀釋到1.5～2.0 麥氏單位后加入液體培養基中，混勻后加樣至微孔板中，最后將微孔板放入37℃培養箱中，分別在第7 天、第10 天和第12 天進行結果判讀。表型藥敏試驗符合結核病診斷實驗室檢驗規程[6］。同時微孔板檢測的Lfx 和Mfx 作為氟喹諾酮參照藥物，兩種藥物中只要一種藥物耐藥便可判為氟喹諾酮耐藥；微孔板藥敏試驗為中敏的均按敏感處理；RFP 與INH 組合表示微孔板檢測的47 株MDR-TB 中熔解曲線檢測的耐藥菌株和敏感菌株數。

1.2 微孔板表型藥敏法示意圖 微孔板藥敏測試板提供不同種類及濃度的藥物，具體藥物濃度見圖1。最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration ，MIC）判讀：藥物濃度單位為μg/mL；當陽性對照孔A2、B2 為陽性時進行結果判讀，記錄每個藥物的MIC 值，MIC 值為無白色沉淀的最低藥物濃度孔。將MIC 值記錄在結果記錄紙上。耐藥（drug resistant，R），又稱抗藥性，耐藥性一旦產生，藥物的化療作用就明顯下降；敏感（sensitive，S）指某種致病菌對于抗生素的敏感，即應用常規劑量的抗生素就能把致病菌給抑制或者殺死掉。見圖1。

圖1 微孔板示意圖

1.3 核酸提取 在1.5 mL 離心管中加入500 μL TBDNA 提取液，然后用接種環在羅氏培養基上刮取一小環疑似結核菌株放入上述離心管中，充分振蕩后進行滅菌處理（95℃恒溫金屬浴15 min）。隨后，將菌懸液加入核酸自動純化試劑條的加樣孔中，并通過Lab-Aid? 824s 核酸自動提取儀進行核酸提取。最后，將純化的核酸一次性全部轉入1.5 mL 離心管中（大約130 μL）備用。

1.4 熒光PCR 熔解曲線法檢測 使用熔解曲線法分別進行RFP、INH、EMB 和FQs 耐藥突變檢測，嚴格按照試劑盒說明書操作。溶解曲線檢測結果見圖2。

1.5 測序驗證 對微孔板法和熔解曲線法檢測結果不一致的標本進行Sanger 測序（一代）驗證，驗證區域：利福平rpoB 基因 507～533 共27 個氨基酸密碼子區域內（81 bp，利福平耐藥決定區）；異煙肼ahpC 啟動子區（-44～-30 以及-15～3 位點）、inhA 啟動子區（-17～-8 位點）、inhA94 密碼子和katG315 密碼子；乙胺丁醇embB 基因306 位、406 位、497 位密碼子；氟喹諾酮gyrA 基因88～94 位密碼子（圖3）；測序引物序列見表1。

表1 測序引物

圖3 測序驗證圖

1.6 試劑與儀器 試劑：分枝桿菌藥敏檢測試劑盒（培養法）由珠海銀科醫學提供。結核分枝桿菌利福平、異煙肼、乙胺丁醇和氟喹諾酮耐藥突變檢測試劑盒（熒光PCR 熔解曲線法）由廈門致善提供。儀器：細菌超聲分散計數儀、自動讀器儀由廣東體必康提供；YK-909 分枝桿菌微孔板藥敏判讀儀、YK-96 小型全自動移液平臺儀均由珠海銀科醫學提供；Lab-Aid? 824s核酸提取儀、SLAN-96S 全自動PCR 儀由廈門致善提供。

1.7 質量控制

1.7.1 微孔板藥敏 本試劑盒對標準減毒株H37Rv（ATCC25277）的檢測結果應為陽性，接種到藥敏孔經培養后應完全受抑制，藥敏測定結果為敏感；對陰性質控品的檢測結果應為陰性。

1.7.2 熔解曲線法 應嚴格按照基因擴增檢驗的要求進行，耗材使用一次性物品，嚴格劃分區域操作等措施，避免交叉污染；每次試驗應設置陰陽性對照，只有當陰陽性對照結果正常方可分析出據報告，否則重復實驗。

1.8 統計學方法 采用Epidata 3.1 軟件進行數據錄入；采用SPSS 21.0 軟件對數據進行統計分析；以微孔板法為標準，計算熔解曲線法對RFP、INH、EMB 和FQs 4 種藥品的藥敏檢測符合率、靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和Kappa 值，其中Kappa 值在0.00～0.20 為極低一致性，0.21～0.40 為一般一致性，0.41～0.60 為中等一致性，0.61～0.80 為高度一致性，0.81～1.00 為幾乎一致性[7-9］。

2 結果

本研究共納入47 株MDR-TB 菌株和37 株對照菌株（微孔板藥敏檢測為全敏感菌株作為對照菌株）。以微孔板法為標準，熔解曲線法對RFP、INH、EMB、FQs的符合率、靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和Kappa 值見表2。兩種檢測方法不一致的樣本經Sanger 測序驗證，測序結果均與熔解曲線法的檢測結果一致。見表3。

表2 以微孔板法為標準評價熔解曲線法對4種藥品耐藥性檢測的價值

表3 兩種藥敏試驗不一致的結果與測序結果對比分析（株）

3 討論

導致耐藥性出現和迅速蔓延的一個重要因素是缺乏快速診斷，因此，快速診斷耐藥結核病獲得菌株耐藥信息是控制結核病傳播和治療的關鍵[10］。用藥前對患者進行結核分枝桿菌的藥敏檢測是制定耐藥結核病治療方案的重要依據。目前，羅氏比例法和MGIT960 表型藥敏試驗仍是WHO 推薦的方法，但總體來說存在操作繁瑣且耗時長的缺點，無法及時獲得藥敏結果來指導患者用藥。隨著結核分枝桿菌分子耐藥機制的深入研究，利用基因型方法快速檢測結核分枝桿菌的耐藥性在臨床逐漸得到廣泛應用。熒光PCR 熔解曲線法是國內近期研發的一種新型檢測技術，目前已普遍用于國內各結核病傳染醫院及結核預防控制機構，并獲得業內認可。該技術的優點是把擴增和檢測兩步驟合一，對多種一線及二線抗結核藥物進行耐藥檢測，具有實時擴增實時檢測、高效、快捷、簡便、經濟等優點，可以對結核分枝桿菌耐藥相關的多個基因同時檢測，特別適用于大批量篩查[11-14］。本研究顯示，熒光PCR 熔解曲線法對4 種抗結核藥品耐藥性檢測的靈敏度和特異性除乙胺丁醇外均在89% 以上，Kappa 值除乙胺丁醇外均≥0.78，說明這兩種方法檢測具有較高一致性。同時對檢測中結果不一致的用一代Sanger 測序驗證均與溶解性曲線法吻合，這也證明了該技術的可靠性。

化學療法仍然是結核病最重要的治療手段[15］。RFP 和INH 為治療結核病最重要的兩種藥物，對這兩種藥物進行及時的藥敏檢測有利于MDR-TB 患者早期發現。本次研究中有5 株RFP 藥敏結果差異，經Sanger 測序rpoB 基因有4 株相關基因位點突變，與溶解曲線結果一致，1 株溶解曲線敏感、微孔板法耐藥，經測序未檢測出rpoB 基因突變位點；2 株INH 溶解曲線法敏感、微孔板法耐藥的菌株經Sanger 測序相關katG 、inhA 、ahpC 基因位點未檢出突變；EMB 為另一種治療結核病的一線藥物，但其體外藥敏試驗可靠性差，需要更加準確、穩定的藥敏檢測方案為用藥提供指導。而本次研究中就有19 株EMB 藥敏結果差異，經Sanger 測序相關embB 基因306 位、406 位、497 位有17 株突變，均與溶解曲線法結果一致；2 株EMB 微孔板耐藥、溶解曲線敏感的菌株經測序embB 基因未檢出突變；WHO 于2018 年制定的《耐多藥和耐利福平結核病治療指南》更新版中將氟喹諾酮（Lfx 和Mfx）作為A類核心藥物[16］，同時Mfx 在治療廣泛耐藥結核病（XDR-TB）時不僅作為首選藥物，還需要全程使用[17］，由此可見FQs 在耐藥結核病治療中的重要地位。本研究中發現4 株FQs 結果差異，3 株溶解曲線耐藥、微孔板法敏感，測序gyrA 基因88～94 位密碼子結果均與溶解曲線結果一致；1 株微孔板耐藥、溶解曲線敏感，測序gyrA 基因未發現突變位點。本研究結果顯示，熒光PCR 熔解曲線法對以上4 種抗結核藥品耐藥性檢測的靈敏度均較高，顯示該技術對4 種藥品的MTB 耐藥相關基因位點覆蓋率較高。

據有關文獻報道，在臨床應用中基因型耐藥檢測與表型耐藥檢測存在不一致[18-19］，故本研究的主要設想就是利用微孔板法檢測三種常用的一線抗癆藥物和二線氟喹諾酮類藥物并與熔解曲線法進行對比，評估在高發病率、高耐藥結核病地區開展該新技術的必要性或重要性。從本研究結果中可以看出，熔解曲線法與微孔板法對MDR-TB、RFP、INH 和FQs 檢測結果的一致性較高，而對EMB 則顯示出中等一致性。對28份兩種檢測方法結果不一致的標本使用測序方法予以驗證。由本研究結果中可知，盡管兩種藥敏方法檢測結果有差異，但熔解曲線法結果與核酸測序結果完全一致，說明該方法在方法學角度上具有高度的準確性。而分子生物學檢測方法與表型藥敏檢測結果不一致的情況可能有以下原因：①熔解曲線法和Sanger 測序都僅對特定的已知耐藥突變區域進行檢測，若耐藥突變發生在檢測區域之外，或由其他耐藥機制導致（如藥物外排泵），則有可能出現分子生物學檢測為敏感而表型結果為耐藥的情況；②部分耐藥突變僅導致低水平耐藥，如rpoB511 和533 密碼子突變，其耐藥水平小于等于培養基的含藥濃度，則有可能出現分子生物學結果為耐藥而表型結果為敏感的情況[20］；③有關文獻報道，表型藥敏試驗本身存在不穩定性，可能導致不一致結果的出現[21］。

綜上所述，分子生物學的耐藥性檢測由于具有檢測的藥物種類多且全面、檢測報告時間短的優點日益受到廣大臨床醫師和醫療科研工作者的青睞。而溶解曲線法目前正符合此要求，不但在診斷性能方面，與“金標準”比例法具有高度的一致性外，還與測序法具有高度的吻合性。盡管如此，但對部分耐藥靶點檢測結果與表型藥敏試驗結果存在不一致，且其能夠檢測的基因位點有限。因此，可以將兩種檢測方法綜合運用于結核病診療中，優勢互補[22］。