烏鱧水泡病毒(SHVV)巢式PCR 檢測方法的建立與應用

婁劍鋒，公翠萍，肖自東，劉曉丹，胡大雁，勞順健

(1.湖州市南潯區農業技術推廣服務中心，浙江 南潯 313009；2.湖州市農業科學研究院，浙江 湖州313000；3.湖州市農業種質資源創新與應用重點實驗室，浙江 湖州 313000；4.揚州大學，動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225000）

巢式PCR 是建立在普通PCR 方法基礎之上的一種改進型方案，廣泛用于病毒基因的檢測。但是，目前還沒有建立巢式PCR檢測烏鱧水泡病毒的報道。本研究通過獲取感染烏鱧水泡病毒的雜交鱧組織，獲得病毒的相關基因，利用巢式PCR相關技術，通過體系的建立和反應程序的優化，建立一種檢測烏鱧水泡病毒的方法，為及時發現并快速診斷烏鱧水泡病毒提供一項重要的技術手段。

一、材料與方法

1.實驗樣品 烏鱧水泡病毒由實驗室保存，患病魚樣本采自廣東省順德市雜交鱧養殖場。

2.實驗試劑及儀器 實驗試劑：TRIpure Reagent、異丙醇、氯仿、75%乙醇；DEPC 水、50×TAE 緩沖液、10×EX Taq Buffer (Mg2+plus)、反轉錄酶、DL2000 DNA Marker、DNA 凝膠回收試劑盒、瓊脂糖凝膠(Biowest Agarose)。

實驗儀器：PCR 擴增儀、移液器、高速離心機、無菌操作臺、電泳儀、凝膠成像分析系統。

3.引物的設計 本實驗引物的設計根據NCBI已發表烏鱧水泡病毒相關的基因序列，使用Clone Manager 軟件, 根據基因組的序列進行比對，尋找到烏鱧水泡病毒(SHVV)核衣殼蛋白基因的保守區域。通過Primerprimer 軟件，設計并合成內外兩對烏鱧水泡病毒的PCR 引物(SHVV-1F、SHVV-1R；SHVV-2F、SHVV-2R)，引物詳情見表1。引物通過南京擎科生物公司制作，經PAGE純化后,通過ddH2O 配成濃度20 微摩爾/升，-20℃保存備用。

表1 SHVV巢式PCR引物

4.RNA 提取和反轉錄 RNA 的提取，取實驗室保存的烏鱧水泡病毒陽性病料的肝、腎組織。在無菌操作臺中，根據RNA 提取說明操作(Trizol法)，提取待檢測樣品病毒總RNA。提取的RNA很容易降解，需要立即進行反轉錄或者-20℃保存。

RNA 反轉錄，取0.2 毫升無酶離心管，配置以下混合液(10 微升)：RNA 模板×5 微升、Oligo Dt Primer(50 微摩爾)×1 微升、dNTP Mixture(10Mm each)×1微升、ddH2O×3微升，在PCR儀中65℃恒溫保持5 分鐘,迅速插入冰中冷卻；通過以上操作步驟，使RNA變性，提高反轉錄反轉效率。反轉錄體 系： 變 性 后 的 反 應 物× 10 微 升、 5 ×PrimeScript Ⅱ Buffer × 4 微 升 、 RNase Inhibitor (40 單 位/微 升) × 0.5 微 升、PrimeScript Ⅱ RTase (200 單 位/微 升) ×1 微升、RNase Free dH2O×4.5 微升，輕輕吹打搖勻。反轉錄反應：45℃，50 分鐘合成cDNA、95℃5 分鐘使酶失去活性,隨后立即放入冰盒冷卻3 分鐘，即為cDNA模板，-20℃保存備用。

5.巢式PCR方法的建立 巢式PCR需要兩對引物通過兩輪反應完成，配置的反應體系為20微升。

第一輪反應體系：上述反轉錄的cDNA 模板×1微升、SHVV-1F×1微升、SHVV-1R×1微升、10×EX Taq Buffer (Mg2+plus)×10 微升、ddH20×7 微升。PCR 反應程序：95℃預變性5 分鐘；95℃變性0.5 分鐘, 56℃退火0.5 分鐘，72℃延伸1 分鐘, 30 個循環；然后72℃延伸5 分鐘, 最后12℃降溫，4℃保存。

隨即進行第2 次PCR 擴增，以第1 次的PCR 擴增產物為模板，模板要相應減少，用第2對引物配置PCR 體系。第2 輪體系：PCR 擴增產物×1 微升、SHVV-2F×1 微升、SHVV-2R×1 微升、10×EX Taq Buffer (Mg2+plus)×10 微升、ddH20×7 微升。PCR 反應程序：95℃預變性5 分鐘；95℃變性0.5 分鐘，56℃退火0.5 分鐘, 72℃延伸1 分鐘，循環30 次接著72℃延伸5 分鐘，最后12℃降溫，4℃保存備用。

瓊脂糖凝膠電泳檢測，配置1×TAE 緩沖液和1.0%瓊脂糖凝膠；取5微升擴增樣品置于1.0%瓊脂糖凝膠孔內，同時DL2000 DNA Marker×6 微升作為參照，使用凝膠電泳儀120 伏電泳30 分鐘。電泳完成后，把瓊脂糖凝膠放在成像分析系統中觀察結果，拍照留存圖像。為保證PCR 反應的準確性、特異性，需要做凝膠回收并做相關測序檢測。使用瓊脂凝膠DNA 回收試劑盒回收DNA，操作步驟參見其使用說明書。凝膠回收完成后，將其回收產物送往南京擎科生物科技有限公司測定序列。

6.特異性檢測 本實驗以鯉春病毒血癥病毒、真鯛虹彩病毒、傳染性脾腎壞死病毒的DNA或cDNA為檢測樣品，同時以ddH2O作為陰性對照，用外引物SHVV -1F、SHVV-1R 進行PCR 擴增；以得到的擴增產物為模板，再用內引物SHVV-2F、SHVV-2R 進行二次擴增。配置1.0%瓊脂糖凝膠，電泳30分鐘,成像。觀察相對應條帶，分析其特異性。

7.靈敏性檢測 利用本研究建立的檢測方法，對1×104TCID50/毫升的病毒液進行10 倍倍比稀 釋(100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8)，隨后提取RNA，反轉錄合成cDNA。以cDNA為PCR模板，以相應體系和程序(同上)，分別進行巢式PCR 擴增。同時需設置一組陰性對照組，以ddH2O 為模板對照。分別取不同濃度PCR 模板的擴增產物5 微升進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，同時DL2000 DNA Marker×6微升作為參照，120伏電泳30 分鐘，觀察成像結果，保存圖片，評估本實驗建立的方法靈敏性。

8.臨床樣品檢測 選擇16 個患病雜交鱧肝組織臨床樣品，提取RNA，之后反轉錄cDNA。以此為DNA模板，用水作為陰性對照模板，利用上述實驗建立的烏鱧水泡病毒巢式PCR檢測方法，對所采集的臨床樣品進行檢測，做好結果記錄。將陽性結果進行凝膠回收，回收產物送南京擎科生物科技有限公司測定序列，并分析結果。

二、結果與分析

1.巢式PCR結果分析 組織樣品經過RNA提取步驟獲得相關RNA，之后反轉錄得到cDNA 模板,第一輪以外引物SHVV-1F、SHVV-1R 擴增，成像結果顯示(圖1)，條帶較暗淡，特異性不明顯，擴增產物長度在843 bp。以此PCR產物為模板，用第二對內引物SHVV-2F、SHVV-2R 再次進行PCR 擴增，結果顯示，擴增單一條帶明亮，特異性強，擴增產物長度在397 bp。本次實驗病毒樣品通過巢式PCR擴增，成像結果顯示，單一目的條帶明亮，特異性強，實驗方法適合于SHVV的特異性檢測。

圖1 SHVV巢式PCR檢測

2.PCR 產物測序結果分析 將巢式PCR 擴增產物膠回收后，送往相關公司測序，得到的結果與NCBI 已發表烏鱧水泡病毒(SHVV)相關的基因序列數據進行比對。結果顯示，樣品基因序列與烏鱧水泡病毒基因序列相對應的片段相一致，從而確定了該檢測方法的準確性。

3.特異性檢測結果分析 通過以上實驗建立的烏鱧水泡病毒巢式PCR檢測對不同種病毒樣品進行檢測，結果顯示SHVV 呈陽性(圖2)，擴增出了397 bp 單一目的條帶，實驗對照樣品鯉春病毒血癥病毒(SVCV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)、傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)以及ddH2O，均無任何條帶，呈陰性。以上實驗表明，烏鱧水泡病毒巢式PCR檢測方法特異性強，準確性高。

圖2 SHVV巢式PCR特異性檢測

4.靈敏性檢測結果分析 根據凝膠成像的結果顯示(圖3)，當檢測樣品病毒液稀釋濃度為1×10-6倍以內，可觀察到明亮的單一條帶。當樣品病毒液稀釋濃度達到1×10-7倍以上，則無法擴增出特異性條帶。表明本實驗建立的巢式PCR方法對烏鱧水泡病毒最低檢測濃度為1×0.01TCID50/毫升。

圖3 SHVV巢式PCR靈敏性檢測

5.臨床樣品檢測結果分析 16 個臨床樣品通過SHVV巢式PCR檢測，其結果顯示(圖4)，13個樣品擴增出了特異性條帶，呈陽性；3個臨床樣品以及陰性對照ddH2O 無條帶，呈陰性。將檢測出來的陽性臨床樣品進行凝膠回收，回收產物進行基因測序。檢測出的基因序列同烏鱧水泡病毒(SHVV)相關的基因序列比對。結果顯示，呈陽性的檢測樣品基因序列與SHVV 基因序列一致，表明本實驗建立的SHVV 巢式PCR 方法特異性強、靈敏度高，能夠準確、快速地檢測出患病魚是否感染烏鱧水泡病毒，可運用于臨床樣品的檢測。

圖4 SHVV巢式PCR特異性檢測

三、結論

本實驗方法的建立為烏鱧水泡病毒的臨床診斷與預防提供了一項重要的技術手段，對實施烏鱧水泡病毒的鑒定、分離等研究提供了技術方案。