腸道菌群與叢集性頭痛的因果關(guān)系：兩樣本孟德爾隨機(jī)化分析

郭玉夢，崔楊霖，孔雨晨，高磊，張憲忠

作者單位：1.250014 山東省濟(jì)南市，山東中醫(yī)藥大學(xué) 2.276800 山東省日照市中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)經(jīng)典科

叢集性頭痛（cluster headache，CH）是最嚴(yán)重的原發(fā)性頭痛類型，常單側(cè)發(fā)作并出現(xiàn)嚴(yán)重的頭面部疼痛［1］，通常伴有同側(cè)自主神經(jīng)癥狀，如上瞼下垂、瞳孔縮小、面部發(fā)紅或潮紅、鼻塞、流涕、眶周腫脹、煩躁不安或激越等，但其病理生理學(xué)機(jī)制復(fù)雜［2］。研究表明，約55%的CH患者發(fā)作期出現(xiàn)自殺傾向，故其又被稱為“自殺性頭痛”［3］。既往研究表明，CH與偏頭痛具有部分相同的臨床特征，包括前驅(qū)癥狀、發(fā)作性視覺超敏反應(yīng)、發(fā)作性異常性疼痛和自主神經(jīng)癥狀［4］。全基因組關(guān)聯(lián)研究薈萃分析結(jié)果顯示，CH與偏頭痛至少共享1個遺傳位點，故兩者具有部分相同的解剖結(jié)構(gòu)和病理生理學(xué)機(jī)制［5］。研究表明，腸道菌群與偏頭痛的發(fā)病相關(guān)［5-6］，如TANG等［7］研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群紊亂可能通過上調(diào)TNF-α表達(dá)而導(dǎo)致偏頭痛的發(fā)生?；贑H與偏頭痛存在相似性，筆者提出腸道菌群也是誘發(fā)CH的病理因素的假設(shè)?；诖耍狙芯坎捎脙蓸颖久系聽栯S機(jī)化（Mendelian randomization，MR）分析探討腸道菌群與CH的因果關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)計

采用兩樣本MR分析方法，以腸道菌群為暴露因素，CH為結(jié)局，分析腸道菌群與CH的因果關(guān)系。

1.2 數(shù)據(jù)來源

1.2.1 腸道菌群數(shù)據(jù)集

腸道菌群數(shù)據(jù)集來自MiBioGen聯(lián)盟（https://gwas.mrcieu.ac.uk/）的匯總數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)集包括18 340例不同種族和國籍的參與者的16S rRNA基因測序數(shù)據(jù)（72.3%為歐洲人，27.7%為中東、東亞、美國西班牙裔/拉丁裔和非裔美國人）［8］，共涉及1 053 032 560個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）。

1.2.2 CH數(shù)據(jù)集

CH數(shù)據(jù)集來自R9版本的芬蘭數(shù)據(jù)庫（https://r9.finngen.fi/），該數(shù)據(jù)集包括288 944例參與者，其中CH患者1 107例、健康對照者287 837例，共涉及20 167 676個SNP。

1.3 篩選工具變量

剔除15種未知菌屬后，本研究共納入196種腸道微生物。各腸道微生物工具變量應(yīng)滿足以下條件：（1）在基因位點范圍內(nèi)存在顯著性閾值（P＜1.0×10-5）的SNP被作為潛在工具變量［9］；（2）排除連鎖不平衡的SNP，即r2＜0.001；（3）區(qū)域?qū)挾葹?0 000 kD，以確保各SNP間相互獨立；（4）選取F＞10的SNP，以排除弱工具變量［10］。F值計算公式如下：F=β2/se2［11］，其中β為效應(yīng)值、se為標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.4 兩樣本MR分析過程

1.4.1 正向MR分析

（1）MR分析方法：本研究主要采用逆方差加權(quán)法（inverse variance weighting，IVW）進(jìn)行MR分析，以探討腸道菌群與CH的潛在因果關(guān)系，并采用錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）校正P值，以P＜0.05且PFDR＜0.10為存在因果關(guān)系，P＜0.05且PFDR≥0.10為可能存在潛在關(guān)聯(lián)［12-13］。其次，以MR-Egger回歸、加權(quán)中位數(shù)法（weighted median estimator，WME）、加權(quán)眾數(shù)法（weighted mode，WM）、簡單眾數(shù)法（simple mode，SM）作為IVW的補(bǔ)充方法，當(dāng)MR-Egger回歸、WME、WM、SM的β值與IVW的β值方向一致時，提示IVW結(jié)果穩(wěn)定可靠［14］。（2）統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性：應(yīng)用CochranQ檢驗評估SNP間是否存在統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性，P＜0.05提示SNP間存在統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性。（3）水平多效性：采用MR-Egger回歸的截距項評估SNP的水平多效性，若截距項與0相比無統(tǒng)計學(xué)意義，表明SNP不存在水平多效性［15］。（4）離群值：采用MR-PRESSO法識別SNP的離群值，并剔除離群值后重新進(jìn)行MR分析［16］。（5）敏感性分析：采用留一法進(jìn)行敏感性分析，以判斷單個SNP對MR分析結(jié)果的影響［17］。

1.4.2 反向MR分析

以CH為暴露因素，腸道菌群為結(jié)局，僅采用IVW、MR-Egger回歸分析腸道菌群與CH的反向因果關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 工具變量

196種腸道微生物包括9門、16綱、20目、32科、119屬，共得到2 774個與腸道微生物高度相關(guān)的SNP。

2.2 正向MR分析

IVW 分析結(jié)果顯示，放線菌門是CH 的危險因素〔OR=1.786，95%CI（1.154 ～2.764），P=0.009，PFDR=0.046〕，糞球菌屬1是CH的保護(hù)因素〔OR=0.563，95%CI（0.355～0.894），P=0.015，PFDR=0.074〕，副擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬9、瘤胃球菌屬UCG003組與CH具有潛在關(guān)聯(lián)（P值分別為0.036、0.036、0.048，PFDR值分別為0.180、0.180、0.240）。且MR-Egger回歸、WME、WM、SM的β值與IVW的β值方向一致，見表1、圖1。

圖1 腸道菌群與CH因果關(guān)系的5種MR分析方法結(jié)果散點圖Figure 1 Scatter plots of the results of five MR analysis methods for the causal relationship between intestinal flora and CH

CochranQ檢驗分析結(jié)果顯示，與上述5種腸道微生物高度相關(guān)的SNP間不存在統(tǒng)計學(xué)異質(zhì)性（P＞0.05）；MR-Egger回歸的截距項分析顯示，與上述5種腸道微生物高度相關(guān)的SNP不存在水平多效性（P＞0.05）；MRPRESSO法分析結(jié)果顯示，與上述5種腸道微生物高度相關(guān)的SNP不存在離群值（P＞0.05），見表2。留一法分析結(jié)果顯示，剔除單個SNP后，MR分析結(jié)果無明顯改變，見圖2。

圖2 腸道菌群與CH因果關(guān)系的留一法分析結(jié)果Figure 2 Leave-one-out analysis results of the causal relationship between intestinal flora and CH

表2 與腸道菌群高度相關(guān)的SNP的Cochran Q檢驗、MR-Egger回歸、MR-PRESSO法分析結(jié)果Table 2 Results of Cochran Q test, MR-Egger regression and MRPRESSO method analysis of SNP highly correlated with intestinal flora

2.3 反向MR分析

反向MR分析結(jié)果顯示，CH與放線菌門、糞球菌屬1、副擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬9、瘤胃球菌屬UCG003組不存在反向因果關(guān)系（P＞0.05），見表3。

表3 CH與腸道菌群因果關(guān)系的IVW、MR-Egger回歸分析結(jié)果Table 3 IVW and MR-Egger regression analysis results of the causal relationship between CH and intestinal flora

3 討論

研究表明，CH的疼痛機(jī)制是三叉神經(jīng)源性炎癥［18］，炎癥可引起三叉神經(jīng)-副交感神經(jīng)反射［19］，而三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)激活可誘導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)與促炎遞質(zhì)的分泌，如降鈣素基因相關(guān)肽、一氧化氮和神經(jīng)激肽［20］，進(jìn)而加劇疼痛；此外，上述物質(zhì)也可以影響三叉神經(jīng)系統(tǒng)，誘導(dǎo)相關(guān)疾病發(fā)作［21］，如降鈣素基因相關(guān)肽會引發(fā)肥大細(xì)胞脫顆粒，并與P物質(zhì)一起導(dǎo)致神經(jīng)源性炎癥［22-23］，促進(jìn)一氧化氮合成及三叉神經(jīng)致敏，從而驅(qū)動CH并加劇疼痛［24］。5-羥色胺是一種存在于周圍神經(jīng)的神經(jīng)遞質(zhì)，其分泌增多會刺激腦血管，誘發(fā)三叉神經(jīng)核活動，進(jìn)而引發(fā)CH［25-26］。另有研究發(fā)現(xiàn)，白介素1β可調(diào)節(jié)三叉神經(jīng)中傷害性感覺神經(jīng)元總電壓依賴性鈉電流，進(jìn)而引發(fā)炎癥相關(guān)性痛覺過敏［27-28］。上述物質(zhì)不僅與CH關(guān)系密切，還與腸道菌群相關(guān)。研究表明，腸道菌群可影響背根神經(jīng)節(jié)中降鈣素基因相關(guān)肽的產(chǎn)生［29］。XIANG等［30］研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌與辣椒素誘導(dǎo)的胃腸道炎癥模型小鼠血清降鈣素基因相關(guān)肽水平呈正相關(guān)。5-羥色胺又稱為血清素，90%來自胃腸道，由腸嗜鉻細(xì)胞分泌［31］。ZHANG等［32］研究發(fā)現(xiàn)，長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、丁酸梭菌、嗜熱鏈球菌、糞腸桿菌等可以產(chǎn)生5-羥色胺酸和5-羥色胺。CH與偏頭痛在發(fā)病機(jī)制及臨床癥狀方面具有相似性［2］。近年學(xué)者發(fā)現(xiàn)，腸道菌群可通過腦腸軸與偏頭痛產(chǎn)生關(guān)聯(lián)［33］，此外，很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病如多發(fā)性硬化癥、精神分裂癥、阿爾茨海默病、帕金森病等均與腦腸軸功能障礙有關(guān)［34-36］，CH同為神經(jīng)疾病，故可能與腸道菌群相關(guān)。

本研究采用兩樣本MR分析探討腸道菌群與CH的因果關(guān)系，結(jié)果顯示，放線菌門是CH的危險因素，糞球菌屬1是CH的保護(hù)因素，副擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬9、瘤胃球菌屬UCG003組與CH具有潛在關(guān)聯(lián)。分析原因為：與降鈣素基因相關(guān)肽和5-羥色胺呈正相關(guān)的雙歧桿菌屬于放線菌門，其衍生的神經(jīng)遞質(zhì)、炎癥因子等物質(zhì)可能通過腦腸軸或通透性增加的腸壁而直接或間接地影響顱神經(jīng)，從而誘發(fā)CH；普雷沃氏菌是一種可產(chǎn)生豐富丁酸和丙酸的腸道菌群，而丁酸和丙酸能有效抑制炎癥反應(yīng)，從而延緩CH的發(fā)生［37］；但目前，糞球菌屬1、副擬桿菌屬、瘤胃球菌屬UCG003組與CH相關(guān)的具體機(jī)制尚未見報道，仍有待進(jìn)一步研究探索。

本研究的優(yōu)勢：（1）本研究樣本量較大，可有效避免混雜因素的干擾；（2）IVW結(jié)果穩(wěn)定可靠。本研究的局限性：（1）由于腸道菌群的最低分類水平是屬，故無法在物種水平上分析腸道菌群與CH的因果關(guān)系；（2）本研究數(shù)據(jù)來源于歐洲人群，該結(jié)果是否在亞洲人群中成立尚有待進(jìn)一步研究證實；（3）既往關(guān)于腸道菌群與CH關(guān)系的研究報道較少，無法深入闡釋上述腸道菌群與CH相關(guān)的機(jī)制。

4 結(jié)論

綜上所述，放線菌門是CH的危險因素，糞球菌屬是CH的保護(hù)因素，副擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬9、瘤胃球菌屬UCG003組與CH具有潛在關(guān)聯(lián)。后期仍有待大樣本量RCT進(jìn)一步闡明放線菌門、糞球菌屬與CH的因果關(guān)系及具體作用機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)：郭玉夢、張憲忠進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計；郭玉夢、崔楊霖進(jìn)行研究的實施與可行性分析；郭玉夢、崔楊霖、孔雨晨進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；郭玉夢、孔雨晨進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；郭玉夢負(fù)責(zé)撰寫、修訂論文；高磊、張憲忠負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；張憲忠對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。