大腸桿菌多酚氧化酶的分子克隆及異源高效表達

鄧 卉， 余 丹， 鄒成義， 范景勝， 李 斌， 屈 東， 倪青松， 鄭鈺嘉， 陳 瑾

（四川省畜牧科學研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066）

優質飼料資源高度依賴進口， 使我國飼料產業發展極度受制于國外供應端的穩定性、 安全性和經濟性。2022 年，國家發改委修訂印發的《產業結構調整指導目錄》 中將餅粕等糧油加工副產物綜合利用關鍵技術開發應用列入鼓勵類條目。 菜籽粕、 棉籽粕是我國常見的餅粕類糧油加工副產物，也是最常見的非糧飼料資源，但由于其富含多酚等抗營養因子，在商品飼料中的用量十分有限。目前利用微生物發酵產生的酶蛋白來降解酚類抗營養因子是最安全、最有效的技術手段。

本課題組前期篩選出的一株大腸桿菌SDB2已被證實能通過分泌多酚氧化酶來降解芥子堿等酚類物質，但由于野生菌產酶效率低，純度不高，不能滿足商業化應用。 通過基因工程技術克隆多酚氧化酶基因、 構建重組菌株可以實現多酚氧化酶的高效表達。據報道，目前除了在蘋果、杏、楊樹等植物中克隆出了多酚氧化酶基因 （吳瑜凡等，2008），還有研究者在雙孢蘑菇、白腐菌等真菌中也克隆出了多酚氧化酶基因（Halalouili 等，2006；Wichers 等，2003），但關于細菌多酚氧化酶的克隆研究罕見報道。在基因重組表達體系中，誘導劑和溫度是影響表達效果的兩個重要因素。 本研究將SDB2 多酚氧化酶基因重組表達到大腸桿菌BL21中， 同時研究溫度和IPTG 濃度兩個因素對表達量的影響，確定最佳誘導表達條件，為SDB2 多酚氧化酶在飼料工業上的規模應用奠定基礎， 為實現菜籽粕、 棉籽粕等非糧飼料資源的高效利用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與質粒 本課題組前期篩選保藏的大腸桿菌SDB2，質粒pET28a，大腸桿菌（Escherichia coli）BL21 均購自生工生物工程公司。

1.1.2 試劑與工具酶 Taq DNA 聚合酶、dNTP、PCR 凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購自生工生物工程公司，其他試劑均為國產AR 試劑。

1.1.3 LB 培養基 胰蛋白胨10 g/L、 酵母浸粉5 g/L、氯化鈉10 g/L。

1.2 SDB2 基因組DNA 提取 SDB2 基因組DNA 提取按照FineMag 磁珠法通用型基因組DNA 提取試劑盒的說明書操作， 采用Purifier32全自動核酸提取儀提取，獲得的DNA 樣品用封口膜封存于-20 ℃。

1.3 SDB2 多酚氧化酶基因PCR 擴增 根據SDB2 多酚氧化酶基因設計引物， 開展兩輪PCR反應，一輪反應體系（擴增模板DNA）為：雙蒸水41 μL、 模板DNA 2 μL、DNA 聚合酶1 μL、Buffer10×5 μL、dNTP 1 μL；PCR 反應參數：96 ℃5 min；96 ℃22 s，60 ℃22 s，72 ℃25 s，22 個循環；72 ℃1 min。 二輪反應體系為： 雙蒸水39 μL、首尾引物各1 μL、 一輪模板DNA 2 μL、DNA 聚合酶1 μL、Buffer10×5 μL、dNTP 1 μL；PCR 反應參數：96 ℃5 min；96 ℃22 s，62 ℃22 s，72 ℃25 s，23 個循環；72 ℃1 min。 PCR 產物采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠純化目的條帶。

1.4 重組菌株構建 將純化后的PCR 產物酶切后與表達載體pET28a 連接，轉化至大腸桿菌BL21 感受態細胞，42 ℃熱激后涂布在含有30 μg/mL 卡那霉素的LB 平板培養基上，37 ℃培養12 h。挑選出陽性重組菌株，提取重組菌株質粒進行單、雙酶切驗證。

1.5 克隆基因生物信息學分析 單、雙酶切驗證克隆基因后，委托生工生物工程公司測序，對測序結果采用ExPASy 在線服務器推導出表達氨基酸的序列、相對分子質量、理論等電點，并將重組氨基酸序列提交SWISS-MODEL 蛋白質建模服務器進行同源建模， 預測出SDB2 重組多酚氧化酶晶體三維結構。

1.6 SDB2 多酚氧化酶基因的高效表達

1.6.1 基因工程菌 選擇1.4 中經PCR 鑒定為陽性、 質粒經酶切驗證為SDB2 多酚氧化酶基因的重組基因工程菌株開展多酚氧化酶的高效誘導表達試驗。

1.6.2 試劑 LB 肉湯瓊脂培養基、 卡那霉素、誘導劑IPTG、TMB 顯色試劑盒、Western Blot 一抗、Western Blot 二抗均購自生工生物工程公司；其他試劑均為國產AR 試劑。

1.6.3 SDB2 多酚氧化酶基因高效表達的誘導條件篩選 將重組菌株接種到含有30 μg/mL 卡那霉素的LB 液體培養基中培養， 當OD 值達到0.6時， 設置不同誘導條件誘導多酚氧化酶基因高效表達。 采用“2×2”交叉試驗設計，以溫度和誘導劑IPTG 濃度兩個因素作為重組菌株多酚氧化酶基因表達的影響因素，溫度和IPTG 濃度分別設計2個水平，詳見表1。 未添加誘導劑為陰性對照組。

表1 誘導試驗設計

誘導培養結束后，收集部分培養菌液制樣。將剩余菌液4000 r/min 離心10 min， 收集上清液和部分菌體沉淀制樣。 向剩余菌體沉淀添加Tris-NaCl buffer 懸浮，超聲破碎，離心收集上清和沉淀分別制樣。對前述制樣（未誘導樣品、誘導后菌液、破碎前上清、破碎前沉淀、破碎后原液、破碎后上清、破碎后沉淀）采用SDS-PAGE 和WB 雙重驗證目標酶蛋白，確立最佳誘導條件。

SDS-PAGE 檢測： 對蛋白樣品進行處理制樣后，選用12%分離膠、5%濃縮膠來跑膠檢測出目標蛋白分子質量。 WB 檢測：將SDS-PAGE 分離的蛋白樣品轉移到硝酸纖維素薄膜上，與對應的WB 一抗（兔抗His 標簽）起免疫反應，再與WB 二抗（羊抗兔）起反應，經過放射自顯影檢測出目標酶蛋白。1.6.4 高效表達并純化多酚氧化酶蛋白 依據確立的最佳誘導條件誘導重組菌株大量表達多酚氧化酶蛋白后，采用鎳柱純化親和層析法純化目標酶蛋白， 純化過程中添加內毒素去除緩沖液：50 mmol Tris-300 mmol NaCl，1%tritonX-114，pH 8.0； 平衡緩沖液：50 mmol Tris-300 mmol NaCl ，pH 8.0；清洗緩沖液：50 mmol Tris-300 mmol Na-Cl，pH 8.0 和20/50 mmol imidazole； 洗脫緩沖液：50 mmol Tris-300 mmol NaCl，pH 8.0 和500 mmol imidazole。制樣，采用SDS-PAGE 和WB 雙重驗證經純化的目標酶蛋白。

2 結果與分析

2.1 構建SDB2 多酚氧化酶基因重組菌株 SDB2多酚氧化酶基因經提取、擴增、純化后連接質粒載體pET28a，轉化至大腸桿菌BL21 構建重組菌株，提取重組菌株質粒進行酶切驗證的結果如圖1 所示，得到一條741 bp 和一條5400 bp 的基因條帶，與預期結果相符，說明成功構建出重組菌株。

圖1 重組質粒酶切驗證圖

2.2 克隆基因生物信息學分析 對克隆出的SDB2 重組多酚氧化酶基因進行生物信息學分析，發現該基因含目標核苷酸741 個，總編碼氨基酸263 個（含標簽氨基酸20 個），氨基酸組成的蛋白相對分子質量為28499.0， 理論等電點為6.94。進一步對SDB2 重組多酚氧化酶基因編碼的氨基酸序列開展三維結構預測分析，進入Swiss-Model三維結構預測服務器， 提交該重組基因編碼的氨基酸序列，結果如圖2 所示。 SDB2 重組多酚氧化酶蛋白三維結構模型的建立是以1u05.1.A 為模板， 一致性達97.94%，GMQE 值為0.90，QMEAN值為（0.92±0.05）。

圖2 SDB2 重組多酚氧化酶蛋白的三維預測結構

2.3 確立SDB2 多酚氧化酶基因高效表達的誘導條件

2.3.1 不同誘導條件下多酚氧化酶基因表達的SDS-PAGE 分析 采用SDS-PAGE 對4 種不同誘導條件下的7 種性狀樣品進行驗證， 結果顯示（圖3 ~ 圖6）： 未經IPTG 誘導的樣品（A1、B1、C1、D1）無特異條帶出現，不同誘導條件下的破碎前上清樣品（A3、B3、C3、D3）均無蛋白表達，而4種不同誘導條件下的誘導后菌液、破碎前沉淀、破碎后原液、破碎后上清、破碎后沉淀均在蛋白標準分子質量25 ～35 KD 產生1 條特異的蛋白條帶，與預期蛋白大小（28KD）一致，初步判斷重組菌株成功在胞內表達出多酚氧化酶蛋白。 進一步分析可知，“37 ℃，1 mmol IPTG” 誘導條件下的B2、B4、B5、B6、B7 多酚氧化酶表達量均高于其他3個誘導條件下對應性狀樣品的表達量， 而載體為上清液的可溶性多酚氧化酶蛋白B6 對后續的純化提取工藝要求更簡單、易操作，成本更低，因此選擇樣品B6 的生產方法作為重組菌株高效表達SDB2 多酚氧化酶的誘導條件， 有利于實現規模化應用生產。

圖3 “37 ℃，0.2 mmol IPTG”誘導表達SDS-PAGE 結果

圖4 “37 ℃，1 mmol IPTG ”誘導表達SDS-PAGE 結果

圖5 “15 ℃，0.2 mmol IPTG”誘導表達SDS-PAGE 結果

圖6 “15 ℃，1 mmol IPTG ”誘導表達SDS-PAGE 結果

2.3.2 不同誘導條件下多酚氧化酶基因表達的WB 分析 繼SDS-PAGE 分析后， 再采用WB 對4 種不同誘導條件下的7 種性狀樣品進行二次驗證，結果顯示（圖7 ~ 圖10），未經IPTG 誘導的樣品無特異條帶出現， 不同誘導條件下的破碎前上清樣品均無蛋白表達， 而4 種不同誘導條件下的誘導后菌液、破碎前沉淀、破碎后原液、破碎后上清、 破碎后沉淀均在蛋白標準分子質量25 ～35 KD 產生1 條特異的蛋白條帶， 與預期蛋白大小（28KD）一致，二次驗證充分說明重組菌株成功在胞內表達出多酚氧化酶蛋白。 進一步分析可知，“37 ℃，1 mmol IPTG” 誘導條件下的B2、B4、B5、B6、B7 多酚氧化酶表達量均高于其他3 個誘導條件下對應性狀樣品的表達量， 而載體為上清液的可溶性多酚氧化酶蛋白B6 對后續的純化提取工藝要求更簡單、易操作，成本更低，因此選擇樣品B6 的生產方法作為重組菌株高效表達多酚氧化酶的誘導條件，有利于實現規模化應用生產。由此可見，WB 二次驗證結果與上述SDS-PAGE 分析結果一致，充分證實選擇“37 ℃，1 mmol IPTG”獲得菌體破碎后上清液的生產方法可作為多酚氧化酶高效表達的最佳誘導條件。

圖7 “37 ℃，0.2 mmol IPTG”誘導表達WB 結果

圖8 “37 ℃，1 mmol IPTG ”誘導表達WB 結果

圖9 “15 ℃，0.2 mmol IPTG”誘導表達WB 結果

圖10 “15 ℃，1 mmol IPTG ”誘導表達WB 結果

2.4 高效表達并純化多酚氧化酶蛋白 依據2.3中確立的最佳誘導條件“37 ℃，1 mmol IPTG”誘導SDB2 多酚氧化酶蛋白大量表達后， 對重組菌株破碎后上清液采用鎳柱純化親和層析法純化目標酶蛋白，結果如圖11 所示，樣品S 在SDS-PAGE 和Western 分析圖中均在蛋白標準分子質量25 ～35 KD 產生1 條特異的蛋白條帶，與預期蛋白大小（28 KD）一致，說明重組菌株采用前述誘導和純化工藝，最終成功獲得目標多酚氧化酶蛋白。

圖11 最終純化蛋白SDS-PAGE和Western 分析圖

3 結論與討論

本研究將課題組前期篩選出的大腸桿菌SDB2 的多酚氧化酶基因克隆到表達質粒pET28a，轉化至宿主E.coli BL21 中，成功構建出SDB2 多酚氧化酶基因重組菌株。 以溫度和IPTG濃度作為影響因素設置不同誘導條件誘導多酚氧化酶基因在重組菌株中高效表達，對表達蛋白采用SDS-PAGE 和WB 進行雙重驗證，確立SDB2 多酚氧化酶高效表達的最佳誘導條件為“37 ℃，1 mmol IPTG”，最終在該誘導條件下成功純化出SDB2 多酚氧化酶蛋白。

陳衛等（2002）將嗜熱脂肪芽孢桿菌IAM11001的半乳糖苷酶基因克隆到表達質粒pET-28 （b）并轉化至宿主E.coli BL21 后，采用單因素試驗設計來探尋該重組菌表達半乳糖苷酶基因的最適IPTG 濃度，結果表明IPTG 濃度為0.8 mmol 時，基因的蛋白表達量最大。 張強（2010）研究表明，耐熱淀粉酶重組大腸桿菌BL21-amylase 高效表達酶蛋白的最佳誘導溫度為37 ℃、IPTG 濃度為0.6 mmol。Kamna等（2012） 采用表達質粒pGEX-2T 和宿主E.coli BL21 高效表達木聚糖酶基因的研究結果顯示，1 mmol IPTG 誘導的酶蛋白表達量為1.6%， 遠低于0.01 mmol IPTG 的誘導表達量12.7%， 該試驗條件下的IPTG 添加量在極低濃度下能達到更好的效果。 Cui 等（2011）將嗜冷單胞菌的脂肪酶基因克隆到質粒pColdI 并轉化至宿主E.coli BL21 后， 摸索出脂肪酶基因在重組菌中高效表達的最佳溫度為35 ℃。 本研究以課題組篩選的一株大腸桿菌SDB2的多酚氧化酶基因為研究對象，采用BL21/pET28a作為表達載體， 以溫度和IPTG 濃度兩個因素設計“2×2”交叉試驗，研究該重組基因高效表達酶蛋白的最佳條件， 結果表明該基因在BL21 中實現了胞內分泌酶蛋白，在“37 ℃，1 mmol IPTG”條件下表達出大量可溶性酶蛋白，避免了包涵體酶蛋白的復雜提純工藝，有利于應用生產。

綜上所述， 本研究運用基因工程技術成功將能有效降解芥子堿、 棉酚的SDB2 多酚氧化酶基因克隆、異源高效表達，為多酚氧化酶實現規模化生產打下堅實的基礎， 為提高我國非糧飼料資源利用率、 緩解飼料原料高度依賴進口的現狀提供了技術解決方法。