不同品種馬駒糞便菌群多樣性及豐度的分析研究

馬玉輝， 李婷婷， 樊振聲， 葉斯哈提·提安，奴爾蘭·阿克亞孜， 奴爾旦別克·居尼西別克， 李 海

（1.昭蘇縣西域馬業有限責任公司，新疆昭蘇 835600；2.昭蘇縣畜牧獸醫發展中心，新疆昭蘇 835600；3.新疆農業大學動物科學學院，新疆肉乳用草食動物營養實驗室，新疆烏魯木齊 830052）

動物胃腸道微生物是消化道重要組成部分，與宿主互利共生，維持胃腸道內環境的穩態（朱偉云等，2014）。 幼齡草食家畜胃腸道微生物細菌種類、數量、豐度及多樣性相對于成年家畜較低，但隨著幼齡動物月齡的變化呈增加趨勢，至斷奶細菌的種類和數量達到接近母畜的比例。 微生物細菌感染、定植易受品種、飼養管理和日糧營養水平等影響而產生差異（張瑞陽等，2022；馬露等，2019）。 這種差異影響斷奶期草食動物（牛、羊及馬）對日糧的消化利用，特別是對日糧纖維的降解率。 馬是單胃草食家畜，其盲腸和結腸相當于反芻動物（牛和羊）的瘤胃，進行復雜的微生物發酵過程，對粗飼料具有較強的消化能力。 不同品種的馬駒因飼養管理、日糧組成等差異導致腸道中微生物組成、結構、豐度等不同，對斷奶期日糧改變的適應能力不同。因此，了解和豐富斷奶期馬駒腸道微生物細菌的多樣性、組成和豐度，對通過微生物調控馬駒腸道健康，緩解斷奶應激具有重要的意義。 因此，本研究以3 個品種（哈薩克馬、伊犁馬、純血馬）斷奶期馬駒為研究對象， 通過分析糞便中細菌多樣性和豐度指標，揭示不同品種馬駒斷奶期腸道微生物細菌組成等的差異， 為不同品種馬駒斷奶期豐富腸道微生物、緩解斷奶應激等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點 試驗于2021 年10 月在新疆伊犁昭蘇縣進行。

1.2 試驗動物 選擇15 匹6 月齡斷奶的伊犁馬、 哈薩克馬和純血馬馬駒， 平均體重分別為（145.28±1.69）、（126.75±5.58）kg 和（184.65±9.54）kg，每個品種各5 匹。

1.3 試驗設計 以品種為單位進行分組，分別為伊犁馬斷奶馬駒組、 哈薩克馬斷奶馬駒組和純血馬斷奶馬駒組， 斷奶前一天通過直腸采集馬駒糞便樣品，測定相關指標。

1.4 采樣期前飼養管理 伊犁馬和純血馬馬駒與母馬在同一環境下飼養，試驗馬匹每日09:00、15:00和21:00 飼喂飼草料，母馬自由采食粗飼料（苜蓿和牧草2∶1 混合飼喂），精料補充料3 kg/（d·匹）；馬駒自由覓乳，采食與母馬相同的粗飼料，每天精料補充料0.65 kg/（100 kg·BW）。哈薩克馬馬駒處于放牧條件下，馬駒自由攝取母乳，自由采食牧草和自由飲水。 早晨09:00 飼喂前將馬駒和母馬分開，使用馬駒專用料兜每天補喂精料補充料0.65 kg/（100 kg·BW）。 所有馬匹按照章程，使用伊維菌素（Ivermectin）驅蟲劑進行驅蟲，按照體重0.2 mg/kg的劑量口服。 精料補充料組成及營養水平見表1。

表1 精料補充料組成及營養水平（干物質基礎）%

1.5 樣品采集 在采樣當天， 將馬駒綁定后，用75%的酒精對其肛門周圍進行消毒， 通過直腸采集馬駒糞便，將采集的馬駒糞便收集于收糞瓶中，混合均勻， 液氮速凍， 最終將采集的所有糞便樣品-80 ℃冷凍保存。

1.6 樣品測定 馬駒糞便細菌總DNA 的提取、PCR 擴增、Illumina HiSeq 測序及結果分析均由北京諾禾致源生物信息科技有限公司協助完成。 最終結果以稀釋后的基因組DNA 為模板，使用16S rDNA 的V3 ～V4 區特異引物515F 和806R 進行PCR 擴增。 515F:5′-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA -3′ ；806R:5′ -GCCAATGGACTACHVGGG-TWTCTAAT-3′。

1.7 數據處理 在Excel 中先將數據進行預處理，再使用SPSS 18.0 軟件進行單因素方差分析，采用Duncan 氏法進行各組之間多重比較， 試驗結果均以“平均值±標準差”（Mean±SD）表示。

2 結果

2.1 不同品種馬駒糞便中細菌Alpha 多樣性分析 由表2 可知，observed_species 結果顯示哈薩克馬馬駒糞便中觀測到的物種值指數極顯著高于伊犁馬馬駒和純血馬馬駒， 分別提高了28.72% （P＜ 0.01） 和 54.76% （P＜ 0.01）；goods_coverage 各品種馬駒之間差異不顯著（P＞0.05）； 哈薩克馬馬駒和純血馬馬駒PD_whole_tree 指標極顯著高于伊犁馬馬駒，分別提高了67.04%（P＜0.01） 和53.99%（P＜0.01）； 哈薩克馬馬駒糞便中細菌ACE 和Chao1指數極顯著高于伊犁馬馬駒和純血馬馬駒（P＜0.01）， 分別提高了37.29%、61.36%和84.78%、116.78%；Shannon 和Simpson 指數各品種馬駒之間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同品種馬駒糞便中細菌Alpha 多樣性

2.2 不同品種馬駒糞便中細菌豐度分析

2.2.1 門水平不同品種馬駒糞便中細菌豐度 由表3 結果可知， 各品種馬駒糞便中細菌門水平前10 的物種中，相同的有7 個物種，分別是厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、疣微菌門、放線菌門、軟壁菌門和螺旋體門。 其中伊犁馬和純血馬馬駒糞便厚壁菌門豐度極顯著高于哈薩克馬馬駒， 分別提高63.50%（P＜0.01） 和70.37%（P＜0.01）；擬桿菌門各品種之間差異極顯著，哈薩克馬＞純血馬＞伊犁馬；變形菌門，哈薩克馬馬駒極顯著高于伊犁馬和純血馬馬駒（P＜0.01）；軟壁菌門伊犁馬馬駒極顯著高于哈薩克馬和純血馬（P＜0.01）；疣微菌門、 放線菌門和螺旋體菌門3 個品種之間差異不顯著（P＞0.05）。 此外，伊犁馬馬駒糞便中還檢測出黏膠球形菌門和藍藻菌門； 哈薩克馬馬駒和純血馬馬駒糞便中檢測出纖維桿菌門和廣古菌門，但差異不顯著（P＞0.05）。

表3 門水平不同品種馬駒糞便中細菌豐度

2.2.2 科水平不同品種馬駒糞便中細菌豐度 由表4 可知，科水平馬駒糞便前10 的物種中，相同的菌有瘤胃球菌科、 毛螺旋菌科和克里斯滕森菌科， 純血馬馬駒糞便中瘤胃球菌科豐度比哈薩克馬顯著提高195.61%（P＜0.05）；毛螺旋菌科純血馬顯著高于伊犁馬和哈薩克馬（P＜0.05），分別提高63.81%和100.90%；克里斯滕森菌科伊犁馬極顯著高于哈薩克馬和純血馬（P＜0.01）。 伊犁馬和哈薩克馬糞便中檢測到乳桿菌科， 但差異不顯著（P＞0.05）；伊犁馬和純血馬糞便中檢測到莫拉菌科，但差異不顯著（P＞0.05）；鏈球菌科和理研菌科在哈薩克馬和純血馬糞便中檢測到， 但是差異不顯著（P＞0.05）。 此外，伊犁馬馬駒糞便中檢測到肉桿菌科、Family_XIII、葡萄球菌科和丹毒絲菌科；哈薩克馬駒糞便中檢測到甲烷粒菌科、普氏菌科、螺旋體科和阿克曼氏菌科；純血馬馬駒糞便中檢測到unidentified_Clostridiales、芽孢桿菌科和明串珠菌科。

表4 科水平不同品種馬駒糞便中細菌豐度

2.2.3 屬水平不同品種馬駒糞便中細菌豐度 由表5 可知，屬水平前10 的物種中3 個品種相同的細菌有鏈球菌屬，其中哈薩克馬和純血馬馬駒糞便中的豐度顯著高于伊犁馬（P＜0.05），分別提高了200.48%和811.53%。 伊犁馬和純血馬馬駒糞便中相同的菌屬是不動桿菌屬，伊犁馬和哈薩克馬相同的菌屬是乳酸菌屬，哈薩克馬和純血馬相同的菌屬是甲烷粒菌屬和梭菌屬。 此外，伊犁馬馬駒糞便中還檢測到德庫菌屬、奇枝菌屬、Christensenellaceae_R-7_group、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Eotgalicoccus、Mogibacterium 和肉食桿菌屬；哈薩克馬駒檢測到阿克曼氏菌屬、腸桿菌屬、琥珀酸弧菌屬、擬桿菌屬、纖維桿菌屬和Spirochaetaceae；純血馬馬駒檢測到Spirochaetaceae、嗜冷芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、節細菌屬、Saccharofermentans和毛螺旋菌屬。

表5 屬水平不同品種馬駒糞便中細菌豐度

3 討論

腸道菌群是一個復雜的多微生物生態系統，對維持和促進人和動物的健康具有極其重要的作用（謝強等，2017）。馬駒腸道菌群隨月齡和日糧組成的改變而發生變化。 馬駒從4 月齡開始至6 月齡逐漸進入斷奶期， 日糧從母乳—母乳+固體飼料—全固體飼料進行轉化（宗學陽等，2022）。2 月齡左右的馬駒已經開始跟隨母馬嘗試采食固體飼料，因此，在斷奶前大部分馬駒已經能夠適應固體日糧。日糧組成、結構類型等的改變是影響馬駒胃腸道菌群變化的主要原因之一 （Sakaitani 等，1999）。因此，馬駒在斷奶前腸道菌群結構組成、多樣性等與母馬已經有一定的相似性。 Kuhl 等（2011）報道，馬駒出生后4 周齡時腸道菌群結構與母馬的高度相似。 Earing 等（2012）通過凝膠電泳技術測定發現，出生后42 d 的馬駒糞便細菌的條帶與母馬相似性很高。 也有研究顯示， 出生后30 d 的馬駒糞便微生物沒有顯著變化，而出生后60 d 糞便菌群結構相對穩定，到9 月齡大時與母馬糞便菌群結構仍有一定的差異（Costa 等，2016；Faubladier 等，2014）。 基于研究間的差異，無法得出關于微生物區系穩定的時間點和斷奶效果的結論。然而，腸道菌群組成的主要變化似乎發生在出生后的前幾個月，即斷奶之前。 因此，研究斷奶期馬駒腸道菌群多樣性、結構、組成及豐度對深入研究斷奶后馬駒腸道微生物區系的變化、 日糧消化利用以及馬駒健康等具有重要的意義。

Costa 等（2016）研究結果顯示，馬駒（夸特馬）出生至270 d 糞便菌群多樣性呈不同的變化特點。出生第1 天馬駒糞便中OTUs 為1893.25，Simpson為106.67；馬駒出生后第121~180 天的斷奶期OTUs 為1716.19，Simpson 為90.39，物種值和多樣性指數呈降低趨勢。這可能與新生馬駒胃腸道細菌單一、數量少，出生后隨著與母馬、母乳及周圍環境的接觸， 迅速感染大量微生物， 導致馬駒OTUs 和Simpson 增加有關。 隨著馬駒月齡的增加，馬駒逐漸適應周圍養殖環境和飼糧，通過腸道的適應以及微生物調節代謝， 逐漸形成相對穩定的微生態環境， 使腸道菌群變化相對較穩定， 因此，OTUs 和Simpson 有所降低。 Lindenberg 等（2019）研究結果顯示， 馬駒（純血馬） 出生到斷奶后， 通過測定Chao1、 觀察物種和Shannon 指數確定的Alpha 多樣性穩步增加。 隨著時間的推移，Alpha 多樣性在所有指標上都有穩定的增加。最明顯的是在出生后第20~50 天。 在斷奶前和斷奶后采集的樣本之間沒有顯著差異。因此，馬駒出生至斷奶期間，糞便菌群多樣性的變化因月齡、品種、飼養管理及日糧等產生差異。 本研究結果顯示，在斷奶期哈薩克馬駒糞便中有顯著的Alpha 多樣性， 特別observed_species、PD_whole_tree、ACE 和Chao1 極顯著高于其他兩個品種。一方面這種差異可能與馬駒品種有關，另一方面可能與3 種馬駒采樣前飼養管理和日糧組成有關。 Harlow 等（2016）研究發現，日糧中淀粉的來源不同導致馬匹腸道菌群存在差異。本研究中，伊犁馬和純血馬馬駒是舍飼飼養，日糧由苜蓿干草、牧草干草和精料補充料組成；哈薩克馬駒放牧條件下補喂精料補充料，這種飼糧結構的差異可能是導致馬駒腸道細菌Alpha 多樣性呈現顯著性差異的根本原因。

Costa 等（2016）研究結果表明，隨著馬駒月齡的增加， 組成馬駒糞便菌群前10 的物種豐度發生顯著性的變化。 因此，月齡的變化可能是導致馬駒腸道菌群豐度改變的根本原因。馬駒月齡變化除了馬駒體重、體尺、消化能力、免疫機能等變化外，更多的可能是馬駒飼養管環境和日糧的改變（飼料種類、采食量、消化率等），從而導致不同月齡段菌群的差異。 在馬駒出生后121~180 d，糞便中門水平前10 的菌種均有厚壁菌門、 變形菌門、unclassified、疣微菌門、擬桿菌門、放線菌門、螺旋體門、纖維桿菌門、Acidobacteria 和Chlamydiae （Costa 等，2016）。厚壁菌門是馬駒此階段主要的菌種。纖維桿菌門和螺旋體門極顯著高于其他月齡段馬駒。本研究中門水平前10 的菌種與Costa 等（2016）研究結果相似，但是3 個品種之間存在較大的差異。 3 個品種相同菌中，厚壁菌門是伊犁馬和純血馬馬駒糞便中主要優勢菌，雖然哈薩克馬排在第一的優勢菌也是厚壁菌門， 但是豐度極顯著低于其他兩個品種。 而擬桿菌門在哈薩克馬糞便中的豐度達到了29.39%，極顯著高于其他兩個品種。 這種差異主要受3 個品種日糧組成和飼養環境的影響較大。研究顯示（Quercia 等，2019；Jost 等，2013；Yu 等，2011；Fraga 等，2008；Crowell-Davis 等，1985）， 馬駒出生早期腸道微生物可能受母馬產道和母乳的影響較大，隨著日糧攝入的增加，日糧的組成可能是改變馬駒胃腸道微生物種類和豐度變化的關鍵因素。本研究中3 個品種在科和屬水平前10 的菌種相同的細菌種類很少，科水平有3 種，屬水平僅有1 種，這種差異更加說明了品種之間差異的原因。 此外，3個品種的馬駒飼養在同一地區不同的養殖環境，這也說明養殖環境可能是導致這種差異的另一原因（Lindenberg 等，2019）。 腸道菌群的穩定時間不僅與潛在的日糧干預有關，馬駒的健康狀況在一定程度上也會影響腸道菌群發生變化（Lindenberg 等，2019；Fouhy 等，2012）。 例如，哺乳期馬駒熱腹瀉與腸道微生物的變化有關，這表明馬駒腹瀉可能容易受到飲食干預的影響， 影響其腸道微生物菌群（Lindenberg 等，2019；Fouhy 等，2012）。 此外，馬駒通常要接受抗生素治療和驅蟲等，用藥過程也是影響馬駒腸道菌群變化原因（Fouhy 等，2012）。 本研究中，3 個品種馬駒糞便菌群在門、 科和屬水平上存在較大的差異，是品種、日糧、飼養管理及健康狀況等眾多因素共同作用的結果，要進一步說明品種之間差異根本原因， 可能要通過研究消除多因素，在單一因素條件下進行深入研究來進行解答。

4 結論

在本研究條件下，3 個品種馬駒中哈薩克馬糞便細菌多樣性顯著性最高； 厚壁菌門、 擬桿菌門、變形菌門、疣微菌門、放線菌門等是3 個品種門水平相同的優勢菌； 在科水平和屬水平3 個品種馬駒細菌組成和豐度差異較大， 具體原因需要進一步深入研究。