南酸棗葉原花青素的提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

張 強(qiáng)， 渠淑潔， 戴 航

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院公共衛(wèi)生管理學(xué)院，廣西南寧 530299）

南酸棗又名廣棗，在我國主要分布在江西、廣西、廣東、湖南、湖北、浙江、福建和貴州等地（堯云萍等，2021），目前也有人工育種種植（黃文輝等，2022）。 南酸棗的果實和樹皮都可以入藥（黃雨佳等，2021）， 南酸棗果實中含有營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)（Zeng 等，2019），如蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸、維生素、有機(jī)酸和酚類物質(zhì)等，樹皮和樹葉中含有黃酮類化合物及苷類（周劍等，2017）。南酸棗果核具有醒酒、殺蟲作用，可以與一些植物合用，制成蚊香；樹皮具有抑菌、止血作用，樹葉具有明目作用，在醫(yī)學(xué)、食品等領(lǐng)域有很大的應(yīng)用前景。 聶韡等（2022）發(fā)現(xiàn)，南酸棗果皮提取物的有較好的抗過敏功效。

原花青素含有酚羥基，具有抗癌、抗腫瘤、降血糖和預(yù)防心血管疾病等活性（楊博，2011），可用于治療白內(nèi)障、 干眼癥和視網(wǎng)膜類疾病（李春陽等，2004）。 原花青素具有抗氧化能力、 自由基清除能力和抗衰老能力，且其毒副作用低，生物利用度高，可以用于化妝品和保健品的制作中（胥鑫萌等，2021）。 蔣彤等（2021）通過HPLC-MS 鑒定了南酸棗果皮含16 個原花青素成分。 南酸棗收貨后，葉子掉落后會當(dāng)做肥料或者自然處理后遺棄，造成了大量資源浪費。南酸棗自然資源豐富，從南酸棗葉子中提取原花青素， 可為天然來源的抗氧化劑開發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 南酸棗葉來源于南寧植物園。試驗所用試劑種類及來源見表1。

表1 試驗用試劑

1.2 儀器 試驗用儀器設(shè)備及來源見表2。

表2 試驗用儀器設(shè)備

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品準(zhǔn)備 將清洗干凈的南酸棗葉，于110 ℃烘干24 h 至恒重，用粉碎機(jī)粉碎，過20 目篩，得南酸棗葉干粉備用。南酸棗葉原花青素提取步驟如下： 稱取南酸棗葉粉末一定量于磨口錐形瓶中，按一定液固比加入丙酮，置于預(yù)定溫度的超聲波振蕩器中提取，提取結(jié)束后將提取溶液2000 r/min 離心20 min，取上清液，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，得到原花青素粗提物，貼好標(biāo)簽，備用。

1.3.2 紫外光譜 以甲醇為參比溶液， 把濃度為0.12 mg/mL 的南酸棗葉原花青素提取物進(jìn)行紫外掃描，確定其最大吸收波長。

1.3.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 取一定量兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇溶劑溶解后， 將其配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液母液。配制濃度為0.04 ～0.20 mg/mL （間隔0.02 mg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液各5.0 mL。 配制0.04 g/mL 香草醛-甲醇溶液。 取香草醛-甲醇溶液5.0 mL，各系列濃度標(biāo)液3.0 mL， 鹽酸1.0 mL， 混合于10 mL容量瓶，甲醇定容到10 mL，置于暗處反應(yīng)1 h。于500 nm 測定吸光值，記錄數(shù)值，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 樣品含量的測定 取一定量的南酸棗葉原花青素粗提物放置于燒杯中，溶解后定容（甲醇溶液）， 參照1.3.3 的試驗方法測定南酸棗葉原花青素得率。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出待測液中的原花青素含量， 然后求出1.0 g 南酸棗葉樣品中原花青素物質(zhì)的含量（以兒茶素計，mg/g）。

1.3.5 單因素試驗 原花青素的提取中， 丙酮-水提法提取率最高（余修亮等，2018），可能是由于花青素中的酚羥基容易與丙酮的C=O 形成締合作用（李春陽等，2004）。因此本試驗采用丙酮作為提取溶劑。

1.3.5.1 時間對南酸棗葉原花青素得率的影響取1.0 g 南酸棗葉樣品粉末于錐形瓶中， 按液固比1:20 加入丙酮（70%）20 mL，于40 ℃分別提取4、6、8 min 和10 min。 結(jié)束后將提取液離心后旋蒸，得南酸棗葉原花青素粗品，備用，依據(jù)1.3.4 步驟計算原花青素得率。

1.3.5.2 料液比對南酸棗葉原花青素得率的影響取1.0 g 南酸棗葉樣品粉末于錐形瓶中， 按液固比1:15、1:20、1：25 和1:30 加入丙酮（70%），于40 ℃超聲提取8 min。 結(jié)束后將提取液離心后旋蒸，得南酸棗葉原花青素粗品，備用，依據(jù)1.3.4 步驟計算原花青素得率。

1.3.5.3 溫度對南酸棗葉原花青素得率的影響取1.0 g 南酸棗葉樣品粉末于錐形瓶中， 按液固比1:20 加入丙酮（70%）20 mL，分別在30、35、40、45、50 ℃超聲提取8 min。結(jié)束后將提取液離心后旋蒸，得南酸棗葉原花青素粗品，備用，依據(jù)1.3.4步驟計算原花青素得率。

1.3.5.4 丙酮濃度對南酸棗葉原花青素得率的影響 稱取1.0 g 南酸棗葉粉末于磨口錐形瓶中，設(shè)定超聲溫度為45 ℃， 按料液比1:20 加入體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%和90%的丙酮進(jìn)行試驗，超聲提取8 min。 結(jié)束后對提取液離心，濃縮后得南酸棗葉原花青素粗提取物， 備用， 依據(jù)1.3.4 方法進(jìn)行定量分析。

1.3.6 正交試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇超聲時間、料液比、超聲溫度、丙酮濃度4 個因素，以南酸棗葉原花青素的得率作為考察指標(biāo)，設(shè)計正交試驗。 因素水平見表3。

表3 正交試驗因素水平

1.3.7 南酸棗葉原花青素的抗氧化活性

1.3.7.1 南酸棗葉原花青素對超氧自由基清除能力 將4.5 mL Tris-HCl 溶液30 ℃保溫15 min，之后加入1 mL 梯度濃度的南酸棗葉原花青素溶液和0.4 mL 25 mmol/L 的鄰苯三酚溶液，上下振蕩搖勻，之后在30 ℃保溫5 min，加入1 mL 濃度為8 mol/L 的氯化氫終止反應(yīng)，然后在325 nm 處測定吸光度（A1），空白以蒸餾水代替樣品液，測定吸光度（A0）。 Vc 作為陽性對照進(jìn)行試驗，并按照下列公式計算樣品對超氧陰離子自由基的清除率：

取不同濃度的南酸棗葉原花青素提取物0.1 g，稱取壞血酸0.1 g，蒸餾水溶解，定容25 mL，此溶液為母液。 分別從原花青素和壞血酸母液中移取不同體積的溶液，用10 mL 容量瓶進(jìn)行定容，配成一系列濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、4 mg/mL的樣品液，備用。分別配制三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀溶液。 移取鐵氰化鉀2 mL、磷酸緩沖溶液3 mL 和不同濃度樣品液2 mL，定容至25 mL，混合均勻，在50 ℃水浴加熱30 min，稍冷，依次加入2.5 mL 三氯乙酸和2 mL 三氯化鐵，定容。在700 nm處進(jìn)行測定，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.7.2 南酸棗葉原花青素清除DPPH 自由基的研究 參考王晴晴等（2017）的方法測定南酸棗葉原花青素對DPPH 的清除效果，以空白樣對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。 分別取梯度濃度的南酸棗葉原花青素溶液2.0 mL 溶液于試管中，之后用移液器加濃度為0.04 mg/mL 的DPPH 2 mL， 于暗處放置300 min后在517 nm 測定吸光度（A1）； 以無水乙醇代替DPPH，按照上述方法測定吸光度（A2）；空白組按上述方法測定吸光度（A0），Vc 作為陽性對照進(jìn)行試驗， 并按照下列公式計算樣品對DPPH 自由基的清除率：

1.3.7.3 南酸棗葉原花青素清除羥基自由基的研究 稱取0.1 g 南酸棗葉原花青素提取物和0.1 g壞血酸，用蒸餾水溶解，定容25 mL，此溶液為母液。 配制濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、4 mg/mL的南酸棗葉提取液。 移取2 mL 的水楊酸乙醇溶液（6 mmol/L），2 mL 的硫酸亞鐵溶液（6 mmol/L）和2 mL 的不同濃度的樣品溶液， 最后移取2 mL的雙氧水溶液（6 mmol/L），定容到25 mL，水浴30 min（37 ℃），于526 nm 下測定，吸光度值記為A1， 以純水代替樣品時溶液的吸光度值記為A2，不加雙氧水時的溶液作為空白。

1.4 數(shù)據(jù)處理 所有結(jié)果均表示為 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”（±SD），并采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.1.1 全波長掃描 由圖1 可知， 最大吸收波長λmax為500 nm。

圖1 全波長掃描圖

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 南酸棗葉原花青素所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示， 橫軸表示的是溶液的濃度（mg/mL），縱軸表示的是溶液吸光度A，線性方程式為：y=1.77317x-0.00845，R2=0.9973， 由其線性方程式可知，在濃度為0.06 ～0.2 mg/mL，原花青素線性關(guān)系良好。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 時間對南酸棗葉原花青素得率的影響 從圖3 可知，在4 ~ 8 min 內(nèi)，南酸棗葉原花青素得率與時間呈正相關(guān)關(guān)系， 在8 min 時提取率達(dá)到最大，繼續(xù)延長時間，南酸棗葉原花青素的提取率有所下降。 可能是因為超聲時間過長破壞南酸棗葉原花青素部分結(jié)構(gòu)。因此，將正交優(yōu)化范圍確定為6 ~ 10 min。

圖3 時間對南酸棗葉原花青素得率的影響

2.2.2 料液比對南酸棗葉原花青素得率的影響如圖4 所示，隨著液料比的增加，南酸棗葉原花青素的提取率呈上升趨勢，而液料比為1：20 時；南酸棗葉原花青素的得率最大；后面繼續(xù)增大樣品的液料比，南酸棗葉原花青素的得率呈下降趨勢。 可能是后面有其他雜質(zhì)溶出，與南酸棗葉原花青素的溶出形成競爭關(guān)系，使得原花青素的得率降低。因此，將料液比正交優(yōu)化范圍確定為1/15~1/25。

圖4 料液比對南酸棗葉原花青素得率的影響

2.2.3 溫度對南酸棗葉原花青素得率的影響 如圖5 所示，在30 ～45 ℃，南酸棗葉原花青素得率隨溫度升高而增加；在溫度超過45 ℃，南酸棗葉原花青素得率呈下降趨勢，可能由于溫度較高時，原花青素有分解情況發(fā)生， 且丙酮揮發(fā)變強(qiáng)。 因此，將溫度的正交優(yōu)化范圍確定為40 ~ 50 ℃。

圖5 溫度對南酸棗葉原花青素得率的影響

2.2.4 丙酮濃度對南酸棗葉原花青素得率的影響如圖6 所示，在丙酮體積分?jǐn)?shù)為0.5 ～0.7，南酸棗葉原花青素得率隨體積分?jǐn)?shù)升高而增加； 在丙酮體積分?jǐn)?shù)為0.7 時， 南酸棗葉原花青素得率達(dá)12.35 mg/g，之后有所下降，可能由于丙酮濃度高時，其他成分溶出也增加，使得原花青素溶出相對變少。因此，將丙酮體積分?jǐn)?shù)的正交優(yōu)化范圍確定為0.6 ~ 0.8。

圖6 溫度對南酸棗葉原花青素得率的影響

2.2.5 南酸棗葉原花青素正交試驗 依照正交設(shè)計原理和單因素試驗結(jié)果，選取超聲時間（A）、料液比（B）、溫度（C）和丙酮體積分?jǐn)?shù)（D）四個因素，采用四因素三水平L9（34）正交試驗對南酸棗葉多酚的提取進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表4。

表4 正交試驗優(yōu)化結(jié)果

由表4 分析可得，超聲時間、料液比、溫度和丙酮體積分?jǐn)?shù)對超聲波輔助提取南酸棗葉原花青素的順序次第為溫度（C）＞丙酮體積分?jǐn)?shù)（D）＞料液比（B）＞超聲時間（A），丙酮超聲輔助提取的最佳工藝條件為A2B3C2D2，即超聲時間8 min、料液比1：25、溫度45 ℃、丙酮體積分?jǐn)?shù)0.7。在該條件下進(jìn)行三次平行試驗， 南酸棗葉多酚得率為16.59、16.71 mg/g 和16.86 mg/g，平均得率為16.85 mg/g，試驗結(jié)果具有較高的穩(wěn)定性和可靠性。

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 南酸棗葉原花青素的超氧自由基清除能力由圖7 可知， 南酸棗葉清除超氧自由基的能力隨濃度增加呈增大趨勢，在0.1 ～0.5 mg/mL 濃度下，清除能力快速上升， 之后趨于平緩， 在濃度為2 mg/mL 時對超氧自由基清除率可達(dá)75%。 在相同濃度條件下， 南酸棗葉原花青素對超氧自由基的清除能力弱于VC。

圖7 南酸棗葉原花青素對超氧自由基的清除能力

2.3.2 南酸棗葉原花青素對DPPH 清除能力 由圖8 可知，在0.5 ～1.5 mg/mL 內(nèi)，南酸棗葉原花青素對DPPH 的清除能力隨濃度增加而增強(qiáng)。 在1.5 ～3.0 mg/mL， 南酸棗葉原花青素對DPPH 的清除能力趨于穩(wěn)定。 結(jié)果表明南酸棗葉原花青素對DPPH 有清除作用，但弱于VC。 南酸棗葉原花青素對DPPH 自由基的IC50為0.83 mg/mL。

圖8 南酸棗葉原花青素清除DPPH 自由基能力

2.3.3 南酸棗葉原花青素對羥基自由基清除能力由圖9 可知，在濃度0.5 ～2.0 mg/mL 內(nèi)，南酸棗葉原花青素對OH 的清除能力隨濃度增加較快，在2.0 ~ 3.0 mg/mL 增加緩慢而趨于穩(wěn)定。 表明南酸棗葉原花青素對OH 有一定的清除作用， 但弱于VC，其對OH 自由基的IC50為1.5 mg/mL。

圖9 南酸棗葉原花青素清除羥基自由基能力

3 結(jié)論

試驗通過超聲輔助法提取南酸棗葉原花青素，考察了提取時間、料液比、溫度和丙酮濃度對得率的影響， 結(jié)合正交試驗設(shè)計對提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。 結(jié)果顯示： 南酸棗葉原花青素超聲輔助法最佳條件為超聲時間8 min、料液比1∶25、溫度45 ℃、丙酮體積分?jǐn)?shù)0.7。 該條件下，原花青素得率可達(dá)16.85 mg/g。 抗氧化試驗測試表明，南酸棗葉原花青素對超氧自由基、OH 和DPPH 自由基有一定的清除能力， 其中對DPPH 和OH 自由基IC50分別為0.83 mg/mL 和1.50 mg/mL。 說明南酸棗葉原花青素有較好的抗氧化活性。