超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定漁用非藥品類投入品中喹乙醇、氯霉素類、硝基呋喃類藥物殘留

時(shí)文博， 韓現(xiàn)芹， 王愿寧， 陳永平， 吳玉凡， 錢 坤

（天津市農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心，天津 300221）

漁用投入品是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用的重要生產(chǎn)資料，在池塘消殺與水質(zhì)調(diào)節(jié)、水產(chǎn)苗種繁育、成體養(yǎng)殖、捕撈以及運(yùn)輸?shù)雀鱾€(gè)環(huán)節(jié)中均有使用，漁用投入品主要包括漁藥、 漁用飼料和其他一些用以調(diào)節(jié)水質(zhì)、 促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)為目的非藥品類投入品（任源遠(yuǎn)等，2020；張海榮等，2010；江為民等，2008）， 其產(chǎn)品品質(zhì)是否合格和安全直接與水產(chǎn)品質(zhì)量安全掛鉤，進(jìn)而影響食品安全，是水產(chǎn)品質(zhì)量安全防控中需要重點(diǎn)關(guān)注的環(huán)節(jié)。

目前，針對(duì)漁藥、漁用飼料等方面的檢測(cè)技術(shù)以及監(jiān)管體系較為完善， 而針對(duì)非藥品類投入品的質(zhì)量安全監(jiān)管還存在一定的盲區(qū) （明文慶等，2020；孫曉杰等，2016）。部分投入品打著能預(yù)防和改善各種養(yǎng)殖水產(chǎn)品疾病、調(diào)節(jié)和改善養(yǎng)殖水質(zhì)、促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物健康生長(zhǎng)等名義， 繞開監(jiān)管審批違規(guī)上市銷售， 而其中存在著違規(guī)添加各種禁限用藥物的風(fēng)險(xiǎn)， 對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量安全產(chǎn)生嚴(yán)重威脅， 其通過各種形式進(jìn)入水體和土壤也易造成農(nóng)業(yè)環(huán)境面源污染 （邱稀木等，2021； 封永輝等，2019；陳昌福等，2018），因此開展包括非藥品類投入品在內(nèi)的各種漁用投入品的監(jiān)管顯得十分重要。 開展各種禁限用藥物的檢測(cè)是進(jìn)行監(jiān)管的前提條件，喹乙醇、氯霉素類、硝基呋喃類藥物都是投入品中違規(guī)添加風(fēng)險(xiǎn)較大的禁限用藥物， 目前動(dòng)物源和飼料產(chǎn)品中相關(guān)藥物的檢測(cè)常用的方法主要有液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等（孫棟等，2022；劉雪紅等，2019），其中超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有檢測(cè)靈敏、基質(zhì)影響小、定性準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，適合漁用投入品這種成分復(fù)雜、高雜質(zhì)樣品中藥物殘留的檢測(cè)（張微等，2022； 吳劍平等，2017）。 目前水產(chǎn)品、飼料中這3 類藥物的檢測(cè)技術(shù)研究較多， 針對(duì)其他非藥品類投入品中相關(guān)藥物的檢測(cè)技術(shù)研究較少， 無法有效對(duì)所有類型的漁用投入品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和監(jiān)管。 同時(shí)這3 類藥物的檢測(cè)需分開進(jìn)行，比較耗費(fèi)時(shí)間，因此有必要對(duì)漁用非藥品類投入品中3 類禁限用藥物殘留同時(shí)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行研究。

本文旨在建立超液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)提取測(cè)定不同類型漁用非藥品類投入品中喹乙醇、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因共3 類8 種禁限用藥物的檢測(cè)方法，為快速、準(zhǔn)確的完成漁用投入品中相關(guān)禁限用藥物的監(jiān)測(cè)工作提供幫助， 對(duì)保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)綠色發(fā)展發(fā)揮積極的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 實(shí)驗(yàn)材料為購(gòu)買自天津市主要水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域銷售的各類漁用促生長(zhǎng)劑、 微生態(tài)制劑、水質(zhì)改良劑等非藥品類投入品，樣品狀態(tài)為固態(tài)、液態(tài)、懸濁液態(tài)，其中固態(tài)樣品進(jìn)行均質(zhì)粉碎后過篩，懸濁液和液態(tài)樣品進(jìn)行混勻。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；甲酸、乙酸銨、二甲基亞砜（色譜純，科密歐試劑）；氯化鈉（優(yōu)級(jí)純，科密歐試劑） 。喹乙醇、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因及氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度＞98%，德國(guó)DR.E 公司）。 各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量后使用2.0 mL 二甲基亞砜溶解后再使用乙腈定容至10.0 mL， 配制成濃度1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，避光于-18 ℃進(jìn)行保存。

1.2 儀器與設(shè)備 LC30A 超高效液相色譜（日本島津公司）；AB Sciex Qtrap 5500 三重四級(jí)桿質(zhì)譜（美國(guó)Sciex 公司）；3-18K 離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）；SECURA 124-1CN 電子天平 （0.1 mg， 德國(guó)SECURA 公司）；Oasis PRiME HLB 固相萃取柱（德國(guó)Waters 公司）。

1.3 樣品的前處理 準(zhǔn)確稱取待測(cè)樣品1.00 g（±0.01 g）放置于50 mL 離心管中，向其中加入質(zhì)量為10.0 ng 的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液后靜置30 min 后開始提取，先向樣品中加入2.0 g 氯化鈉后混勻，加入10.0 mL 乙腈提取劑，漩渦提取2 min 后在40 ℃下進(jìn)行10 min 的水浴超聲提取，取出離心管后于10000 r/min 下進(jìn)行5 min 的離心， 離心后將全部上清液吸入25 mL 離心管中， 再向樣品中加入10.0 mL 乙腈進(jìn)行1 次提取， 將兩次提取的上清液合并靜置。

吸取4.0 mL 上清液直接移入PRiME HLB 小柱進(jìn)行凈化， 收集全部流出液， 等待流盡后使用3.0 mL 乙腈對(duì)小柱進(jìn)行淋洗，注意控制小柱滴速不超過1.0 mL/min。使用氮吹儀于40 ℃將收集到的全部流出液吹至近干， 使用10%乙腈水溶液1.0 mL 進(jìn)行定容，渦旋混勻后使用0.22 μm 微濾膜過濾至棕色進(jìn)樣小瓶中進(jìn)行儀器分析， 藥物提取過程中注意避光操作。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 使用水（A）和乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行二元溶劑梯度洗脫， 流速：0.3 mL/min；色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；色譜柱溫度：40 ℃；最高壓力：45 Mpa，洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

1.4.2 質(zhì)譜條件 使用正負(fù)離子切換模式進(jìn)行MRM 掃描，離子源：電噴霧離子源（ESI+/ESI-）；離子源溫度：500 ℃；噴霧電壓（IS）：5000 V，-4500 V；氣簾氣（CUR）壓力：30 psi；霧化氣（GS 1）壓力：50 psi；輔助氣（GS2）壓力：50 psi；碰撞氣（CAD）：Medium，各化合物質(zhì)譜條件見表2。

表2 監(jiān)測(cè)的8 種化合物及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜參數(shù)的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇 有部分研究表明， 乙酸銨加入流動(dòng)相對(duì)離子色譜峰有一定的改善作用（薛良辰等，2013），本文對(duì)水相中含5 mmol/L 乙酸銨時(shí)各離子色譜峰的峰形及響應(yīng)值進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)乙酸銨對(duì)色譜峰改善并不明顯， 并且會(huì)使部分離子（呋喃西林、呋喃妥因）的靈敏度降低。同時(shí)本文對(duì)流動(dòng)相中添加甲酸和氨水進(jìn)行了考察， 結(jié)果顯示， 流動(dòng)相中加入甲酸能增加正離子模式的信號(hào)強(qiáng)度，但會(huì)使負(fù)離子的信號(hào)強(qiáng)度下降。氨水加入流動(dòng)相水相后負(fù)離子模式下的信號(hào)強(qiáng)度得到了增強(qiáng)，但是正離子模式下信號(hào)強(qiáng)度有明顯的衰減。因本研究采用正負(fù)離子切換模式同時(shí)對(duì)正負(fù)離子進(jìn)行掃描，為同時(shí)保證正負(fù)離子的靈敏度，水相不添加甲酸、氨水以及乙酸銨，使用純水作為水相。 本文對(duì)分別使用甲醇和乙腈作為有機(jī)相時(shí)的離子色譜圖進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)使用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，圖譜基線較低，峰形較好，峰寬較窄，而甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，基線相對(duì)較高，部分峰形不佳，因此本文的有機(jī)相選擇使用乙腈。

2.1.2 色譜柱的選擇 在喹乙醇、氯霉素類、硝基呋喃類藥物殘留的檢測(cè)中使用色譜柱多為C18柱（邢麗紅等，2017；Lin 等，2001），本文對(duì)比了4 款色譜柱的分離效果，分別為：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm ，1.7 μm）、Shim-pack XR-ODS C8 （2.0 mm×75 mm，2.2 μm）、Kinetex Polar C18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）、Thermo Hypersil GOLD C18（2.1 mm×100 mm ，5 μm）。測(cè)試結(jié)果顯示，8 種藥物在使用Hypersil GOLD 色譜柱時(shí)不能全部做到有效分離，部分化合物峰形不佳，在其余3 款色譜柱上分離度較好， 而使用BEH C18色譜柱時(shí)各藥物的離子色譜峰保留時(shí)間、分離度、峰型最為理想， 因此選擇使用BEH C18作為分離色譜柱，圖1 為8 種化合物定量離子色譜圖。

圖1 8 種化合物定量離子色譜圖

2.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化 使用質(zhì)譜流動(dòng)注射泵將濃度為100 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入到離子源中，流速為10.0 μL/min。 使用一級(jí)質(zhì)譜掃描標(biāo)準(zhǔn)溶液， 分別確定8 種化合物及氘代氯霉素的電離方式和目標(biāo)離子的質(zhì)荷比（m/z）。使用目標(biāo)離子作為母離子進(jìn)行子離子掃描， 從離子碎片中選擇信號(hào)強(qiáng)度最高和次高的兩個(gè)碎片離子作為定量離子碎片和定性離子碎片， 分別與母離子組成定量離子對(duì)和定性離子對(duì)。 使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）優(yōu)化需要監(jiān)測(cè)離子對(duì)的錐孔電壓（DP）和碰撞能量（CE），優(yōu)化后的參數(shù)見表2。本文使用正負(fù)離子切換模式進(jìn)行掃描， 在保證靈敏度和穩(wěn)定性的前提下，在一個(gè)進(jìn)樣周期（7.0 min）完成所有正負(fù)離子掃描，提高了檢測(cè)效率。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化研究

2.3.1 提取試劑的選擇 目前動(dòng)物源和飼料中的8 種藥物主要使用提取劑為甲醇、 乙腈、 乙酸乙酯、 水等單一提取劑或多試劑混合液 （宋軍等，2021；江永遠(yuǎn)等，2019；吳劍平等，2017；劉正才等，2011；徐英江等，2010）。本文對(duì)比5 種不同提取劑的提取率，分別為：甲醇乙腈水（3：3：4）、50%乙腈、乙腈、乙酸乙酯、乙腈乙酸乙酯（1∶1），選取空白促生長(zhǎng)劑添加濃度為20.0 μg/kg 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定（n=3），提取回收率見圖2。

圖2 不同提取劑提取8 種藥物的回收率

結(jié)果顯示，甲醇乙腈水（3：3：4）、50%乙腈對(duì)氯霉素類、硝基呋喃類藥物提取率較低，同時(shí)提取溶液雜質(zhì)較多較為渾濁，后續(xù)凈化較為困難，易造成儀器的污染。 乙酸乙酯對(duì)喹乙醇、呋喃它酮、呋喃西林提取率偏低，使用乙腈、乙腈乙酸乙酯（1∶1）提取時(shí)8 種藥物回收率較高，其中乙腈提取時(shí)回收率最高（＞80%）且穩(wěn)定性最好，同時(shí)乙腈具有沉淀蛋白的能力，提取液中雜質(zhì)較少，后續(xù)凈化后可減小對(duì)儀器的污染風(fēng)險(xiǎn)， 最終確定使用乙腈作為提取劑。

2.3.2 凈化方法的優(yōu)化 漁用非藥品類投入品種類繁多、成分比較復(fù)雜，使用乙腈提取后提取液中常有不同類型的蛋白、脂類、鹽類和色素等雜質(zhì)，若只使用微濾膜進(jìn)行過濾很難對(duì)各種雜質(zhì)做到完全的去除， 雜質(zhì)進(jìn)入質(zhì)譜會(huì)導(dǎo)致四級(jí)桿污染損壞儀器。 同時(shí)提取液中的各種雜質(zhì)可能產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，影響目標(biāo)物的電離，從而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確度，因此需要采取措施對(duì)提取液進(jìn)行凈化處理以去除雜質(zhì)。

在飼料等其他投入品的藥物檢測(cè)中， 一般使用固相萃取柱來對(duì)提取液進(jìn)行凈化 （嚴(yán)明等，2021；Andrade-Eiroa 等，2016；Faraji 等，2019）。本文對(duì)比了6 種固相萃取柱對(duì)加標(biāo)基質(zhì)提取液的凈化效果，包括CNW Florisil SPE Cartridge（6 mL，1 g）、Waters OASIS HLB （6 mL，200 mg）、Supelco Envi-C18（3 mL，500 mg）、Strata-X 33 μm Poly meric SPE （3 mL，60 mg）、BESEP COLUMN HR-X（3 mL，60 mg）、Waters Oasis PRiME HLB （6 mL，200 mg），其中Supelco Envi-C18為C18小柱，其余為HLB 小柱。

測(cè)試結(jié)果顯示，C18小柱對(duì)喹乙醇、呋喃西林、呋喃妥因保留不佳，3 種藥物的回收率低于30%，F(xiàn)lorisil SPE、HR-X 小柱對(duì)喹乙醇的回收率低于60%，OASIS HLB、Strata-X 和Oasis PRiME HLB小柱對(duì)所有化合物的回收率能達(dá)到70%以上，其中Oasis PRiME HLB 效果最佳，8 種化合物的回收率均超過80%，分析可能是有機(jī)相提取劑可以采用直接通過Oasis PRiME HLB 小柱的方式進(jìn)行凈化， 避免了其他固相萃取柱在保留和洗脫環(huán)節(jié)造成的目標(biāo)物損失， 同時(shí)該小柱可不經(jīng)活化直接使用，也減少了凈化前有機(jī)相轉(zhuǎn)水相的環(huán)節(jié)，節(jié)約了大量的檢測(cè)時(shí)間， 因此本文選擇使用Oasis PRiME HLB 進(jìn)行凈化操作。

2.4 基質(zhì)效應(yīng) 本文通過測(cè)定目標(biāo)化合物在定容液中的平均響應(yīng)值（X，n=3）和在空白樣品提取液中的平均響應(yīng)值（Y，n=3）的比值，計(jì)算8 種藥物的基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect），計(jì)算公式為：%ME=Y/X×100%。 使用定容液與按1.3 前處理方式的2 種基質(zhì)（促生長(zhǎng)劑、環(huán)境改良劑）提取液分別配制濃度為5.0 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，2 種基質(zhì)對(duì)8 種化合物的基質(zhì)效應(yīng)值%ME 均在（100±20）%以內(nèi)，其中促生長(zhǎng)劑的基質(zhì)效應(yīng)為83.8% ～107.1%，環(huán)境改良劑的基質(zhì)效應(yīng)為84.6% ～97.3%， 本研究使用了基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量， 進(jìn)一步避免了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量準(zhǔn)確性的影響。

2.5 方法的驗(yàn)證

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 使用空白基質(zhì)提取液配制8 種藥物的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度， 測(cè)定后繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線， 各標(biāo)準(zhǔn)系列中內(nèi)標(biāo)濃度為2.0 ng/mL。觀察目標(biāo)化合物離子峰信號(hào)強(qiáng)度與基線噪音信號(hào)強(qiáng)度的比值（信噪比），當(dāng)信噪比為3（S/N=3）時(shí)化合物的質(zhì)量濃度為方法檢測(cè)限（LOD），信噪比等于10 時(shí)的化合物質(zhì)量濃度為方法定量限（LOQ），8 種藥物的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 各化合物的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限

結(jié)果表明，在選定的色譜及質(zhì)譜條件下，喹乙醇和硝基呋喃類標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.5 ～20.0 ng/mL，氯霉素類的線性范圍為0.2 ～20.0 ng/mL，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9987 ～0.9996，8 種藥物的方法檢測(cè)限為1.0 ～2.5 μg/kg， 定量限為2.5 ～5.0 μg/kg。

2.5.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度 分別稱取2 種空白投入品樣品：促生長(zhǎng)劑（固態(tài)）、環(huán)境改良劑（液態(tài)）各1.0 g 進(jìn)行3 個(gè)濃度的基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，分別為5.0、20.0、50.0 μg/kg， 每個(gè)濃度均設(shè)置6 個(gè)平行樣品，測(cè)定的平均回收率（n=6）及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）如表4 所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在3 個(gè)濃度的基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中， 促生長(zhǎng)劑中8 種藥物的平均回收率為75.5% ～102.1%，RSD 為2.8% ～10.2%，環(huán)境改良劑中8 種藥物的平均回收率為77.8% ～102.2%，RSD 為3.1% ～9.8%，方法的準(zhǔn)確度和精密度較好。

表4 空白基質(zhì)加標(biāo)的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n=6）

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定 利用優(yōu)化后的方法對(duì)漁用非藥品類投入品實(shí)際樣品中8 種藥物殘留進(jìn)行了測(cè)定應(yīng)用和分析，對(duì)所采集的79 個(gè)樣品進(jìn)行了檢測(cè)。 結(jié)果表明，共6 個(gè)樣品檢出氟苯尼考，檢出率為7.6%， 檢出樣品種類為1 個(gè)促生長(zhǎng)劑、4 個(gè)微生態(tài)制劑和1 個(gè)水質(zhì)改良劑， 檢出濃度為2.90 ～18.2 μg/kg，其余7 種藥物均未檢出。

3 結(jié)論

本文使用乙腈提取， 提取液經(jīng)固相萃取柱凈化，正負(fù)離子切換掃描，建立了同時(shí)提取測(cè)定漁用非藥品類投入品中喹乙醇、氯霉素類、硝基呋喃類共3 類8 種藥物的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)方法。 本方法步驟耗時(shí)較少，可同時(shí)提取測(cè)定8種藥物， 檢測(cè)效率較高， 同時(shí)準(zhǔn)確度與精密度良好，可作為漁用非藥品類投入品中喹乙醇、氯霉素類、硝基呋喃類藥物的檢測(cè)方法，為快速、準(zhǔn)確的完成漁用投入品中相關(guān)禁限用藥物的監(jiān)測(cè)工作提供幫助。