油莎豆快速繁殖體系構建研究

王曉龍， 鐘 鵬 ， 楊 曌， 柴 華， 李莎莎， 徐艷霞， 吳 玥， 高海娟，王宏偉 ， 王建麗， 李 偉， 王若丁， 孫 蕊， 李 莉， 張 楊

（1.黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江齊齊哈爾 161005；2.通遼市農牧科學研究所，內蒙古通遼 028000；3.黑龍江省農業科學院草業研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

油莎豆（Cyperus esculentus）又名油莎草，是莎草科多年生草本植物， 原產于非洲地中海地區， 自20 世紀50 年代由北京植物園從蘇聯將油莎豆種質資源首次引入我國， 在我國常作一年生作物栽培（李佳婷等，2019）。 油莎豆塊莖富含油脂，是適宜沙地生長的草類，喜溫暖濕潤氣候環境，其適應性強，具有抗旱、耐澇、耐貧瘠且耐鹽堿等特性，其地上莖葉營養豐富，含粗脂肪（7.6% ～9.1%）、糖（10.6%）、粗蛋白質（9.8%）和粗纖維（19.3%）等（Bai 等，2021；陳星，2013），其是集糧、油、飼為一體，具有較高綜合利用價值的作物，是家畜和家禽十分喜愛的飼料（李變變等，2023；RazolaDíaz 等，2022）。 油莎豆以塊莖繁殖，近幾年來，隨著我國種植業結構的調整，油莎豆從2017 年（2.4×103hm2）至2019 年（13.3×103hm2）種植面積迅猛增加，其在新疆、內蒙古、吉林、河南、黑龍江等地區均有栽培（楊向東和李子勇，2022）。

我國油莎豆種質資源遺傳多樣性較低，現存優良品種十分匱乏， 加之油莎豆種植在我國氣候環境下一般不開花或開花不結實， 因此采用常規雜交育種方法培育優良新品種比較困難（馬紫薇等，2022；陽振樂，2017），大多只能以塊莖繁殖，而長期用其繁殖，易出現品種退化、品質降低、帶菌嚴重等問題。 植物組織培養技術手段是加快植物繁殖及獲得無菌植株的行之有效方法， 可實現優良品種的種質創新及種苗規模化生產， 該項技術目前已在農作物如馬鈴薯（Solanum tuberosum）、 甘薯 （Dioscorea esculenta）、蒜（Allium sativum）等生產上得到廣泛應用（楊尋，2021； 馮光惠等，2015； 王鵬等，2015；趙彥杰，2006）。 但關于油莎豆莖尖組織培養及快速繁殖技術的研究卻較少且不成熟， 限制了油莎豆種植推廣和種質資源創新。 因此，本研究選取油莎豆莖尖作為外植體，MS 作為基礎培養基， 通過以添加不同比例的生長調節劑來進行莖尖分化誘導及生根誘導， 進而構建油莎豆種質快速繁殖體系， 為寒區高效繁育油莎豆優異種苗及種質資源創制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗材料為黑油莎2 號油莎豆，種子由黑龍江省農業科學院提供。化學試劑6-芐基腺膘呤（6-BA）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）由福晨（天津）化學試劑有限公司提供。 MS 和1/2MS 培養基，由青島高科技工業園海博生物技術有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 最佳莖尖消毒方法選擇 油莎豆種子消毒后，放入恒溫水浴鍋中35 ℃浸泡24 h，之后置于27 ℃環境溫度下催芽。 待頂芽長至1 ～2 cm 時，用解剖刀切下頂芽，設置不同的消毒處理（75%酒精30 s+0.1%升汞消毒時間分別設定為A1=3 min、A2 =4 min、A3 =5 min、A4 =10 min、A5 =15 min），每個處理30 株，3 次重復，消毒后用無菌水沖洗6 次，置于無菌紙上吸干頂芽表面水分，將頂芽置于雙目解剖鏡下，用解剖刀切取莖尖（1 ～2 mm）分生組織，接種于頂芽誘導培養基（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+30.0 g/L 蔗糖+7.0 g/L瓊脂，pH 5.8），培養室溫度為25 ℃，光照14 h/d，黑暗10 h/d， 光強150 μmol/m2·s，20 d 后統計污染數量、死亡數量和存活數量，并計算污染率、成苗率。

污染率/%=（污染外植體數量/外植體總個數）×100；

存活率/%=（存活外植體數量/外植體總個數）×100。

1.2.2 莖尖分化培養基篩選 將消毒后的莖尖，放置于雙目解剖鏡下，用解剖刀切取莖尖（1 ～2 mm）分生組織，接種于不同激素配比的培養基上（表1），每個處理接種50 個莖尖，3 次重復，培養室溫度為25 ℃，光照14 h/d，黑暗10 h/d，光強為150 μmol/m2·s，20 d 后統計污染數、死亡數、成苗數，計算成苗率：

表1 莖尖分化培養基

成苗率/%=（成苗外植體個數/外植體總個數）×100。

1.2.3 快速繁殖與生根培養基篩選 將分化的莖尖，接種于不同激素配比的快速繁殖培養基上，處理為MS+6-BA（0.8、1.0、1.2 mg/L），每個處理接種30 株，3 次重復。

將快速繁殖培養基中小苗（2 ～3 cm）接種于生根培養基上，1/2MS 培養基中添加不同濃度激素（IBA、IAA 和NAA，表2），每個處理接種30 苗，3 次重復，20 d 后統計生根數及根系形態，計算生根率：

表2 無菌苗生根培養基

生根率/%=（生根外植體個數/外植體總個數）×100。

1.3 數據統計 采用Excel（2010）處理數據，用Sigma Plot（12.5）作圖，采用SAS（9.0）軟件對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 黑油莎2 號莖尖消毒 由圖1 可知，黑油莎2 號莖尖污染率為15.56% ～44.44%； 死亡率為12.22% ～53.33%；存活率為31.11% ～67.78%。隨消毒時間的增加， 黑油莎2 號莖尖污染率呈現降低的趨勢，死亡率呈現升高趨勢，而存活率則呈現先升后降的變化。 0.1%升汞消毒3 min 時即A1，黑油莎2 號莖尖污染率顯著高于其他消毒處理（P＜0.05）；A2（消毒4 min）時，黑油莎2 號莖尖存活率顯著高于其他消毒處理（P＜0.05），且呈現峰值，分別是A1（3 min）、A3（5 min）、A4（10 min）、A5 （15 min） 處理的1.65、1.38、1.90、2.17 倍；A5（消毒15 min）時，黑油莎2 號莖尖死亡率顯著高于其他消毒處理（P＜0.05）。 此結果表明，75%酒精30 s+0.1%升汞消毒4 min 時黑油莎2 號莖尖消毒效果最好。

圖1 消毒方法與效果比較

2.2 黑油莎2 號莖尖分化培養 由圖2 可見，在不同激素處理中黑油莎2 號莖尖污染率為8.67% ～31.33%； 死亡率為28.67% ～65.33%； 成苗率為18.00% ～62.67%。其中B2 處理時，黑油莎2 號莖尖分化成苗率呈現最高值， 顯著高于其他處理（P＜0.05）， 其次是B3 和C2， 分別為34.67%、34.33%，A1 和A2 較低。 在B2、D1、D2 處理時，黑油莎2 號莖尖污染率量較低， 分別為8.67%、10.00%、11.33%，顯著低于其他處理（P＜0.05）。以上結果表明， 在MS 培養基中加入0.9 mg/L 6-BA 和0.3 mg/L NAA 時， 黑油莎2 號莖尖誘導分化成苗效果最優。

圖2 不同激素對黑油莎2 號莖尖分化的影響

2.3 黑油莎2 號快速繁殖培養 由圖3 可知，6-BA 為1.0 mg/L 即A2 時，黑油莎2 號無菌苗死亡率為6.67%，顯著低于A2 和A3 處理（P＜0.05），此時A2 黑油莎2 號無菌苗分化率呈現最高值，為94.33%， 與A1 和A3 處理相比增加12.11%和16.55%， 且A2 黑油莎2 號無菌苗分化率顯著高于A1 和A3 處理（P＜0.05）。 以上結果表明，MS培養基中加入1.0 mg/L 6-BA 可顯著提高黑油莎2 號無菌苗的繁殖速率。

圖3 不同6-BA 濃度對黑油莎2 號無菌苗快繁的影響

2.4 黑油莎2 號生根培養 由表3 可見，在1/2MS培養基上添加不同濃度的IBA、NAA 和IAA 時生根率差異較大，A2 時， 黑油莎2 號無菌苗生根數量（29.00）最高，顯著高于其他處理（P＜0.05），生根率為96.67%，且根系粗壯，根長為0.9 ～3.0 cm，而IAA 培養基中， 黑油莎2 號無菌苗生根率為62.22% ～ 83.33% ，NAA 生根率為42.22% ～62.22%，明顯低于IBA 和IAA 處理。該結果表明，黑油莎2 號最佳生根培養基為1/2MS 培養基添加0.2 mg/L IBA，此培養基不僅生根率高，而且根系粗壯、不易褐化。

表3 不同激素對黑油莎2 號生根的影響

3 討論

植物組織培養是選取植物某個部位（組織、細胞、器官）為外植體，在人工可控的無菌環境下，利用富含植株生長發育所需養分的培養基中培養，在激素調控下使其發育成完整植株（張慧君和陳勁楓，2015）。其中莖尖培養也稱分生組織培養，由于莖尖頂端分生組織攜帶病毒較少， 所以應用莖尖脫毒培養技術是行之有效的方法。研究表明，通過營養塊莖、 球莖等繁殖的植物如馬鈴薯、 山藥（Rhizoma dioscorea）、半夏（Pinellia ternata）、荸薺（Eleocharis dulcis）等，傳統繁殖方式不僅擴繁速度慢，消耗種莖多，而且長期塊莖無性繁殖易積累病毒， 因而利用組織培養進行離體快繁是當前應用最廣泛的一種快速繁育種苗及優化種質的技術（陳芝華等，2018；靳松等，2017；馮光惠等，2015；陳利萍，2009）。其中，外植體消毒是本試驗中的最關鍵步驟， 消毒效果不佳， 將直接導致培養基污染， 并對試驗結果的統計造成影響。 培養基污染主要有人為因素和外植體引發， 而外植體本身攜帶大量的細菌和真菌， 只能通過尋找合適的消毒試劑、 適宜的藥劑濃度及嚴格的消毒時間來降低污染。 油莎豆塊莖長于地下，其表面布滿細菌，甚至部分細菌已進入到塊莖內部， 因此選擇適宜的消毒方法將其徹底消毒尤為關鍵。本研究中，75%酒精結合0.1%升汞消毒4 min 時，黑油莎2 號莖尖存活率最高， 隨消毒時間延長或縮短均影響消毒效果，這與黃思（2015）的研究結果趨于一致，但與吳瓊（2007）用0.2%升汞消毒的結果卻不盡相同，這可能是品種不同或消毒部位不同所引起的，究其原因， 可能是由于0.1%升汞中的汞離子（Hg+） 進入細菌細胞后主要與酶或蛋白質上的巰基（-SH）結合而使之失活或變性，因此0.1%升汞更適宜油莎豆莖尖消毒。 同時消毒時長也會影響外植體消毒效果， 消毒時間過長造成外植體不可逆損傷，時間過短則外植體消毒不徹底，所以掌控好消毒時間也是外植體消毒的關鍵（黃思，2015）。

植物生長和發育過程是源于分生組織不斷進行分裂、分化而成。 植株在早期階段胚形成以后，其頂端生長點隨著種胚的萌發生長， 起初形成莖尖分生組織，之后又逐漸分化成初生分生組織，最后形成地上部分如莖和葉（陸維超等，2016；韓德元，1997）。而在莖尖的分化過程中，植物莖尖分生組織的形態特征、 理化特性以及內源激素含量都會發生變化（張慧君和陳勁楓，2015）。 因此，外源植物激素的種類、 水平及組合對植物組織的分化和增殖顯得十分重要。 細胞分裂素是植物組織培養過程中促進組織分化和生長的物質， 不同細胞分裂素種類及濃度對組培苗的分化增殖效果不同（陸維超等，2016）。 本研究中， 隨6-芐基腺膘呤（6-BA）濃度增加，黑油莎2 號莖尖分化成苗率表現為先升后降的變化， 試驗確定了黑油莎2 號莖尖分化最佳濃度為6-BA 0.9 mg/L，此時誘導產生的莖尖分化速度最快， 分化成苗率最高， 植株健壯，這與黃思（2015）的研究結果基本一致，說明細胞分裂素正向調控莖尖分生組織的細胞分化，并能控制分生組織的大小和分化速度。 而6-BA 濃度（0.9 mg/L）一定時，黑油莎2 號莖尖分化的最佳萘乙酸（NAA）濃度為0.3 mg/L，當NAA 濃度高于或低于該濃度，成苗率呈現明顯降低，而陳利萍（2009）卻指出，NAA 0.1 mg/L 是較為理想的誘導培養基激素配比，本研究結果與其有所不同，這可能與材料本身的遺傳特性及取材大小有關， 由此說明適宜生長素濃度能加快莖尖細胞分裂活動，對莖尖分生組織的分化起到促進作用， 而生長素濃度高于特定閥值（最適濃度）時，則對莖尖分化具有抑制作用（陸維超等，2016）。 本研究中，MS+1.0 mg/L 6-BA 可明顯提高黑油莎2 號無菌苗繁殖速率，這與黃思（2015）的研究結果相一致，而瞿萍梅等（2007）則認為，MS+0.5 mg/L 6-BA 培養基的繼代增殖效果更好， 這可能與供試品種的遺傳特性及基因型不同有關（李佳婷等，2019）。 此外，從生根培養的誘導方面可以推測出， 不用植物或同一植物不同品種間的差異導致莖尖分化苗的生根難易程度不同。 韓曉勇等（2013）研究指出，1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.02%活性炭培養基為鐵棍山藥生根培養最適培養基， 平均生根天數為12 d，生根率100%，根系最長為1.04 cm；張振霞等（2016）研究發現，1/2MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 吲哚丁酸（IBA）培養基為廣山藥的最佳生根培養基配方，主根性狀明顯，出現較多的不定根和毛狀根。 目前對于油莎豆的組織培養研究報道很少，本研究中，黑油莎2 號莖尖分化苗在1/2MS 培養基上生根，1/2MS+0.2 mg/L IBA 為快速生根培養基配方， 該培養基黑油莎2 號再生苗生根率為96.67%，這與瞿萍梅等（2007）的研究結果相一致，說明盡管品種不同，但最適宜生根培養基激素配比基本相同， 可見油莎豆芽誘導生根對激素種類具有一定的依賴性。 油莎豆快速繁殖體系構建不僅縮短了莖尖分化誘導時間， 而且提高了無菌苗生根率， 為油莎豆優質種苗高效繁育奠定基礎。

4 結論

本試驗結果表明：（1）黑油莎2 號最佳莖尖消毒方法為75%酒精30 s+0.1%升汞4 min。 （2）最優莖尖分化培養基成分為MS+0.9 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。 （3） 最佳快速繁殖培養基配方為MS+1.0 mg/L 6-BA。 （4）最佳生根培養基配方為1/2MS+0.2 mg/L IBA。