氨基化-多壁碳納米管QuEChERS-液相色譜-串聯質譜法測定熱帶水果中110 種農藥及其代謝物殘留量

潘永波, 張妙宜, 萬 娜, 王 彬*,, 潘燦平

(1.海南省檢驗檢測研究院食品檢驗檢測中心 國家市場監管重點實驗室(熱帶果蔬質量與安全)，海口 570314；2.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海口 571101；3.中國農業大學 理學院，北京 100193)

熱帶水果在種植過程中由于所處環境溫度高、濕度大，易受病蟲危害，生產中常采用化學農藥進行防治[1-2]，而其頻繁或不合理使用可能導致農藥殘留問題突出，威脅消費者健康和生態環境[3-4]。在進行農藥殘留檢測時，由于荔枝、龍眼、香蕉中富含糖類物質，利用傳統QuEChERS前處理方法處理時易產生糖析現象[5]，造成部分農藥損失；此外果實中富含的色素，可以增強大部分農藥的基質效應[6]，從而影響檢測的準確度。有文獻報道了采用氣液微萃取技術[7]、微波輔助鹽析萃取技術[8]和改進的QuEChERS 方法[9]檢測高糖、含有色素的水果、蜂蜜等基質中的多農藥殘留，但對高糖、含有色素的新鮮熱帶水果檢測多農藥殘留報道較少。

Anastassiades 等[10]在2003 年首次提出采用QuEChERS 前處理技術用于果蔬中多農藥殘留的檢測，近些年，學者在食品中農藥殘留、獸藥殘留、真菌毒素和環境污染物等方面也展開了相關研究[11-13]，豐富了QuEChERS 方法應用范圍。研究發現，使用傳統的凈化填料難以滿足復雜的食品基質[14]，對凈化材料的性能提出了更高要求，因此，新型高效的凈化材料已成為QuEChERS 方法發展的一個重要方向。

近些年，多壁碳納米管 (multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs) 被學者們廣泛關注[15-16]。MWCNTs 是由碳原子組成的平面六邊形經卷曲形成的一種多孔石墨圓筒狀并具有納米尺度的碳材料，具有比表面積大、吸附能力強、穩定耐用等特點[17]。與石墨化碳黑 (graphitized carbon black，GCB) 相比，MWCNTs 對色素、酚類、甾醇類等物質的吸附能力更強[17]，但對平面結構的農藥吸附能力較低。通過對MWCNTs 的官能團進行修飾，可使其具有更好的凈化能力。如彭曉俊等[18-19]對MWCNTs 進行氧化修飾，使其帶有羥基和羧基，用其對陳皮及其制品進行凈化，能有效去除樣品中的雜質，基質效應降低；應用氨基化-多壁碳納米管 (NH2-MWCNTs) 對牛奶[20]和菊花[21]進行凈化時發現， NH2-MWCNTs 能吸附基質中的大部分雜質，從而減少基質對農藥多殘留檢測的影響。

本研究在QuEChERS 方法基礎上，參照現行國家標準方法[22]，比較分析了NH2-MWCNTs 及GCB 的凈化效果，通過優化NH2-MWCNTs 含量，建立了基于NH2-MWCNTs 改進的QuEChERS凈化法，結合液相色譜-串聯質譜 (LC-MS/MS) 測定荔枝、龍眼和香蕉中110 種農藥及其代謝物殘留的檢測方法，旨在為熱帶水果中農藥多殘留的日常監測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Waters ACQUITY UPLC/Xevo TQ-S 液相色譜-串聯質譜聯用儀，美國Waters 公司；ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱，美國Waters 公司；XS204萬分之一天平，瑞士 Mettler Toledo 公司；XW-80A 旋渦混合器，上海精科實業有限公司；IKA?KS 4000 ic 恒溫搖床，德國IKA 公司；Centrifuge 5804R 冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；Milli-Q超純水機，美國Millipore 公司。

乙腈、甲醇(色譜純)，德國MERCK 公司；甲酸、乙酸(色譜純)，美國ACS 恩科化學；乙酸銨(色譜純)，美國Thermo Fisher 公司；EN.15662萃取緩沖體系QuEChERS 鹽包(含4 g MgSO4、1 g氯化鈉、0.5 g 檸檬酸氫二鈉和1 g 檸檬酸鈉)，美國Agilent 公司；多壁碳納米管(NH2-MWCNTs，粒徑10～20 nm，顆粒長度5～15 μm)，北京科德諾思技術有限公司；石墨化碳黑(GCB)，天津博納艾杰爾科技有限公司；N-丙基乙二胺(PSA，粒徑40～60 μm，平均孔徑6 nm，天津博納艾杰爾科技有限公司；荔枝、龍眼和香蕉，購自海南省海口市、澄邁縣、東方市、昌江市等地的農貿市場及超市。

110 種農藥標準品 (純度≥95.0%)，分別購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司、美國CATO 公司和中國計量科學研究院。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 準確稱取10 mg (精確至0.1 mg) 各農藥標準品，根據標準品的溶解性分別選擇乙腈或甲醇為溶劑，配制成1000 mg/L 的標準品儲備液，于 -18 ℃及以下保存；根據需要，移取適量標準品儲備液用乙腈稀釋，配制成所需濃度的標準工作液，于4 ℃保存，備用。

1.2.2 樣品前處理 樣品制備：按照GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》[23]方法，取供試水果待測部位，用組織搗碎機勻漿后，放入聚乙烯瓶中，于 -18 ℃及以下保存。

提取：稱取10 g (精確至0.01g) 均質樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 乙腈，渦旋混勻1 min后，加入EN.15662 萃取緩沖體系QuEChERS鹽包，振搖1 min，以8000 r/min 離心5 min。

凈化：移取6 mL 上清液，加入到含有900 mg MgSO4、150 mg PSA 及15 mg MWCNTs 的15 mL離心管中，渦旋1 min 后，以8000 r/min 離心5 min；取上清液過0.22 μm 有機濾膜，待測。

1.2.3 檢測條件 色譜條件：采用 ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱 (1.8 μm，2.1 mm × 100 mm)分離；流動相A 相為0.01%甲酸水溶液 (含2 mmol/L乙酸銨)，B 相為甲醇；流速0.4 mL/min； 柱溫40 ℃； 進樣量1 μL；梯度洗脫程序：0～0.5 min，98% A；＞0.5～3.5 min，2.0% A；＞3.5～4.5 min，2.0% A；＞4.5～4.6 min，98% A；＞4.6～6.0 min，95% A。

質譜條件：電噴霧離子源 (ESI 離子化模式)，正離子和負離子同時掃描；多反應監測模式(MRM)；碰撞氣為氬氣 (Ar)；毛細管電壓1.00 kV(ESI+)、2.5 kV (ESI-)；離子源溫度120 ℃；錐孔氣流量150 L/h；脫溶劑氣溫度400 ℃；脫溶劑氣流量800 L/h。其他質譜條件詳見表1。

表1 110 種農藥質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters of 110 pesticides

1.3 數據處理

數據采用Waters MassLynx 工作軟件建立方法、數據采集及定量處理，導出原始數據后采用WPS Office 進行數據整理、分析和表格、柱狀圖繪制。前處理和分析條件優化中的回收率均采用3 個平行樣品取平均值計算，精密度選擇低、中、高3 個濃度，每個濃度梯度連續采集6 次數據的峰面積進行相對標準偏差 (RSD) 的計算。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

為了實現110 種化合物有較好的色譜行為，實驗首先考察了乙腈-水、甲醇-水在HSS T3 色譜柱上相同洗脫梯度條件下各化合物的響應和分離度。結果發現，在只有純水和有機相下，大多數農藥響應較差，甚至沒有出峰，因此在水相中添加一定濃度的甲酸或乙酸銨，觀察各化合物的響應及出峰時間的變化。實驗發現，在水相中加入一定濃度的甲酸，有機磷類等農藥的響應值顯著增加，說明甲酸可以增強該類農藥的電離；當加入乙酸銨時，有機氯及擬除蟲菊酯類等農藥有較好的峰形和響應值，這是因為該類農藥離子化時，銨鹽促進了[M + NH4]+峰的形成，容易在流動相中分散和傳遞[24-25]。進一步考察了在水相中分別添加體積分數為0.01%、0.05%、0.1%和0.2%的甲酸及濃度單位為1、2、5 和10 mmol/L 乙酸銨，觀察對各化合物的影響。結果表明，當甲酸濃度增加時，甲胺磷基線噪音增大，影響峰形；當乙酸銨濃度增加到5 mmol/L 時，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、多殺菌素等峰形變寬，出峰時間延遲。為了使各化合物有更好的分析，水相選擇加入0.01%甲酸和2 mmol/L 乙酸銨。由于甲醇為質子溶劑，與親核基形成氫鍵，對分離酸堿或電負性強的化合物有較強的選擇性[26]，因此有機相選擇甲醇。最終選擇2 mmol/L 乙酸銨的水相 (含有0.01%甲酸) 與甲醇為流動相。

2.2 前處理條件優化

2.2.1 提取溶劑優化 參照GB 23200.121—2021《食品安全國家標準 植物源性食品中331 種農藥及其代謝物殘留量的測定》，分別選擇乙腈及含有體積分數為1%乙酸的乙腈作為提取溶劑，在荔枝空白基質中添加供試目標農藥標準品，添加水平為0.02 mg/kg。結果發現，兩種提取溶劑對應各目標農藥的回收率分別為51.7% 和56.7%，說明仍有大量的農藥未被提取出來，可能是因為荔枝中含有大量的糖類物質，導致出現糖析現象，降低了農藥的提取效率。

稱取10 g 荔枝空白基質，比較了不同提取溶劑用量 (10、15、20、25 mL) 對各目標農藥提取回收率的影響 (圖1)。結果表明，隨著提取劑體積增加，目標農藥回收率不斷提升，當提取劑含量達到20 mL 時，各目標農藥回收率超過60%。考慮提取體積過大，會造成試劑浪費及降低目標農藥的靈敏度，選擇在10 g 樣品中添加20 mL乙腈。

圖1 不同提取體積對回收率的影響Fig.1 Influence of different extraction volume on recovery rate

2.2.2 凈化劑優化 在荔枝空白基質中添加0.02 mg/kg 的目標農藥，加入20 mL 乙腈提取，加入EN.15662 萃取緩沖體系QuEChERS 鹽包分層后，取2 mL 上清液，分別添加各2.5 mg/mL GCB 和NH2-MWCNTs 填料，考察對樣品凈化效果及農藥回收率的影響。結果 (圖2) 發現：GCB對噻菌靈、氯吡脲、滅幼脲和噻苯隆等農藥的吸附性較強，農藥回收率低于60%，而MWCNTs對各目標農藥的回收率均大于60%，因此選擇NH2-MWCNTs 為凈化劑填料。

圖2 不同凈化劑對4 種農藥回收率的影響Fig.2 Influence of different purification materials on recovery rate of 4 pesticides

進一步對NH2-MWCNTs 的用量進行了優化，將2 mL 提取液分別加入含有2、4、5、8 和10 mg NH2-MWCNTs 的凈化管中，以回收率考察其凈化效果。結果發現，所有目標農藥的平均回收率均大于87%，且隨著NH2-MWCNTs 用量的增加，樣品中色澤亮度增大，但噻菌靈、噻苯隆、氯吡脲和滅幼脲等農藥的平均回收率也隨之降低 (圖2)。因此確定NH2-MWCNTs 用量為2.5 mg/mL (2 mL 提取液中含5 mg NH2-MWCNTs)。

2.3 方法學評價

2.3.1 線性范圍及定量限 分別向荔枝、龍眼和香蕉空白基質溶液中添加一定量的標準溶液，配制成質量濃度分別為0.002、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.10 和0.20 mg/L 的基質標準工作溶液，以目標化合物質量濃度為橫坐標，各化合物的定量離子對的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。方法定量限 (LOQ) 的評價以最低添加濃度且可準確定量為依據。結果表明，各農藥在0.002～0.2 mg/L 范圍內線性關系良好，決定系數 (R2) 均大于0.9902，LOQ 在0.005 ～ 0.05 mg/kg 之間。

2.3.2 正確度與精密度 分別向荔枝、龍眼和香蕉空白基質溶液中添加LOQ、2LOQ 和10LOQ 3 個水平的標準混合溶液，各農藥的回收率在61%～120%，相對標準偏差0.30%～15% (表2)。表明該方法可用于荔枝、龍眼和香蕉中多農藥殘留的篩查和檢測。

表2 110 種農藥定量限、決定系數、添加平均回收率和相對標準偏差( n = 6)Table 2 Limit of quantification(LOQ), determination coefficients, the average recoveries and relative standard deviations(RSD) of 110 pesticides ( n = 6)

2.3.3 基質效應 帶有羧基、氨基、酰胺基、羥基等基團的農藥易發生基質增強或抑制效應[27]，通常通過空白樣品基質中標準曲線的斜率A 與溶劑中標準曲線的斜率B 評價基質效應 (ME)[28]，即：ME/% = (A-B)/B × 100。當ME ＜ 0，為基質抑制效應；ME ＞ 0，為基質增強效應；|ME| ＜ 20%，為弱基質效應；20% ≤ |ME| ≤ 50%，為中等基質效應；|ME| ＞ 50%，為強基質效應。

按照本實驗建立的方法與GB 23200.121—2021《食品安全國家標準 植物源性食品中331 種農藥及其代謝物殘留量的測定》方法建立基質標準曲線，分別考察了荔枝、龍眼和香蕉3 種基質的基質效應。結果表明，荔枝、龍眼和香蕉中弱基質效應農藥比例分別為50.9%、40%和61.8%，較GB 23200.121—2021 方法的弱基質效應農藥比例分別增加28.2%、20.0%和16.4%；而強基質效應農藥均下降至8.2% (表3)。因此，在定量分析中根據樣品種類選擇相應的空白基質，采用基質匹配標準曲線校正，降低基質效應。

表3 不同方法測定3 種基質的基質效應對應的農藥數量Table 3 The number of pesticides within different matrix effect ranges in three matrices by different methods

2.4 實際樣品檢測

利用建立的檢測方法，測定市售的39 份樣品(包括14 份龍眼、10 份荔枝、15 份香蕉)。結果發現：在28 份樣品中檢出農藥殘留，檢出農藥19 種，檢出農藥以殺蟲劑和殺菌劑為主，單個樣品檢出農藥種類1～8 種。檢出頻率較高的農藥有：吡唑醚菌酯 (22 份)、多菌靈 (15 份)、吡蟲啉(9 份)、聯苯菊酯 (5 份)、霜霉威 (4 份)。

對檢測結果進行分析發現，有22 份樣品檢出吡唑醚菌酯，包括荔枝8 份，最大殘留值為0.084 mg/kg，低于我國食品安全國家標準[23](0.1 mg/kg)；香蕉8 份，最大殘留值為0.10 mg/kg；龍眼6 份，最大殘留值為0.12 mg/kg，均符合食品安全國家標準要求。15 份樣品檢出多菌靈，其中龍眼7 份，最大殘留值為0.33 mg/kg，遠低于食品安全國家標準要求 (10 mg/kg)；荔枝和香蕉分別為4 份，最大殘留值分別為0.30、0.20 mg/kg，符合食品安全國家標準要求 (荔枝0.5 mg/kg、香蕉2 mg/kg)。在香蕉中有4 份樣品檢出吡蟲啉，最大殘留值為0.024 mg/kg，符合食品安全國家標準要求 (香蕉0.05 mg/kg)，荔枝和龍眼中也有檢出，分別為2 份和3 份，最大殘留值分別為0.052、0.024 mg/kg，但我國尚未制定最大殘留限量值 (其中，日本規定在其他水果中殘留限量值為4 mg/kg[29])。荔枝中聯苯菊酯和霜霉威的殘留量分別為0.20～0.24 mg/kg和0.039～0.30 mg/kg，而我國尚未制定其最大殘留限量值。目前，日本規定在其他水果中殘留限量值為0.3 mg/kg[29]，未查詢到霜霉威在荔枝、龍眼、香蕉中的最大殘留限量值。

3 結論

本研究基于QuEChERS 前處理技術結合LCMS/MS 建立了同時檢測熱帶水果中110 種農藥的分析方法，采用增加提取溶劑乙腈的體積，消除糖析現象，選擇和優化了NH2-MWCNTs 為凈化材料的用量，確定15 mg 的NH2-MWCNTs 與900 mg MgSO4、150 mg PSA 結合的QuEChERS基質分散凈化劑對熱帶水果荔枝、龍眼、香蕉進行有效的凈化，與現有標準方法比較，本研究建立的方法能夠有效的降低基質效應，提高了準確性，為熱帶特色水果中多農藥殘留檢測及確證分析提供技術支持。