一測多評(píng)法同時(shí)測定參芪二皮冬茶顆粒中6 種成分的含量

冉錚婷，李 希，?，馮建安，王 玉，黃 嫣，樓冠華，陳詩韻，王佳佳

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137； 2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所，四川 成都 610031）

參芪二皮冬茶顆粒系四川省第二中醫(yī)院臨床經(jīng)驗(yàn)方所開發(fā)成的顆粒制劑，由黃芪、夏枯草、陳皮等8 味中藥組成，具有補(bǔ)氣健脾、化痰散結(jié)功效，臨床上用于腫瘤相關(guān)性厭食癥［1］、惡病質(zhì)［2-3］的輔助治療。方中黃芪特有成分［4］毛蕊異黃酮葡萄糖苷具有調(diào)節(jié)免疫［5］、調(diào)節(jié)腸道菌群［6-7］作用； 夏枯草有效成分迷迭香酸具有抗炎、抑制腫瘤作用［8-10］； 陳皮、青皮中的黃酮類成分具有增強(qiáng)胃腸動(dòng)力、抗腫瘤作用［11-13］，其中橙皮苷、橘皮素、川陳皮素對(duì)胃液量、胃蛋白酶含量及活性共同發(fā)揮促進(jìn)作用［14-15］； 阿魏酸作為當(dāng)歸、陳皮、青皮、山慈菇共有成分，具有抗癌作用［16］，并且與川陳皮素共同發(fā)揮抗炎、抗氧化、促胃動(dòng)力作用［17］。

由于中藥復(fù)方制劑療效發(fā)揮需多種成分共同作用，故多成分含量測定可為其質(zhì)量整體控制提供依據(jù)［18-19］。一測多評(píng)法可在明確內(nèi)標(biāo)與其他成分之間相對(duì)校正因子的前提下，通過測定前者含量來得到后者含量，具有高效、便捷的優(yōu)點(diǎn)，故本實(shí)驗(yàn)采用該方法同時(shí)測定參芪二皮冬茶顆粒中阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橙皮苷、橘皮素、川陳皮素的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 BT-125D 型電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］； KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； e2998 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）； Agilent1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）。

1.2 試劑與藥物 橙皮苷（批號(hào)110721-202019，純度95.3%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷 （批號(hào)111920-201907，純度96.1%）、川陳皮素（112055-202001，純度99.6%）、阿魏酸 （批號(hào)110773-201915，純度99.4%）、迷迭香酸 （批號(hào)11871-202007，純度98.1%）、橘皮素 （批號(hào)112054-202001，純度99.8%） 對(duì)照品均由中國食品藥品檢定研究院提供。參芪二皮冬茶顆粒 （批號(hào)20210401、20210402、20210403） 由四川省第二中醫(yī)醫(yī)院所提供。黃芪（批號(hào)210608）、黨參（批號(hào)210526）、茯苓 （批號(hào)210611）、夏枯草 （批號(hào)201229）、陳皮 （批號(hào)201012）、當(dāng)歸 （批號(hào)220209）、青皮 （批號(hào)210122）、山慈菇 （批號(hào)210608） 均由四川省中藥飲片有限公司提供，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所謝守德主任中藥師鑒定為正品。分析純甲醇（成都市科龍化學(xué)品有限公司）； 色譜純磷酸（上海凜恩科技發(fā)展有限公司）； 色譜純甲醇、乙腈（美國賽默飛世爾科技公司）； 水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橘皮素、川陳皮素對(duì)照品適量，甲醇溶解，置于25 mL 量瓶中，制成質(zhì)量濃度分別為 1.856、0.84、0.748、0.784、0.736 mg/mL的貯備液，分別吸取適量，置于25 mL 量瓶中，加入橙皮苷對(duì)照品適量，甲醇稀釋溶解，即得（含阿魏酸37.12 μg/mL、毛蕊異黃酮苷葡萄糖苷134.4 μg/mL、迷迭香酸119.68 μg/mL、橘皮素14.72 μg/mL、川陳皮素29.92 μg/mL、橙皮苷884 μg/mL）。

2.1.2 供試品溶液 取研細(xì)的本品約2.0 g，精密稱定，10 mL 70% 甲醇溶于錐形瓶中，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，溶液冷卻后加入70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按照處方和工藝，分別制成缺黃芪，缺陳皮和青皮，缺夏枯草，缺當(dāng)歸、陳皮、青皮和山慈菇的陰性樣品，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 Agilent Eclipse Plus-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0 ～12 min，10% ～13%A； 12 ～40 min，13% ～16% A； 40 ～72 min，16% ～23% A； 72 ～82 min，23% ～45% A； 82 ～97 min，45% ～48% A； 97 ～100 min，48% ～10% A；100～105 min，10%A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫25 ℃； 檢測波長330 nm （0 ～32 min，阿魏酸；60 ～105 min，迷迭香酸、川陳皮素、橘皮素）、260 nm （32～60 min，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷）； 進(jìn)樣量10 μL。

2.3 專屬性試驗(yàn) 吸取“2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1，可知，各成分色譜峰分離度理想，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 甲醇稀釋“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液至刻度，制成相應(yīng)質(zhì)量濃度，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橙皮苷、橘皮素、川陳皮素峰面積RSD 分別為0.36%、0.21%、0.11%、0.21%、1.09%、0.60%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2” 項(xiàng)下供試品溶液適量，于0、4、8、12、24 h 在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橙皮苷、橘皮素、川陳皮素峰面積RSD 分別 0.82%、0.48%、0.63%、0.28%、0.33%、0.27%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份本品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橙皮苷、橘皮素、川陳皮素含量RSD 分別為1.73%、1.07%、0.54%、0.98%、1.61%、1.42%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的本品（批號(hào)202104111） 9 份，每份約1.0 g，精密稱定，分成3 組，每組3 份，分別按高、中、低比例加入對(duì)照品，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸、川陳皮素、橘皮素平均加樣回收率分別為100.23%、99.82%、100.32%、100.17%、100.23%、101.18%，RSD 分別為1.94%、2.06%、1.37%、2.25%、1.26%、1.36%。

2.9 相對(duì)校正因子計(jì)算 參考文獻(xiàn)［20-21］ 報(bào)道，采用多點(diǎn)校正法，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以橙皮苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他5 種成分的相對(duì)校正因子fk/s，公式為fk/s＝fk/fs＝ （CkAs） /（CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見表2。

表2 各成分相對(duì)校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.10 耐用性試驗(yàn)

2.10.1 儀器、色譜柱 取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，分別考察Waters e2998、Agilent 1260 色譜儀及Eclise Plus C18、Eclise XDB C18、ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 對(duì)各成分相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表3，可知均無明顯影響（RSD＜5%）。

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.10.2 柱溫、體積流量 取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，分別考察不同柱溫、體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表4～5，可知均無明顯影響（RSD＜5%）。

表4 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.4 Effects of different column temperatures on relative correction factors

表5 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.5 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.11 色譜峰定位 取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，分別在“2.10.1” 項(xiàng)儀器、色譜柱上測定保留時(shí)間，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間tRi/s，公式為tRi/s＝tRi/tRs，其中tRi為待測成分保留時(shí)間，tRs為內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間，結(jié)果見表6，可知均無明顯變化（RSD＜5%）。

表6 各成分相對(duì)保留時(shí)間Tab.6 Relative retention time of various constituents

2.12 樣品含量測定 取3 批樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備3 份供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法、一測多評(píng)法計(jì)算含量，結(jié)果見表7，可知2 種方法所得結(jié)果接近（RSD＜5%）。

表7 各成分含量測定結(jié)果（μg/g，n＝3）Tab.7 Results for content determination of various constituents （μg/g，n＝3）

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)先對(duì)各成分進(jìn)行190～400 nm 全波長掃描，發(fā)現(xiàn)阿魏酸最大吸收波長為316 nm，迷迭香酸、川陳皮素、橘皮素最大吸收波長均為330 nm，由于橘皮素含量較低，峰面積較小，故選擇330 nm 作為上述4 種成分的檢測波長； 橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷分別在283、260 nm 處吸收較大，由于后者在283 nm 處峰高較低，而前者在2 種波長處峰高無明顯變化，故選擇260 nm 作為上述2 種成分的檢測波長。再考察了洗脫系統(tǒng)，結(jié)合文獻(xiàn)選擇0.1%磷酸作為水相，同時(shí)分別考察了甲醇、甲醇-乙腈（1 ∶1）、乙腈作為有機(jī)相時(shí)目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰的分離情況，發(fā)現(xiàn)乙腈可更高效地將兩者分開。

3.2 提取溶劑選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了50% 甲醇、70%甲醇、80%甲醇、甲醇，發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取效果最佳，故選擇其作為提取溶劑。

3.3 內(nèi)標(biāo)選擇 由于橙皮苷含量高，性質(zhì)穩(wěn)定，無毒，對(duì)照品廉價(jià)易得，色譜峰峰形最優(yōu)，故本實(shí)驗(yàn)選擇其作為內(nèi)標(biāo)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用一測多評(píng)法同時(shí)測定參芪二皮冬茶顆粒中阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橙皮苷、橘皮素、川陳皮素的含量，該方法簡便可靠，可為該制劑質(zhì)量控制提供參考。