運脾消食方提取工藝放大影響因素研究

林欣榮，高紫薇，束雅春，趙 霞?，吳 磊?

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029）

中藥湯劑是我國應(yīng)用最早、用量最多、臨床應(yīng)用最廣泛的劑型［1］，隨著其大規(guī)模生產(chǎn)，在提取過程中藥材堆積程度顯著增加，蒸汽加熱代替直火加熱，容器體積明顯增大，使其質(zhì)量發(fā)生了本質(zhì)變化，也是其有效性下降、不良反應(yīng)報道增多的因素之一。中藥成分復(fù)雜，各藥味所含有效成分性質(zhì)差異較大，若要確保工藝放大后產(chǎn)品一致性，還需對相關(guān)參數(shù)進(jìn)行細(xì)化研究［2-4］。

中醫(yī)兒科專家江育仁教授通過對脾胃系統(tǒng)疾病的深入研究和臨床實踐，提出“脾健不在補貴在運” 的科學(xué)觀點［5-7］，基于此，總結(jié)出運脾消食方［8］，由蒼術(shù)、白術(shù)、焦山楂、炒麥芽、雞內(nèi)金、生薏苡仁、炒山藥、陳皮、莪術(shù)組成，具有運脾開胃、消食助長之功，在治療小兒厭食脾失健運夾積證中的有效率為93.10%［9］。課題組擬將運脾消食方開發(fā)成醫(yī)療機構(gòu)制劑以造福更多患者，根據(jù)前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)［10-15］，確定了兒茶素、阿魏酸、花旗松素、異牡荊素、蕓香柚皮苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、柚皮苷、桑色素、橙皮苷、木犀草素、常春藤皂苷元、白術(shù)內(nèi)酯I、柚皮素、橙皮素14 種指標(biāo)成分。本實驗基于《醫(yī)療機構(gòu)煎藥室管理規(guī)范》 制備運脾消食湯［16-17］，通過HPLC 指紋圖譜建立與上述指標(biāo)成分含量測定來評價容器體積、火候、投料量對該方制備工藝的影響，以期為其生產(chǎn)過程控制與產(chǎn)品質(zhì)量提升提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀，配置Waters 2998 二極管陣列檢測器 （美國Waters 公司）； AR2140 電子天平［萬分之一，奧豪斯儀器（上海） 有限公司］； PL-S60T 數(shù)顯超聲波清洗機（東莞康士潔超聲波科技有限公司）； 電陶爐（中山市斯梵萊電器有限公司）； 陶瓷藥罐 （容量2 100、2 600、3 100、3 600 mL，江西省康舒陶瓷股份有限公司）； XH-C 旋渦混合器（金壇區(qū)西城新瑞儀器廠）； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）。

1.2 試劑與藥物 兒茶素（批號110877-202005，純度95.1%）、阿魏酸（批號110773-201915，純度99.4%）、花旗松素（批號111816-201102，純度98.9%）、柚皮苷（批號110722-202116，純度93.5%）、橙皮苷 （批號110721-202019，純度95.3%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（批號111976-201501，純度99.9%）、木犀草素 （批號111520-202107，純度96.3%）、常春藤皂苷元（批號111733-201205，純度98.3%）、白術(shù)內(nèi)酯I （批號111975-201501，純度99.9%） 對照品均購于中國食品藥品檢定研究院； 異牡荊素（批號220310，純度98%）、桑色素（批號 220119，純度 98%）、柚皮素 （ 批號220124，純度98%）、橙皮素（批號220315，純度98%） 對照品均購于南京聚康醫(yī)藥化工有限公司；蕓香柚皮苷對照品（批號18101010，純度98%）購于成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純； 其余試劑均為分析純； 水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 方劑制備 依據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》 規(guī)定和要求，稱取麩炒蒼術(shù)10 g、麩炒白術(shù)10 g、陳皮6 g、焦山楂10 g、炒麥芽10 g、炒雞內(nèi)金5 g、生薏苡仁12 g、麩炒山藥15 g、醋莪術(shù)5 g，加入水，用陶瓷罐煎煮2 次，頭煎加3.5倍量水浸泡1 h，文火（火候400 W） 煎煮30 min，二煎加2.4 倍量水煎煮20 min，合并煎液，濃縮，定容至200 mL，即得。

2.2 成分含量測定 采用HPLC 法。

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取兒茶素、阿魏酸、花旗松素、異牡荊素、蕓香柚皮苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、柚皮苷、桑色素、橙皮苷、木犀草素、常春藤皂苷元、白術(shù)內(nèi)酯I、柚皮素、橙皮素對照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度分別為 0.996、1.201、1.014、1.030、0.548、1.102、1.301、1.000、2.500、1.020、1.004、1.321、1.013、1.010 mg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 吸取本品5 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件與圖譜生成 Luna C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相0.1% 磷酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0 ～50 min，95% A；50～100 min，95% ～82%A； 100 ～105 min，82% ～80%A； 105 ～130 min，80% ～70% A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫40 ℃； 檢測波長205 nm； 進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見圖1～2，可知各成分色譜峰均能有效分離。

圖1 對照品HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances

圖2 15 批運脾消食合劑HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints for fifteen batches of Yunpi Xiaoshi Mixture

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012.130723 版），將15 批樣品HPLC 指紋圖譜與對照指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果分別為0.996、0.997、0.998、0.995、0.998、0.998、0.999、0.998、0.998、0.996、0.998、0.999、0.997、0.996、0.996，均大于0.995，表明不同批次樣品之間相似度較高，所建立的指紋圖譜能較全面地反映整體成分情況。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液適量，甲醇逐級稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.2.3” 項色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.2.5 精密度試驗 精密吸取同一份對照品溶液，在“2.2.3” 項色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得兒茶素、阿魏酸、花旗松素、異牡荊素、蕓香柚皮苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、柚皮苷、桑色素、橙皮苷、木犀草素、常春藤皂苷元、白術(shù)內(nèi)酯I、柚皮素、橙皮素峰面積 RSD 分別為 2.8%、2.2%、1.5%、2.6%、2.5%、1.8%、2.7%、2.4%、2.4%、2.5%、2.0%、1.7%、2.3%、2.2%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.2.2” 項下同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.3” 項色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定，測得兒茶素、阿魏酸、花旗松素、異牡荊素、蕓香柚皮苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、柚皮苷、桑色素、橙皮苷、木犀草素、常春藤皂苷元、白術(shù)內(nèi)酯I、柚皮素、橙皮素峰面積 RSD 分別為 2.0%、2.6%、1.6%、2.9%、1.5%、2.1%、2.5%、2.5%、2.4%、2.7%、1.8%、2.5%、2.9%、2.8%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一批本品，按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得兒茶素、阿魏酸、花旗松素、異牡荊素、蕓香柚皮苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、柚皮苷、桑色素、橙皮苷、木犀草素、常春藤皂苷元、白術(shù)內(nèi)酯I、柚皮素、橙皮素含量RSD 分別為2.2%、2.8%、1.9%、0.9%、2.9%、2.6%、1.0%、2.2%、1.5%、2.1%、2.5%、2.7%、2.4%、2.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的同一批本品6 份，每份10 mL，分別精密加入兒茶素、阿魏酸、花旗松素、異牡荊素、蕓香柚皮苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、柚皮苷、桑色素、橙皮苷、木犀草素、常春藤皂苷元、白術(shù)內(nèi)酯I、柚皮素、橙皮素對照品溶液 （質(zhì)量濃度分別為0.010、0.024、0.101、0.041、0.004、0.011、0.260、0.010、1.250、0.102、0.201、0.005、0.005、0.004 mg/mL） 0.8、0.7、1.0、1.3、0.8、1.0、1.0、1.2、1.1、1.1、1.3、1.1、1.0、0.8 mL （加入量與供試品溶液中相應(yīng)成分含量的比值約為1 ∶1），甲醇定容至25 mL，按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.3” 項色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定，計算回收率。結(jié)果，兒茶素、阿魏酸、花旗松素、異牡荊素、蕓香柚皮苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、柚皮苷、桑色素、橙皮苷、木犀草素、常春藤皂苷元、白術(shù)內(nèi)酯I、柚皮素、橙皮素平均加樣回收率分別為 99.7%、101.7%、103.3%、99.0%、98.5%、97.7%、97.2%、99.4%、98.4%、96.9%、96.4%、102.6%、102.7%、101.0%，RSD 分別為 2.2%、2.7%、0.5%、1.8%、2.4%、1.2%、0.8%、1.1%、1.2%、1.1%、1.6%、1.8%、2.6%、2.3%。

2.2.9 樣品含量測定 取15 批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.3” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算含量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果（μg/mL，n＝15）Tab.2 Results for content determination of various constituents （μg/mL，n＝15）

2.3 放大影響因素研究

2.3.1 供試品溶液制備

2.3.1.1 容器體積 稱取本品（一日處方量） 9份，分為3 組，分別用2 600、3 100、3 600 mL 陶瓷罐（編號T1、T2、T3） 按“2.1” 項下方法煎煮，按“2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.3.1.2 火候 稱取本品飲片9 份，分為3 組，按“2.1” 項下方法武火煮沸，文火火候分別控制為500、600、700 W，按“2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.3.1.3 投料量 分別稱取2、3、4、5、6 倍量（即2、3、4、5、6 副藥） 本品飲片各3 份，按“2.1” 項下方法煎煮，按“2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.3.2 結(jié)果分析 取“2.3.1” 項下供試品溶液適量，在“2.2.3” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，以“2.1” 項下煎煮方法所得15 批樣品中各成分平均含量為對照（B1），與不同影響因素測定結(jié)果置于同一雷達(dá)圖中，見圖3。由此可知，兒茶素、阿魏酸、花旗松素、異牡荊素、蕓香柚皮苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、柚皮苷、桑色素、橙皮苷、白術(shù)內(nèi)酯I、柚皮素、橙皮素含量及各成分總含量受火候控制影響較大，木犀草素含量受投料量影響較大，常春藤皂苷元含量受提取容器體積影響較大。

圖3 各成分含量雷達(dá)圖Fig.3 Radar charts for contents of various constituents

再將圖3 數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖4。由此可知，15 批樣品與提取容器體積、投料量均在區(qū)間內(nèi)； 不同火候離散程度較大，并且超出95% 置信區(qū)間，表明該因素影響程度較大。

圖4 不同影響因素主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis diagram for different influencing factors

3 討論

本實驗建立了15 批運脾消食湯HPLC 指紋圖譜，并指認(rèn)了14 個共有峰，發(fā)現(xiàn)相似度均大于0.995，表明其一致性良好，再將不同批次樣品中各成分含量的平均值設(shè)為對照B1，對容器體積、火候、投料量3 個影響因素進(jìn)行放大考察。結(jié)果，在火候方面，大于700 W 時藥液易焦糊，而小于400 W 時煎提效果低，藥液難以煮沸，目前大生產(chǎn)中以蒸汽加熱代替直火加熱，溫度上升快，熱效率高，但火候較難控制，造成藥液總固體含量過高，今后需規(guī)范蒸汽加熱參數(shù)或減少煎煮時間來確保與臨床用藥的一致性［18］； 在容器體積方面，目前大生產(chǎn)中常用不同體積的多功能提取罐，從罐體上部到底部存在較大的溫度梯度，分子熱運動速率不同，物質(zhì)轉(zhuǎn)移速率也不同步，罐體直徑越大，上述現(xiàn)象越明顯［19］，這也是一些中成藥現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中某些指標(biāo)要求較高，但實際生產(chǎn)難以達(dá)到的原因； 在投料量方面，在2 100 mL 陶瓷罐中投入2 ～6 倍量運脾消食方（若超過6 倍量則加水后容易溢出，影響測定結(jié)果），發(fā)現(xiàn)隨著飲片量增加產(chǎn)生堆積，部分成分在提取液中擴散困難，導(dǎo)致其含量較低［20-21］，目前大生產(chǎn)中投料量并未根據(jù)中草藥形狀和有效成分提取難易度進(jìn)行區(qū)分，而是統(tǒng)一建議不超過設(shè)備容積的2/3，如何能與臨床用藥一致還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本實驗建立運脾消食湯HPLC 指紋圖譜，并對該方提取工藝放大影響因素進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)容器體積、火候、投料量對方中14 種指標(biāo)成分含量均具有一定影響。上述結(jié)果為運脾消食方相關(guān)制劑開發(fā)與大生產(chǎn)提供了參考依據(jù)，今后還需結(jié)合藥效學(xué)實驗和臨床應(yīng)用研究來進(jìn)行更系統(tǒng)全面地驗證。