桔梗生藥粉濕熱滅菌工藝優化及不同滅菌方法對其質量的影響

孫 艷，劉源慧，郭田甜，畢艷艷，金 鳳，沈慶國，張娜娜，高艷紅?，關永霞?

（1.魯南制藥集團股份有限公司經方與現代中藥融合創新全國重點實驗室，山東 臨沂 276006； 2.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006）

桔梗為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum（Jacq.） A.Dc.的干燥根，具有宣肺利咽、祛痰排膿功效［1］。桑菊感冒片由桑葉、菊花、連翹、薄荷素油、苦杏仁、桔梗、甘草、蘆根組成，具有疏風清熱、宣肺止咳作用，在制備過程中桔梗粉碎成細粉直接入藥。

按照2020 年版《中國藥典》 規定，直接入藥的生藥粉必須進行滅菌。目前，輻射滅菌、乙醇蒸汽滅菌、濕熱滅菌、干熱滅菌是常用的中藥生藥粉滅菌方法［2-7］，但均存在不同程度的缺陷，故滅菌時要結合藥材本身性質、有效成分特點、實際生產情況等方面來選擇最有效的方法［2，8］。其中，濕熱滅菌能力強，簡便易行，成本低，適用于大生產［9］，由于桔梗中有效成分對熱不敏感，不易水解，故本實驗采用該滅菌方法，并通過響應面法進行優化，再考察不同滅菌方法對該藥材質量的影響，以期為其后續開發及工業化生產提供依據。

1 材料

UltiMate 3000 型高效液相色譜儀，配置Alltech ELSD 6000 型蒸發光散射檢測器（美國Thermo 公司）； 電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）； ZK-82B 型真空干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司）； XS204 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； 脈動真空滅菌柜（山東新華醫療器械股份有限公司）。

桔梗皂苷D 對照品（批號220317，質量濃度0.341 9 mg/mL） 購自中國食品藥品檢定研究院。桔梗（批號210910） 購自安國市宇通藥材有限公司，經魯南制藥集團股份有限公司范建偉高級工程師鑒定為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum（Jacq.） A.Dc.的干燥根。色譜純甲醇 （批號I1176407147）、乙腈（批號K54086430211） 均購自德國默克公司； 分析純甲醇（批號220616035F）購自南京化學試劑有限公司； 水為純化水。

2 方法與結果

2.1 生藥粉滅菌

2.1.1 生藥粉制備 取桔梗適量，粉碎后過6 號篩，即得。

2.1.2 濕熱滅菌樣品制備 按照2020 年版《中國藥典》 四部1421 通則項下方法，取200 g 生藥粉，置于脈動真空滅菌柜中，在103 ℃下滅菌30 min，再放入真空干燥箱中干燥，取出，即得。

2.1.3 輻照滅菌樣品制備 按照2020 年版《中國藥典》 四部1421 通則項下方法，取200 g 生藥粉，置于滅菌室中，60Co 射線以6 kGy 劑量輻照，取出，即得。

2.1.4 干熱滅菌樣品制備 按照2020 年版《中國藥典》 四部1421 通則項下方法，取200 g 生藥粉，在160～170 ℃下滅菌20 min，再放入真空干燥箱中干燥，取出，即得。

2.1.5 乙醇滅菌樣品制備 取200 g 生藥粉，75%乙醇浸潤后密閉滅菌2 h，放入恒溫干燥箱中24 h，取出，再放入真空干燥箱中干燥，取出，即得。

2.2 桔梗總皂苷含量測定 參照2005 年版《中國藥典》 （新版藥典已不再收錄該項目）［10］一部桔梗［含量測定］ 項下方法測定。

2.3 桔梗皂苷D 含量測定 參照2020 年版《中國藥典》 一部桔梗［含量測定］ 項下方法測定。

2.3.1 色譜條件 YMC-Pack ODS-A 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相乙腈-水（25 ∶75）；體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 進樣量10 μL。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取桔梗皂苷D 對照品適量，甲醇制成質量濃度為0.5 mg/mL 溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 參照2020 年版《中國藥典》 一部桔梗［含量測定］ 項下方法制備，即得。

2.3.4 線性關系考察 分別取“2.3.2” 項下對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積對數（Y） 對進樣量對數（X） 進行回歸，得方程為Y＝0.544 8X－0.463 2 （r＝0.999 8），在0.496 8 ～7.452 0 μg 范圍內線性關系良好。

2.4 滅菌率測定 根據2020 年版《中國藥典》四部1105 通則項下的非無菌產品微生物限度檢測法，采用平板計數法測定滅菌率，公式為滅菌率＝［（未處理樣品菌總數－處理樣品菌總數） /未處理樣菌總數］ ×100% （樣品菌總數＝樣品細菌總數＋霉菌及酵母菌總數）。

2.5 權重系數確定 根據滅菌目的和桔梗主要藥效成分功效，選擇桔梗皂苷D 含量、桔?？傇碥蘸俊缇首鳛橹笜?，采用AHP 法確定三者權重，首先將其分為3 個層次［11］，再確定優先順序為桔梗皂苷D 含量＞桔梗總皂苷含量＞滅菌率［11］，最后構建優先判斷矩陣，見表1。結果，桔梗皂苷D 含量、桔梗總皂苷含量、滅菌率權重系數分別為0.633 3、0.260 5、0.106 2，CR ＝0.037 2＜0.1，表明優先判斷矩陣一致性良好，權重系數有效［12-13］。

表1 各指標優先判斷矩陣Tab.1 Priority judgment matrices for various indices

2.6 單因素試驗 初步確定各指標水平分別為滅菌時間10、15、30、45、60、75 min，滅菌溫度95、100、105、110、115、120 ℃，干燥溫度50、60、70、80、90、100 ℃，單因素試驗時固定其余參數（滅菌時間30 min，滅菌溫度100 ℃，干燥溫度80 ℃） 不變，結果見圖1～3。

圖1 滅菌時間對綜合評分的影響Fig.1 Effect of sterilization time on comprehensive score

圖1 顯示，隨著滅菌時間延長，綜合評分先升后降，為30 min 時最大，故選擇15、30、45 min。圖2 顯示，隨著滅菌溫度增加，綜合評分先升后降，為105 ℃時最高，故選擇100、105、110 ℃。圖3 顯示，干燥溫度低于90 ℃時綜合評分變化不大，但大于90 ℃時顯著降低，故選擇70、80、90 ℃。

圖2 滅菌溫度對綜合評分的影響Fig.2 Effect of sterilization temperature on comprehensive score

圖3 干燥溫度對綜合評分的影響Fig.3 Effect of drying temperature on comprehensive score

2.7 響應面法 在單因素試驗基礎上，選擇滅菌時間（A）、滅菌溫度（B）、干燥溫度（C） 作為影響因素，桔梗皂苷D、桔?？傇碥蘸考皽缇实木C合評分 （Y） 作為評價指標，采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件進行優化，因素水平見表2，結果見表3。

表2 響應面法因素水平Tab.2 Factors and levels for response surface method

表3 響應面法設計與結果Tab.3 Design and results for response surface method

采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件對表3 數據進行二次多元回歸分析，得方程為Y＝94.45＋4.39A－4.71B－1.58C－2.21AB－4.02AC－1.07BC－8.73A2－9.69B2－3.99C2，其R2（0.990 3）、均接近1，并且兩者之間也接近，表明模型擬合度良好，方差分析見表4。由此可知，模型P＜0.01，具有高度顯著性； 失擬項P＞0.05，表明模型穩定，可用于預測分析； CV 為1.60%，表明實驗誤差小，操作可信度高； 因素A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2有顯著或極顯著影響（P＜0.05，P＜0.01）；各因素影響程度依次為B＞A＞C。

表4 方差分析結果Tab.4 Results for analysis of variance

采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件進行響應面分析，結果見圖4～6。由圖4 可知，當滅菌時間一定時隨著滅菌溫度增加，綜合評分逐漸升高，超過103 ℃時開始降低； 當滅菌溫度一定時隨著滅菌時間延長，綜合評分逐漸升高； 當滅菌時間超過35 min 時，綜合評分開始降低。由圖5 可知，當干燥溫度一定時隨著滅菌時間延長，綜合評分逐漸升高，但超過35 min 時開始降低； 當滅菌時間一定時隨著干燥溫度增加，綜合評分逐漸升高，但超過76 ℃時程度趨緩。由圖6 可知，當干燥溫度一定時隨著滅菌溫度增加，綜合評分逐漸升高，但超過103.7 ℃時開始降低； 當滅菌溫度一定時隨著干燥溫度增加，綜合評分緩慢升高，但超過76 ℃時開始降低； 因素B曲面較陡峭，提示它對響應值有顯著影響，其次是A、C。

圖5 干燥溫度、滅菌時間響應面圖Fig.5 Response surface plots for drying temperature and sterilization time

圖6 干燥溫度、滅菌溫度響應面圖Fig.6 Response surface plots for drying temperature and sterilization temperature

最終確定，最優工藝為滅菌時間35.47 min，滅菌溫度103.67 ℃，干燥溫度76.55 ℃，結合實際生產及可操作性，將其修正為滅菌時間35 min，滅菌溫度103 ℃，干燥溫度76 ℃，按上述優化工藝進行3 批驗證試驗，結果見表5。由此可知，該工藝穩定可行（RSD＜3%），重復性好，可用于濕熱滅菌工藝。

表5 驗證試驗結果（n＝3）Tab.5 Results for verification tests （n＝3）

2.8 不同滅菌方法對桔梗生藥粉質量的影響

2.8.1 微生物限度 按照2020 年版《中國藥典》四部通則1108 中藥飲片微生物限度檢查法進行檢測，結果見表6，可知各檢查項均合格。

表6 微生物限度檢查結果Tab.6 Results for microbial limit tests

2.8.2 質量檢查 按照2020 年版《中國藥典》一部桔梗項下要求，對滅菌前后鑒別項、水分、總灰分、酸不溶灰分、浸出物、含量測定進行檢測，結果見表7，可知各檢查項均合格。

表7 質量檢查結果Tab.7 Results for quality tests

2.8.3 指紋圖譜建立 分別精密稱取經濕熱滅菌、輻照滅菌、乙醇滅菌、干熱滅菌處理后樣品及未滅菌樣品適量，加入25 mL 50%甲醇，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，50%甲醇補足減失的質量，過濾，取續濾液。分析條件為YMC-Pack ODS-A 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相0.1%磷酸（A） -乙腈 （B），梯度洗脫 （0 ～20 min，10% ～14% B； 20 ～35 min，14% ～20% B； 35 ～55 min，20% ～30% B； 55 ～60 min，30% B； 60 ～70 min，30% ～35%B； 70～80 min，35% ～90%B）； 體積流量0.8 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測波長210 nm； 進樣量10 μL，結果見圖7，相似度見表8。由此可知，與未滅菌相比，不同滅菌方法相似度依次為輻照滅菌＞乙醇滅菌＞濕熱滅菌＞干熱滅菌。

圖7 不同滅菌方法所得樣品指紋圖譜Fig.7 Fingerprints for samples obtained by different sterilization methods

表8 不同滅菌方法所得樣品相似度Tab.8 Similarities of samples obtained by different sterilization methods

3 討論與結論

目前，中藥生藥粉入藥時存在的最大問題是微生物超標［14］、主要藥效成分含量變化。本實驗比較了乙醇滅菌、濕熱滅菌、輻照滅菌、干熱滅菌對桔梗生藥粉質量的影響，發現不同方法下微生物限度檢查均合格； 滅菌后桔梗皂苷D 含量有不同程度的降低，依次為輻照滅菌＞濕熱滅菌＞乙醇滅菌＞干熱滅菌； 指紋圖譜相似度依次為輻照滅菌＞乙醇滅菌＞濕熱滅菌＞干熱滅菌，推測高溫可能導致桔梗皂苷D 含量降低。另外，雖然乙醇滅菌、輻照滅菌對桔梗有效成分的影響均較小，但前者存在較大的安全隱患，后者存在輻照劑量超標的問題； 濕熱滅菌法能在短時間內殺滅微生物，滅菌效果可靠，并且對桔梗有效成分影響較小，操作方便安全，生產成本低，可用于大生產中［15-17］。

綜上所述，本實驗采用響應面法優化桔梗生藥粉濕熱滅菌工藝，得到最優工藝為滅菌時間35 min，滅菌溫度103 ℃，干燥溫度76 ℃，驗證試驗［18］表明其穩定可靠，操作簡便，在生產過程中具有可行性。