臭常山內生真菌次級代謝產物及其α-糖苷酶抑制活性研究

周培鳳，盧永仲，汪小杰，李 焱?，張 振

（1.貴州大學藥學院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州理工學院食品與藥品制造工程學院，貴州 貴陽 550003；3.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025； 4.貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽 550000）

臭常山（OrixajaponicaThunb.） 為蕓香科臭常山屬落葉灌木植物，全株高約1～3 m，根、莖、葉均有特殊性氣味，主要分布于韓國、日本及我國貴州、云南、四川等地［1］。臭常山味苦、辛，性涼，具有疏風清熱、行氣活血、解毒除濕、截瘧、止痛等功效［2］，主要化學成分為喹啉類生物堿和香豆素類化合物。目前尚未出現關于臭常山內生真菌的報道，本研究在前期臭常山化學及活性研究基礎上，進一步探索其內生真菌次級代謝產物，對臭常山植物保護及內生真菌開發應用具有重要意義。

1 材料

LRH-500A 型生化培養箱（廣東泰宏君科學儀器股份有限公司）； 核磁共振波譜儀 （400 Hz、600 Hz，美國布魯克公司）； KT-CJ-1FD 超凈工作臺（無錫市科泰凈化科技有限公司）； SDP-16 半制備液相色譜（日本島津公司）； Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； 提取分離用乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷等均為分析純，液相色譜所用甲醇、乙腈等試劑均為色譜純。

臭常山內生真菌分離于貴州省清鎮市九龍坡爛泥溝采集的臭常山根中 （海拔1 262 m，東經106°30′7″，北緯26°40′36′′），經形態學及基因序列比對 （Gen Bank accession No.MW376535.1），此菌株被鑒定為Fusariumnematophilum。

2 方法

2.1 菌種發酵 將臭常山根中分離出的內生真菌G- （JK） -2 菌種活化，制備成種子液（種子液配方為麥芽糖20.0 g、谷氨酸鈉10.0 g、KH2PO40.50 g、MgSO4·7H2O 0.30 g、葡萄糖10.0 g、酵母膏3 g、甘露醇20 g、去離子水1 L），將制備好的種子液接種于含有大米50 g、去離子水50 mL 的發酵袋中，發酵規模為500 袋，25～29 ℃環境下培養45 d。

2.2 菌株分子鑒定 利用真菌rDNA-ITS 序列通用引物 ITS1 （ 5′-TCCGATGGTGAACCTGCGC-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′） 進行PCR擴增，利用MEGA.7 軟件構建系統進化樹。

2.3 產物的提取分離

2.3.1 分離物制備 采用甲醇對菌株Fusarium nematophilum發酵培養物提取3 次，乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物40 g。

2.3.2 化合物的分離 乙酸乙酯萃取物經硅膠柱色譜分離，以甲醇-二氯甲烷（0 ∶1 ～1 ∶0） 梯度洗脫，獲得7 個亞組分Fr.1～Fr.6。Fr.1 （3.88 g）先以石油醚-乙酸乙酯體系（15 ∶1 ～1 ∶1） 洗脫后，再用二氯甲烷-甲醇體系（5 ∶1 ～0 ∶1） 進行二次硅膠柱層析，得到Fr.1.1 （2.32 g）、Fr.1.2（0.20 g）、Fr.1.3 （0.80 g）。Fr.1.2 經半制備液相色譜純化，25%乙腈洗脫（體積流量3 mL/min，檢測波長254 nm），得化合物G1 （5.0 mg，tR＝11.829 min） 和化合物G2 （2.0 mg，tR＝12.654 min）； Fr.1.3 經pTLC 純化，以二氯甲烷-甲醇（5 ∶1） 展開，得化合物G3 （350.0 mg）。Fr.2（4.21 g） 底部出現不溶于甲醇的粉末狀物質，濾紙過濾使固液分離，粉末狀物質用甲醇重復沖洗后得到化合物G4 （8.0 mg）； 濾液濃縮后經半制備液相色譜純化，20%乙腈洗脫（體積流量3 mL/min，檢測波長254 nm），得化合物G5 （10.0 mg，tR＝10.522 min） 和化合物G6 （8.0 mg，tR＝15.312 min）。

Fr.3 （7.28 g） 以石油醚-乙酸乙酯體系（15 ∶1～1 ∶1） 洗脫后再用二氯甲烷-甲醇體系（5 ∶1 ～0 ∶1） 進行二次硅膠柱層析后得到Fr.3.1（0.20 g）、Fr.3.2 （2.0 g）、Fr.3.4 （1.5 g）。Fr.3.2 經pTLC 純化，以二氯甲烷-甲醇（10 ∶1） 展開，得化合物G7 （736.0 mg） 和化合物G8 （130.0 mg）。

Fr.4 （1.14 g） 經Sephadex LH-20 凝膠柱純化，以二氯甲烷-甲醇（1 ∶1） 洗脫，得Fr.4.1（132.8 mg）、Fr.4.2 （79.0 mg）、Fr.4.3 （40.0 mg），Fr.4.1 經半制備液相色譜純化，以10%甲醇洗脫（體積流量3 mL/min，檢測波長254 nm），得化合物G9 （6.8 mg，tR＝6.733 min）。

Fr.5 （1.00 g） 經Sephadex LH-20 凝膠柱純化，以二氯甲烷-甲醇（1 ∶1） 洗脫，得Fr.5.1（105.6 mg）、Fr.5.2 （213.4 mg）、Fr.5.3 （565.0 mg）。Fr.5.3 經pTLC 純化，以二氯甲烷-甲醇（10 ∶1） 展開，得化合物G10 （5.0 mg）。

Fr.6 （1.29 g） 經Sephadex LH-20 凝膠柱純化，以甲醇洗脫，得Fr.6.1 （200.0 mg）、Fr.6.2（246.6 mg）、Fr.6.3 （186.8 mg）、Fr.6.4 （237.8 mg）。Fr.6.1 經半制備液相色譜純化，以5%乙腈洗脫（體積流量3 mL/min，檢測波長254 nm、210 nm），得化合物G11 （9.0 mg，tR＝7.363 min）、化合物G12 （17.8 mg，tR＝23.43 min）。Fr.6.2經半制備液相純化，以10%甲醇洗脫（體積流量3 mL/min，檢測波長254 nm、210 nm），得化合物G13 （11.0 mg，tR＝10.585 min）。

2.4 α-糖苷酶抑制活性測試 將化合物質量濃度設為1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/mL，α-糖苷酶濃度為280 U/mL。加入α-糖苷酶及對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG） 后的反應條件均為37 ℃、15 min。反應結束后于405 nm 波長下檢測吸光度。反應體系及加樣順序見表1。

表1 α-糖苷酶抑制活性測試反應體系Tab.1 Reaction system of α-glycosidic enzyme inhibition activity test

表2 部分化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用（±s）Tab.2 Inhibitory effect of some compounds on α-glucosidase enzyme （±s）

表2 部分化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用（±s）Tab.2 Inhibitory effect of some compounds on α-glucosidase enzyme （±s）

注： 不同小寫字母代表不同質量濃度之間存在顯著差異（P＜0.05）。

質量濃度/（mg·mL－1）抑制率/%G4G10G11G12G13阿卡波糖1 47.90±0.87a36.54±0.36a40.51±0.82a27.22±0.56a27.72±0.17a89.02±0.87a 0.834.03±0.88b26.96±0.21b32.80±0.73b23.67±0.62b24.96±0.59b86.65±0.63ab 0.632.55±0.48bc25.23±0.22c30.54±0.39c16.57±0.44c21.20±0.54c84.86±1.27bc 0.430.71±0.27cd21.57±0.86d26.08±0.64d12.43±0.33cd19.91±0.46c82.39±0.59c 0.230.18±0.78d19.08±0.16e20.10±0.62e9.22±0.03d16.41±0.30d78.27±1.1d 0.126.12±0.11e17.50±0.25f12.82±0.50f4.14±0.48e15.02±0.74d71.30±0.77e

計算α-糖苷酶抑制率，公式為抑制率＝｛［（AA－AB） － （AC－AD） ］ /（AA－AB） ｝ ×100%，其中AA～AD分別為A～D 組吸光度。

3 結果與分析

3.1 菌株鑒定結果 內生真菌G- （JK） -2 rDNA的ITS 經PCR 擴增，產物序列長度563 bp，測序數據GGAGGGGGGATCCTACCTGATCCGAGGTCACA TTCAGAAAAGTTGGGGGGTTTAACGGCTTGGCCGCG CCGCGTTCCAGTTGCGAGGTGTTAGCTACTACGCAA TGGAGGCTGCAGCGAGACCGCCACTAGATTTAGGGG CCGGCGCGTCCTCTGGCGAGGCCGTTGTGCCGATCC CCAACACCAAGCCCGGGGGCTTGAGGGTTGAAATGA CGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGG GCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGA ATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCG TTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTT GAAAGTTTTGATTTATTTATAGTGGTACTCAGAAGAT ACAAATTAAGACAGGGTTTTGGGTCCTCTGGCGGGC CGTCCCGTTTTACGGGGCGCGGTGATCCGCCGAGGC AACAGTATGGTATGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGT AAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACG GAGACCTTGTTACGACTTTTACTT。

從菌株形態上看，菌株培養一段時間后菌絲呈白色，棉花狀，菌落規則且孢子形態與Fusarium nematophilum基本一致，見圖1，推測G- （JK） -2可能為Fusariumnematophilum［3］。從分子學角度上分析，首先將獲取的序列在NCBI 中進行BLAST，數據顯示前20 條序列均為Fusariumsp.，相似度93% ～97%。利用MEGA 7.0 軟件構建進化樹，方法為最大似然法（maximum likelihood，ML），執行參數Bootstra 設為1 000 次重復，其余參數設置為默認值，見圖 2，結果表明 G- （ JK） -2 為Fusariumnematophilum。

圖1 G- （JK） -2 孢子形態Fig.1 Spore morphology of 2 G- （JK） -2

圖2 G- （JK） -2 系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of G- （JK） -2

3.2 化合物結構鑒定 化合物G1： 白色粉末，分子式C7H6O2，ESI-MSm/z： 123.1 ［M ＋H］＋。1HNMR （600 MHz，CD3OD）δ： 9.74 （1H，s，H-7），7.76 （1H，d，J＝8.7 Hz，H-2，6），6.90 （2H，d，J＝8.6 Hz，H-3，5）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ： 192.9 （C-7），166.0 （C-4），133.5（C-2，6），129.9 （C-1），117.1 （C-3，5）。以上數據與文獻 ［4］ 報道基本一致，故鑒定為phydroxybenzaldehyde。

化合物G2： 白色粉末，分子式C8H8O2，ESIMSm/z： 137.1 ［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ： 7.88 （2H，d，J＝8.8 Hz，H-2，6），6.83 （2H，d，J＝8.8 Hz，H-3，5），2.52 （3H，s，H-8）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ： 199.5（C-7），164.3 （C-4），132.1 （C-3，5），130.0（C-1），116.3 （C-3，5），26.3 （C-8）。以上數據與文獻 ［5］ 報道基本一致，故鑒定為 4-hydroxyacetophenone。

化合物G3： 黃色油狀，分子式C6H8O2，ESIMSm/z： 113.1 ［M ＋H］＋。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ： 5.82 （1H，m，H-6），4.39 （2H，t，J＝6.3 Hz，H-3），2.39 （2H，m，H-4），2.01（3H，m，H-7）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ：164.7 （C-1），158.0 （C-5），116.7 （C-6），65.9（C-3），29.2 （C-4），23.1 （C-7）。以上數據與文獻［6］ 報道一致，故鑒定為anhydromevalonolactone。

化合物G4： 黃色粉末，分子式C17H12N2O4，ESI-MSm/z： 307.1 ［M-H］－。1H NMR （400 MHz，DMSO-d6）δ： 11.61 （1H，s，H-9），8.85 （1H，s，H-4），8.42 （1H，d，J＝7.9 Hz，H-5），7.82（1H，d，J＝8.3 Hz，H-8），7.65 （1H，t，J＝7.7 Hz，H-7），7.42 （1H，d，J＝3.3 Hz，H-3′），7.35 （1H，t，J＝7.5 Hz，H-6），6.63 （1H，d，J＝3.3 Hz，H-4′），4.68 （2H，s，H-6′）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ： 166.6 （C-10），157.3（C-5′），150.3 （C-2′），141.4 （C-8a），132.5（C-9a），131.9 （C-1），129.9 （C-4a），129.0（C-7），122.1 （C-5），121.0 （C-5a），120.6 （C-6），115.8 （C-4），112.9 （C-8），111.1 （C-3′），109.3 （C-4′），56.0 （C-6′）。以上數據與文獻［7］ 報道基本一致，故鑒定為flazine。

化合物G5： 無色針晶，分子式C7H6O3，ESIMSm/z： 139.3 ［M ＋H］＋。1H-NMR （400 MHz，DMSO-d6）δ7.79 （1H，dd，J＝7.9，1.8 Hz，H-6），7.51 （1H，t，J＝8.0 Hz，H-4），6.93 （2H，m，H-3，5）；13C-NMR （100 MHz，DMSO-d6）δ：171.9 （ C-7），161.1 （ C-2），135.7 （ C-4），130.3 （ C-6），119.2 （ C-5），117.1 （ C-3），112.9 （C-1）。以上數據與文獻［8］ 報道基本一致，故鑒定為salicylic acid。

化合物G6： 無色針晶，分子式C7H6O3，ESIMSm/z： 137.1 ［M-H］－，1H-NMR （400 MHz，DMSO-d6）δ： 12.41 （1H，s，OH），10.21 （1H，s，OH），7.79 （2H，d，J＝8.8 Hz，H-3，5），6.82 （2H，d，J＝8.8 Hz，H-2，6）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ： 167.2 （C-7），161.6（C-4），131.5 （C-2，6），121.4 （C-1），115.1（C-3，5）。以上數據與文獻［9］ 報道基本一致，故鑒定為p-hydroxybenzoic acid。

化合物G7： 無色油狀，分子式C24H38O4，HR-ESI-MSm/z： 413.265 77 ［M ＋Na］＋。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ： 7.71 （1H，dd，J＝5.7，3.3 Hz，H-2），7.54 （2H，dd，J＝5.7，3.3 Hz，H-3），4.21 （2H，m，H-6），1.68 （1H，m，H-7），1.36 （8H，m，H-8，9，10，12），0.91（6H，m，H-11，13）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ： 167.9 （C-4），132.5 （C-1），131.0 （C-3），128.9 （C-2），68.3 （C-6），38.9 （C-7），30.5（C-8），29.1 （C-9），23.9 （C-12），23.1 （C-10），14.2 （C-11），11.1 （C-13）。以上數據與文獻［10］ 報道基本一致，故鑒定為 di- （2-ethylhexyl） -phthalate。

化合物G8： 黃色油狀，分子式C24H38O4，HR-ESI-MSm/z： 413.266 2 ［M ＋Na］＋。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ： 8.10 （s，4H，H-2，2′，H-3，3′），4.25 （m，2H，H-6），1.73 （m，1H，H-7），1.39 （ m，8H，H-8，9，10，12），0.92（6H，m，H-11，13）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ： 166.1 （C-4），134.4 （C-1），129.6 （C-2），67.9 （C-6），39.0 （C-7），30.7 （C-8），29.1（C-9），24.1 （C-10），23.1 （C-11），14.2 （C-12），11.2 （C-13）。以上數據與文獻［11］ 報道一致，故鑒定為 terephthalic acid bis （2-ethylhexyl） ester。

化合物G9： 白色粉末，分子式C5H6N2O2，ESI-MSm/z： 127.1 ［M＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，DMSO-d6）δ： 10.99 （1H，s，H-3），10.57 （1H，s，H-1），7.24 （1H，d，J＝5.6 Hz，H-6），1.73（3H，s，H-7）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6）δ：164.9 （ C-4），150.5 （ C-2），137.7 （ C-6），107.7 （C-5），11.8 （C-7）。以上數據與文獻［12］ 報道基本一致，故鑒定為thymine。

化合物G10： 白色無定形粉末，C9H13N2O6，ESI-MSm/z： 244.2 ［M-H］－。1H-NMR （600 MHz，DMSO-d6）δ： 11.32 （1H，s，NH），7.89 （1H，d，J＝8.1 Hz，H-6），5.78 （1H，d，J＝5.5 Hz，H-1′），5.65 （1H，d，J＝8.1 Hz，H-5），5.39（1H，brs，OH），5.10 （1H，brs，OH），4.02 （H，t，J＝5.3 Hz，1H-2′），3.96 （1H，m，H-3′），3.84 （1H，q，J＝3.4 Hz，H-4′），3.62 （1H，d，J＝3.3 Hz，H-5′a），3.55 （1H，d，J＝3.3 Hz，H-5′b）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6）δ： 163.3 （C-4），150.9 （C-2），140.9 （C-6），100.9 （C-5），87.8 （C-1′），84.9 （C-4′），73.6 （C-2′），70.0（C-2′），60.9 （C-3′）。以上數據與文獻［13］ 基本一致，故鑒定為uridine。

化合物G11： 白色固體，分子式C10H13N5O4，ESI-MSm/z： 268.1 ［M＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，DMSO-d6）δ： 8.36 （1H，s，H-2），8.14 （1H，s，H-8），7.35 （2H，s，NH2），5.89 （1H，d，J＝6.2 Hz，H-1′），5.50 （1H，brs，2′-OH），5.44（1H，brs，5′-OH），5.26 （1H，brs，3′-OH），4.62 （1H，t，J＝5.6 Hz，H-2′），4.15 （1H，m，H-3′），3.97 （1H，q，J＝3.4 Hz，H-4′），3.67（1H，brs，H-5′a），3.57 （1H，brs，H-5′b）；13CNMR （150 MHz，DMSO-d6）δ： 156.1 （C-6），152.4 （ C-2），149.0 （ C-4），139.9 （ C-8），119.3 （C-5），87.9 （C-1′），85.9 （C-4′），73.5（C-2′），70.6 （C-3′），61.7 （C-5′）。以上數據與文獻［14］ 報道基本一致，故鑒定為adenosine。

化合物G12： 黃色粉末，分子式C9H12N2O5，HR-ESI-MSm/z： 227.067 345 ［M-H］－。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ： 11.30 （1H，s，NH），7.86 （1H，d，J＝8.1 Hz，H-6），6.15 （1H，t，J＝6.8 Hz，H-1′），5.64 （1H，d，J＝8.1 Hz，H-5），5.26 （1H，brs，OH），5.03 （ 1H，brs，1OH），4.23 （1H，m，H-3′），3.78 （1H，m，H-4′），3.55 （2H，m，H-5′），2.10 （2H，m，H-2′）；13C-NMR （100 MHz，DMSO-d6）δ： 163.2（C-4），150.5 （C-2），140.5 （C-6），100.8 （C-5），87.4 （C-4′），84.1 （C-1′），70.4 （C-3′），61.3 （C-5′），39.7 （C-2′）。以上數據與文獻［15］ 報道一致，故鑒定為2′-deoxyuridine。

化合物G13： 白色無定形粉末，分子式C6H5NO2，HR-ESI-MSm/z： 122.024 45 ［M-H］－。1H-NMR （400 MHz，DMSO-d6）δ： 9.08 （1H，d，J＝2.1 Hz，H-2），8.80 （1H，dd，J＝4.9，1.7 Hz，H-6），8.29 （1H，dt，J＝7.9，1.9 Hz，H-4），7.56 （1H，dd，J＝7.6，4.5 Hz，H-5）；13CNMR （100 MHz，DMSO-d6）δ： 166.2 （-COO-），153.2 （ C-6），150.1 （ C-2），137.1 （ C-4），126.6 （C-3），123.9 （C-5）。以上數據與文獻［16］ 報道基本一致，故鑒定為nicotinic acid。

3.3 α-糖苷酶抑制活性測試 在測試質量濃度范圍內（0.1～1.0 mg/mL），α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著樣品質量濃度增加而增強。質量濃度為1 mg/mL 時G4 的抑制活性最強，抑制率可達到（47.90±0.87）%，在測試質量濃度范圍內各化合物對α-葡萄糖苷酶抑制作用依次為G4＞G11＞G10＞G13＞G12。

4 討論

本研究對臭常山根中的內生真菌G- （JK） -2進行了鑒定，確定其為鐮刀屬內生真菌Fusarium nematophilum，對其次級代謝產物研究分離得到了13 個化合物，化合物類型包括酚酸類、生物堿類、酯類。所有化合物均首次從臭常山內生真菌Fusariumnematophilum中分離得到，其中G7、G8、G10、G11、G13 首次從鐮刀屬內生真菌中分離得到。α-糖苷酶抑制活性篩選結果表明，化合物G4和G11 在1 mg/mL 的質量濃度下二者抑制率分別為（47.90±0.87）% 和（40.51±0.82）%。本研究豐富了Fusariumsp.的化學成分數據庫，為臭常山內生真菌次級代謝產物的研究提供了參考。