市售魚鰾氨基酸及蛋白質成分分析

張金聚，盧一泓，何 傾，吳孟華，馬志國，張 英?，曹 暉?

（1.暨南大學嶺南傳統中藥研究中心，廣東 廣州 510632； 2.國家中藥現代化工程技術研究中心嶺南資源分中心，廣東 廣州 510632； 3.廣東省中醫藥信息化重點實驗室，廣東 廣州 510632）

魚鰾是一種傳統的藥食兩用物質，又稱魚膠、魚肚、魚白、花膠等，在嶺南地區尤為常用，其富含膠質，味道鮮美［1］。中醫藥理論認為，魚鰾可補腎固精、滋養筋脈、養血止血［2-3］。現代研究表明，魚鰾具有抗疲勞、清除自由基、抗氧化、改善便秘、抗癌、促進傷口修復等作用［4-8］。

市售魚鰾通常是將新鮮魚鰾剖開，經去除血管及黏膜、洗凈壓扁、曬干等步驟制成。市場上的魚鰾形態大小各異，價格相差懸殊，來源非常復雜［9-10］。根據已有文獻報道及實驗室前期研究，市場上約70%的魚鰾來源于石首魚科的魚類，此外，也可見來源于尖吻鱸科、刺鲀科等非石首魚科的魚鰾［9-11］。目前，國內外學者對魚鰾成分的研究主要集中于氨基酸、蛋白質、多糖等［12-16］。如趙敏豪等［17］通過氨基酸自動分析儀，發現大黃魚魚鰾等7 種魚鰾均含有17 種常見的氨基酸，但總氨基酸含量存在差異。Kaewdang 等［18］采用酸法和酶法提取了黃鰭金槍魚魚鰾中的膠原蛋白并進行了表征研究，發現魚鰾中富含Ⅰ型膠原蛋白。現有研究大多針對新鮮魚鰾及少數種類的市售魚鰾中的氨基酸、多糖及膠原蛋白進行成分測定和藥理作用研究，缺少對來源復雜的市售魚鰾開展系統的成分分析及對比研究，且對于魚鰾中除膠原蛋白外的蛋白質分析尚為欠缺。因此，對多種市售魚鰾的蛋白質和氨基酸成分進行全面的分析和對比，對于魚鰾藥效物質基礎及質量控制研究具有重要意義，可為魚鰾的開發利用和深入研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 16 批魚鰾樣品購自廣東各藥材市場，由暨南大學嶺南傳統中藥研究中心張英副教授通過性狀和DNA 條形碼鑒別基原，樣品保存于暨南大學藥學院中藥標本館。樣品信息見表1。

表1 魚鰾樣品信息Tab.1 The information of swim-bladder samples

碳酸氫銨（分子生物學級）、尿素（分子生物學級）、甲酸（質譜純）、三氟乙酸（質譜級）、乙腈（色譜純）（美國Sigma 公司）； Waters AccQ·FluorTM氨基酸測定試劑盒（貨號4034882751），包括AccQ·Fluor 衍生劑粉末2A、AccQ·Fluor 稀釋劑2B、AccQ·Fluor 硼酸緩沖液、AccQ·Fluor 醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液、17 種氨基酸混合標準溶液［天冬氨酸（Asp）、絲氨酸 （Ser）、谷氨酸 （Glu）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸 （Pro）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、賴氨酸（Lys） 異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe），濃度均為2.5 mmol/L］，購于美國Waters 公司； BCA 蛋白濃度測定試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物、測序級重組胰蛋白酶、蛋白質分子量標準（6.5 ～270 kDa）、6×蛋白上樣緩沖液 （上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置G7121A FLD 檢測器（美國Aglient 公司）； Milli-Q超純水系統（美國Millipore 公司）； 10 kDa 超濾離心管、EASY-nLC 1200 納升級液相色譜儀、Orbitrap Fusion Lumos 質譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 氨基酸含量測定

1.3.1.1 對照品溶液制備 精密移取適量濃度均為2.5 mmol/L 的含17 種氨基酸的對照品溶液，置于1 mL 量瓶中，用超純水將對照品溶液分別配制成濃度為 25.0、50.0、100.0、250.0、500.0、1 000.0、2 500.0 μmol/L 的系列對照品溶液。

1.3.1.2 樣品溶液制備 取0.05 g 已于50 ℃烘干至恒重的魚鰾樣品，精密稱定，置于耐壓管中，加入6 mol/L HCl 溶液10 mL，120 ℃烘箱中反應24 h，取出，冷卻至室溫，用6 mol/L HCl 溶液補足減失的質量，得水解液； 取5 mL 水解液至蒸發皿中，80 ℃水浴蒸干，用9 mL 超純水分3 次洗滌蒸干后的固體產物，將洗滌液轉移至10 mL 量瓶中并定容至刻度，過0.22 μm 濾膜，即得。每個樣品平行制備3 份樣品溶液。

1.3.1.3 衍生化 Waters AccQ·Fluor 衍生試劑的制備按照Waters AccQ·FluorTM氨基酸測定試劑盒說明書進行操作。吸取1 mL AccQ·Fluor 稀釋劑2B加入到裝有AccQ·Fluor 衍生劑粉末2A 的試劑瓶中，渦旋振蕩10 s，于55 ℃恒溫水浴鍋中加熱8～9 min，制得衍生試劑。

衍生樣品溶液和對照品溶液： 分別吸取10 μL對照品溶液或樣品溶液、70 μL AccQ·Fluor 硼酸鹽緩沖液、20 μL 衍生試劑于0.2 mL 離心管中，放置1 min，渦旋振蕩10 s，于55 ℃恒溫水浴鍋中加熱8～9 min，冷卻，即得。

1.3.1.4 色譜條件 AccQ·FluorTMC18色譜柱（150 mm×3.9 mm，4 μm）； 使用超純水將AccQ·Fluor 醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液（pH 4.95） 按1 ∶10 稀釋，作為流動相A，60%乙腈水溶液為流動相B，梯度洗脫（0 ～0.5 min，0 ～2% B； 0.5 ～15 min，2% ～7% B； 15～19 min，7% ～10% B； 19～32 min，10% ～40% B； 32 ～33 min，40% B； 33 ～34 min，40% ～100% B； 34～37 min，100% B； 37 ～38 min，100% ～0 B）； 體積流量1.0 mL/min； 進樣量5 μL；柱溫37 ℃； FLD 檢測器激發波長250 nm，發射波長395 nm。

1.3.1.5 數據處理 采用Excel 軟件對測得的數據進行處理，氨基酸含量以（±s） 表示，采用SPSS 26.0 軟件進行主成分分析。

1.3.2 蛋白質SDS-PAGE 分析

1.3.2.1 蛋白質提取 參考Wis＇niewski 等［19］的方法并加以改進，稱取0.1 g 魚鰾樣品，加入500 μL含1% 混合蛋白酶抑制劑的PBS，常溫浸泡1 h，組織研磨儀60 Hz 研磨30 s，重復研磨3 次，加入500 μL 含1% 混合蛋白酶抑制劑的SDT 緩沖液（4% SDS，200 mmol/L DTT，200 mmol/L Tris/HCl，pH 7.6），60 Hz 研磨30 s，冰上裂解30 min，沸水浴5 min，100 W 超聲5 s，間隔5 s，循環超聲6 次，再次沸水浴3 min，渦旋振蕩，12 000 r/min 離心10 min，取上清。按照試劑盒說明書，使用BCA 法測定蛋白質濃度。

1.3.2.2 SDS-PAGE 分析 使用SDT 緩沖液調整魚鰾蛋白樣品液質量濃度為1 mg/mL，取20 μL 蛋白樣品液置于0.2 mL 離心管中，加入6×蛋白上樣緩沖液，在100 ℃下煮沸5 min，每孔上樣量10 μL，凝膠電泳于恒壓模式下進行，開始時電壓保持在60 V，進入分離膠后調整電壓為120 V。電泳結束后，使用考馬斯亮藍R-250 將膠片染色1 h，于脫色液 （含50% 甲醇、10% 冰醋酸） 中脫色12 h。

1.3.3 蛋白質種類鑒定分析

1.3.3.1 蛋白質提取與酶解 參考Wi s＇niewski等［19］的方法并加以改進，取“1.3.2.1” 項下蛋白質樣品，使用SDT 緩沖液調整魚鰾蛋白樣品質量濃度為1 mg/mL，取200 μL 蛋白樣品液加入到超濾離心管中，用300 μL 8 mol/L 尿素稀釋，12 000 r/min 離心濃縮30 min，用300 μL 8 mol/L 尿素置換一次； 加入100 μL 50 mmol/L 碘乙酰胺溶液，暗處反應30 min，12 000 r/min 離心濃縮； 8 mol/L尿素置換3 次； 加入300 μL 50 mmol/L 碳酸氫銨溶液置換2 次； 加入胰蛋白酶（1 ∶100），在37 ℃酶解過夜； 酶解完成后，12 000 r/min 離心收集流出液； 用10%三氟乙酸酸化至終濃度0.4%時終止反應，樣品脫鹽后減壓冷凍干燥，用0.1%甲酸水溶液復溶后上機測試。

1.3.3.2 LC-MS/MS 數據采集 復溶后的混合多肽樣品液采用EASY-nLC 1200 納升液相系統進行分離，色譜柱采用Acclaim PepMap 100 RPLC C18預柱（300 μm×5 mm，5 μm） 和Acclaim PepMap 100 RPLC C18分離柱（75 μm×150 mm，3 μm）； 流動相2%乙腈（含0.1% 甲酸）（A） -80% 乙腈 （含0.1%甲酸）（B），梯度洗脫（0～14 min，5% ～12%B； 14～40 min，12% ～24% B； 40～53 min，24% ～38% B； 53 ～54 min，38% ～95% B； 54 ～60 min，95% B）； 體積流量580 nL/min； 進樣量3 μL。

樣品經色譜分離后用Orbitrap Fusion Lumos 采集數據，離子源為納升源； 噴霧電壓2.2 kV （正離子模式）；m/z100.0～1 500.0； 分辨率60 000 at 400m/z； 隔離寬度為3m/z，歸一化碰撞能量為40 eV，選擇豐度前15 的離子采集二級質譜。

1.3.3.3 搜庫 質譜分析原始數據采用Proteome Discoverer 2.0 軟件進行查庫鑒定，數據庫為UniProt＿ Sciaenidae.fasta （共66 963）、UniProt＿Ariidae.fasta （共1 410 條）、UniProt＿Ophidiidae.fasta （共554 條）、UniProt＿Polynemidae.fasta （共411 條）、UniProt＿Pangasiidae.fasta （共21 731 條）、UniProt＿ Diodontidae.fasta （共344 條）、UniProt＿Centropomidae.fasta （共58 460 條）。檢索參數酶切為胰蛋白酶，最大漏切數為2，無固定修飾，可變修飾設置為甲硫氨酸氧化、蛋白N 端乙酰化，蛋白假陽性率≤1%。

2 結果與分析

2.1 氨基酸含量測定

2.1.1 系統適用性 取衍生化后的對照品工作液和樣品溶液，在“1.3.1.4” 項條件下進樣測定。結果表明，衍生化后的17 種混合氨基酸標準品和樣品的色譜圖峰形尖銳，分離度良好，可用于魚鰾樣品中氨基酸含量的測定，見圖1。

圖1 氨基酸標準品（A） 和魚鰾樣品（B） HPLC 代表色譜圖Fig.1 Representative HPLC Chromatograms of amino acids standard （A） and swimbladder sample （B）

2.1.2 線性關系考察 分別取“1.3.1.1” 項下濃度為 25.0、50.0、100.0、250.0、500.0、1 000.0、2 500.0 μmol/L 的氨基酸對照品溶液10 μL 進行衍生，在“1.3.1.4” 項條件下進樣測定，以各氨基酸標準品的峰面積為縱坐標（Y），其對應的濃度為橫坐標（X） 進行回歸。如表2 所示，在一定濃度范圍內，17 種氨基酸線性關系良好，其相關系數在0.998 3～0.999 9 之間，可以作為定量分析依據。

表2 17 種氨基酸的標準曲線、相關系數及線性范圍Tab.2 Calibration curves，correlation coefficients and linear ranges of 17 amino acids detected by HPLC

2.1.3 精密度試驗 取濃度100.00 μmol/L 的對照品衍生溶液，在“1.3.1.4” 項條件下平行測定6 次，計算17 種氨基酸峰面積測定值的RSD。結果顯示，17 種氨基酸峰面積的RSD 為0.28% ～2.28%，表明該方法精密度較好，可用于魚鰾樣品中17 種氨基酸的含量測定。

2.1.4 穩定性試驗 取樣品S1 制備樣品溶液，在“1.3.1.4” 項條件下分別于0、12、24、30 h進樣測定，計算不同時間點17 種氨基酸峰面積測定值的RSD。結果顯示，17 種氨基酸在30 h 內峰面積測定值RSD 為0.80% ～1.78%，表明樣品在30 h內穩定性良好。

2.1.5 重復性試驗 取樣品S1 5 份，每份0.05 g，平行制備5 份樣品溶液，在“1.3.1.4” 項條件下進樣測定，計算17 種氨基酸含量并計算RSD。結果顯示，17 種氨基酸含量計算值的RSD 為1.21% ～3.25%，表明該方法的重復性較好。

2.1.6 加樣回收率試驗 取已知氨基酸濃度的樣品S1 6 份，每份約0.01 g，精密稱量，置于耐壓管中，每3 份為一組，第一組加入1.0 mL 濃度均為2.5 mmol/L 的17 種氨基酸對照品溶液，第二組加入150 μL 濃度均為2.5 mmol/L 的17 種氨基酸對照品溶液，按照“1.3.1.2” 項下方法水解樣品，取5 mL 水解樣品，置于蒸發皿中，80 ℃水浴蒸干，用4 mL 超純水分3 次洗滌蒸干后的固體產物，將洗滌液轉移至5 mL 量瓶中，用超純水定容，過0.22 μm 濾膜，即得樣品溶液。在“1.3.1.4”項條件下進樣測定，通過第一組樣品的測定結果，計算Asp、Ser、Glu、Gly、Arg、Thr、Ala、Pro、Val、Lys、Leu 的回收率以及RSD； 通過第二組樣品的測定結果，計算His、Cys、Tyr、Met、Ile、Phe 的回收率以及RSD。結果顯示，Asp、Ser、Glu、Gly、Arg、Thr、Ala、Pro、Val、Lys、Leu 的平均加樣回收率為102.69% ～109.60%，RSD 為0.57% ～3.46%； His、Cys、Tyr、Met、Ile、Phe 的平均加樣回收率為85.62% ～108.00%，RSD 為1.17% ～4.43%，加樣回收率較好，滿足魚鰾樣品中氨基酸的含量測定要求。

2.1.7 魚鰾樣品中氨基酸含量測定 取16 批魚鰾樣品各3 份，每份0.05 g，精密稱量，平行制備3份樣品溶液，在“1.3.1.4” 項條件下進樣測定，結果見表3。16 批魚鰾樣品均檢出17 種氨基酸，但氨基酸總量存在差異，介于468.31～620.05 mg/g之間。在測定的氨基酸中，含量最高者為甘氨酸，達到110.43 ～133.91 mg/g，約占總量的21.50% ～24.35%，其次為脯氨酸、精氨酸、谷氨酸和丙氨酸，上述5 種氨基酸的含量占總量的60.42% ～69.61%，為魚鰾中的優勢氨基酸。大部分魚鰾中含量最低的氨基酸為半胱氨酸，平均為5.16 mg/g，與酪氨酸含量接近，這與段振華等［20］的研究結果相似。

表3 16 批市售魚鰾中氨基酸種類及含量（mg/g，n＝3）Tab.3 Kinds and contents of amino acids in 16 batches of commercially swim-bladders （mg/g，n＝3）

魚鰾中的氨基酸與其風味和功效密切相關，魚鰾具有特殊的鮮味，其鮮味來源于其中的谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸［21］，6 種呈味氨基酸的含量占總量的49.77% ～52.98%。魚鰾中精氨酸的平均含量為56.26 mg/g，精氨酸能顯著提高精子的數量以及活力，在治療由于少精、精子活力低引起的男性不育癥中有良好的療效［22］。在臨床應用中，魚鰾常用于治療少精和精子活力低導致的男性不育癥，這可能與其含有較高含量的精氨酸有關［23］。

傳統經驗認為，石首魚科魚類的魚鰾質量優于其它種類的魚鰾，市場上石首魚科的魚鰾價格也相對較高［9-10］。本研究所收集的16 批魚鰾共來源于10 種魚類，其中S1 ～S8 來源于非石首魚科，S9 ～S16 則來源于石首魚科。不同基原的魚鰾氨基酸含量存在一定的差異，如S2 商品名為葫蘆膠，來源于海鲇科的派氏沼海鲇，其氨基酸總含量最低，為468.31 mg/g； 氨基酸總含量最高的為S12，來源于石首魚科的長吻擬牙，其氨基酸總含量可達620.05 mg/g。雖然S2 的總氨基酸含量低于S12，但S2 所含氨基酸中必需氨基酸占氨基酸總含量的23.5% （110.23 mg/g），高于 S12 的 20.0%（124.10 mg/g）。進一步對16 批魚鰾中氨基酸含量進行了主成分分析并繪制散點圖，結果見圖2，S1～S8 和S9～S16 在第一和第二主成分上未能明顯地區分開，初步表明石首魚科和非石首魚科的魚鰾中的氨基酸成分差異并不明顯。

圖2 16 批魚鰾樣品氨基酸主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis of amino acids in 16 batches swim-bladder samples

市場上的魚鰾種類繁多，對魚鰾的真偽優劣評價僅依賴于傳統的經驗，缺乏統一的標準，氨基酸是魚鰾的主要成分之一，氨基酸的組成及含量是衡量魚鰾質量的重要指標，考慮到不同魚種的魚鰾氨基酸含量的差異，應將魚鰾中含量較高的甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酸等作為重要指標，同時與其它指標，如脂肪酸和礦物質等的組成及含量進行結合，共同作為制定魚鰾質量標準的依據，以全面、客觀地評價魚鰾的質量。

2.2 魚鰾樣品中蛋白質SDS-PAGE 分析 由圖3可知，16 批魚鰾中蛋白質在分子質量52 ～270 kDa內均有分布，且蛋白條帶的顏色深淺有較高的相似性，表明不同的魚鰾樣品中的蛋白質成分比較接近。在分子質量95～130 kDa 和175 ～270 kDa 明顯存在一些高豐度的蛋白，與Cruz-López 等［24］通過酸法、酶法提取出的魚鰾中Ⅰ型膠原蛋白相似。已有研究表明，魚鰾中含量最多的蛋白質為由2 條α1 鏈和1 條α2 鏈組成的Ⅰ型膠原蛋白，分子質量為110～130 kDa，并含2 條α 鏈聚合的β 鏈及3 條α 鏈聚合的γ 鏈，且多肽鏈中最常見的三肽單位是G-X-Y （G 為甘氨酸，X、Y 通常分別為脯氨酸和羥脯氨酸）［25-26］。由圖3 可知，95～130 kDa 明顯存在2 種高豐度蛋白，應分別為Ⅰ型膠原蛋白的α1鏈和α2 鏈，175～270 kDa 范圍內的高豐度蛋白則可能為Ⅰ型膠原蛋白的β 鏈和γ 鏈，此結果與前述氨基酸含量的測定結果相吻合。

圖3 魚鰾蛋白質SDS-PAGE 圖譜Fig.3 SDS-PAGE patterns of proteins from swim-bladders

除Ⅰ型膠原蛋白，在52 ～95 kDa 范圍內還存在較多的低豐度蛋白。研究表明，魚鰾膠原蛋白具有組織相容性、低抗原性等特點，用于生物醫用材料、高分子復合材料具有獨特的優勢［27］，現有的工業超聲波膠原蛋白提取系統可高效提取魚鰾中的膠原蛋白，但后續的膠原蛋白純化程度不夠理想［28］，本研究結果初步表明，魚鰾中含有較多分子量52～95 kDa 的蛋白質，其分子量較膠原蛋白小，因此，可考慮利用超濾技術，除去分子質量相對較小的雜蛋白，高效簡便地實現膠原蛋白的純化。

2.3 魚鰾樣品中蛋白質鑒定分析 通過蛋白質組學分析，在16 批魚鰾樣本中共鑒定688 種蛋白質，其中547 種（80%） 蛋白質分子量≤100 kDa （見圖4），表明魚鰾中含有豐富的低分子量的蛋白質，與前述SDS-PAGE 分析結果基本吻合。

圖4 魚鰾中蛋白質分子質量分布Fig.4 Molecular weight distribution of proteins in swim-bladder samples

共鑒定膠原蛋白有11 種（表4），其中，I 型膠原蛋白的α1 鏈和α2 鏈覆蓋度均達到40%，Ⅱ型、Ⅵ型和Ⅶ型膠原蛋白覆蓋度均≥10%，此外還有Ⅳ型、Ⅴ型等膠原蛋白。由此可見，魚鰾中所含蛋白質以Ⅰ型膠原蛋白為主，其它種類的膠原蛋白為輔。另外，魚鰾中還含有多種非膠原蛋白質，如作為細胞骨架的角蛋白，其與膠原蛋白類似，具有良好的生物相容性，可用于制作促進傷口愈合的復合材料等［29］，具有良好的應用前景。對魚鰾中蛋白質種類的全面鑒定分析可為更深入地研究和開發利用魚鰾提供參考。

表4 魚鰾中鑒定得到的膠原蛋白Tab.4 Identified collagens in swim-bladders

3 結論

本實驗建立了AQC 柱前衍生結合超高效液相色譜同時測定魚鰾中17 種氨基酸的方法，該方法具有良好的精密度、重復性、穩定性和回收率。通過提取魚鰾中蛋白質，采用SDS-PAGE 對魚鰾中蛋白質的分子量分布等特征進行研究，同時采用蛋白質組學的方法對魚鰾中的蛋白質種類進行鑒定。結果表明，不同基原的魚鰾均含有17 種氨基酸，且含量非常豐富，氨基酸總含量的平均值達到539.47 mg/g，甘氨酸在魚鰾中的含量最高，其次為脯氨酸、精氨酸、谷氨酸和丙氨酸。甘氨酸具有維持前列腺健康等功能，丙氨酸、谷氨酸可與甘氨酸組成復合制劑，用于治療前列腺炎和前列腺肥大，精氨酸則能顯著提高精子質量，常用于治療男性不育癥，魚鰾中的優勢氨基酸為其補腎固精、滋養筋脈等功效提供了一定的理論依據和物質基礎。通過對魚鰾中氨基酸含量進行主成分分析，結果顯示不同的魚鰾樣品在第一和第二主成分上沒有明顯區分開，表明不同來源的魚鰾中的氨基酸成分差異不明顯。

魚鰾中的蛋白質主要為Ⅰ型膠原蛋白，SDSPAGE 分析結果表明魚鰾中蛋白質分子量在52 ～270 kDa 均有分布，除95～130 kDa 和175～270 kDa的豐度較高的I 型膠原蛋白鏈外，在52～95 kDa 還存在較多的低豐度蛋白，從蛋白條帶的分子質量和顏色深淺分析，不同的魚鰾中蛋白質成分具有較高的相似性。通過蛋白質組學對魚鰾中的蛋白質種類進行鑒定，發現魚鰾含有多達11 種膠原蛋白，同時含有多種用途廣泛的非膠原蛋白質，如角蛋白等。

綜上所述，魚鰾中氨基酸含量及蛋白質成分的系統分析，為魚鰾的質量控制及品質評價提供了科學依據，也為其深層次的開發利用提供了新思路。