涼粉草浸膏噴霧干燥工藝優(yōu)化

謝 平，溫仁華，魏海峰，沈金海，3，郝春莉，3?，陳良華

（1.四川大學華西廈門醫(yī)院科技部，福建 廈門 361022； 2.廈門華廈學院環(huán)境與公共健康學院，福建 廈門 361024； 3.廈門市食品藥品安全重點實驗室，福建 廈門 361024； 4.福建省亞熱帶植物研究所，福建 廈門 361006）

涼粉草（MesonachinensisBenth.） 又名仙草，為唇形科涼粉草屬一年或多年生草本植物［1］，主要成分有黃酮類、酚類、多糖等，具有抗腫瘤、降血壓、抗氧化、抗炎等作用［2-3］。

噴霧干燥是一種干燥藥材提取液的方法，具有速度快、有效成分破壞少等特點，工藝條件直接影響到浸膏粉的貯存、后續(xù)的制粒等流程。由于藥材成分較為復雜，影響因素通常不止1 個，需考察的指標較多，因此通過多因素多目標進行優(yōu)化。在優(yōu)化過程中需考慮各指標權重，通常通過主觀或客觀賦權確定指標權重，G1 法是一種主觀評價方法與層次分析法相比，計算速度更快、無需一致性檢驗［4-5］； CRITIC 法是通過實際數(shù)據(jù)所反映的客觀信息確定權重的客觀方法［6-7］。通過組合權重可避免數(shù)據(jù)出現(xiàn)較大偏差，同時減少人為因素的影響； BP 神經(jīng)網(wǎng)絡模擬人腦神經(jīng)結構，通過反向傳播不斷調整網(wǎng)絡，在不知曉具體數(shù)學模型的情況下進行尋優(yōu)［8-11］。

本實驗采用G1 法結合CRITIC 法計算出粉率、含水量、5 種指標成分含量及總黃酮含量的權重系數(shù)，以計算所得的綜合評分為評價指標，利用BP 人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型結合Box-Behnken 響應面法進行優(yōu)化，驗證其可行性，確定最優(yōu)的噴霧干燥工藝，為涼粉草的應用與開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 YC-1800 型噴霧干燥機（上海雅程儀器有限公司）； LC-20A 型高效液相色譜儀、UV-2450 型紫外可見分光光度計（日本島津公司）； DHG-9076A 型電熱鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）； JB/T5374-1991 型電子天平［奧豪斯國際貿易（上海） 有限公司］； BSA224S 型電子天平［萬分之一，賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］； XS205 型電子天平［十萬分之一，梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］； HH-2 型恒溫水浴鍋（江蘇常州華普達有限公司）。

1.2 試劑與藥物 涼粉草（產(chǎn)地福建龍巖武平） 購自藥材市場，經(jīng)廈門華廈學院賴源發(fā)副教授鑒定為唇形科涼粉草MesonachinensisBenth.的干燥全草。咖啡酸 （批號D18121724，純度≥98%）、丹酚酸B （批號D18102409，純度≥98%）、紫草酸 （批號D19041017，純度≥98%）、紫云英苷（批號D19012403，純度≥98%） 對照品均由南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司提供； 迷迭香酸 （批號RP180607，純度≥98%）、蘆丁（批號RP190213，純度≥98%） 對照品均由成都麥德生科技有限公司提供。甲醇、乙腈均為色譜純； 其他試劑均為分析純； 水為超純水。

2 方法與結果

2.1 濃縮液制備 根據(jù)課題組前期優(yōu)化的工藝進行提取，將水提液在70 ℃下分別減壓濃縮至相對密度1.04～1.08 的浸膏。

2.2 指標成分含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 取咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、紫云英苷、丹酚酸B 對照品適量，甲醇制成質量濃度分別為0.102 0、0.237 0、0.098 0、0.220 0、0.106 0 mg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取浸膏粉0.1 g，置于25 mL 量瓶中，20% 甲醇溶解，室溫下稀釋至刻度，過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 以20%甲醇為陰性樣品，制成相應溶液，即得。

2.2.4 色譜條件 中譜紅RD-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 體積流量1.0 mL/min； 流動相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0 ～9.5 min，18% A； 9.5 ～18.5 min，18% ～19%A； 18.5～20 min，19% ～20%A； 20～25 min，20% ～22% A； 25 ～35 min，22% ～24% A； 35 ～42 min，24% ～30% A； 42 ～50 min，30% ～18% A）； 柱溫25 ℃； 檢測波長320 nm； 進樣量10 μL。咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 色譜峰分離度良好（均大于1.5）； 理論塔板數(shù)按咖啡酸計，不低于3 000。

2.2.5 專屬性試驗 分別精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液10 μL，在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定，發(fā)現(xiàn)陰性樣品在出峰位置無干擾，表明該方法專屬性良好，見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.2.6 線性關系考察 分別精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液0.2、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL量瓶中，稀釋至刻度，在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積（Y） 對其質量濃度（X） 進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.2.7 精密度試驗 取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 峰面積RSD 分別為0.83%、0.17%、0.22%、0.26%、0.32%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液適量，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定，測得咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 峰面積RSD 分別為0.86%、2.74%、1.55%、2.67%、2.57%，表明溶液在12 h 內穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復性試驗 精密稱取浸膏1 g，按“2.2.2” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定，測得咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 峰面積RSD 分別為1.50%、1.66%、1.65%、2.59%、1.76%，表明該方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取浸膏約0.05 g，精密稱定，精密加入對照品溶液適量，按“2.2.2” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2.4” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 平均加樣回收率分別為100.19%、101.18%、100.35%、99.71%、100.08%，RSD 分別為1.62%、1.76%、1.39%、2.78%、2.13%。

2.3 總黃酮含量測定

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取蘆丁對照品適量，甲醇溶解，即得（該成分質量濃度為0.245 0 mg/mL）。

2.3.2 供試品溶液制備 同“2.2.2” 項。

2.3.3 陰性樣品溶液制備 同“2.2.3” 項。

2.3.4 顯色方法、檢測波長選擇 分別精密吸取對照品、供試品溶液各1.0 mL，置于25 mL 量瓶中，依次加入1.0 mL 7.5%NaNO2溶液后放置6 min，1.0 mL 7.5%Al （NO3）3溶液后放置6 min，10.0 mL 4%NaOH 溶液后放置10 min，搖勻，檢測波長200 ～800 nm，空白為缺供試品的顯色體系。結果，兩者均在500 nm 波長處有最大吸收峰，故選擇500 nm 作為檢測波長。

2.3.5 標準曲線繪制 精密吸取對照品溶液適量，逐級稀釋，按“2.3.4” 項下方法測定吸光度。以對照品吸光度（A） 對其質量濃度（X） 進行回歸，得方程為A＝1.01×10－2X＋1.1×10－3（r＝0.999 6），在39.22 ～88.24 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.3.6 精密度試驗 精密吸取“2.3.1” 項下對照品溶液3.0 mL，按“2.3.4” 項下方法測定吸光度6 次，測得其RSD 為0.41%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液適量，于0、5、10、15、20、25、30 min 按“2.3.4” 項下方法測定吸光度，測得其RSD 為2.55%，表明溶液在30 min 內穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復性試驗 精密稱取浸膏0.1 g，共6 份，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，按“2.3.4” 項下方法測定吸光度，測得其RSD 為1.28%，表明該方法重復性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 取6 份蘆丁含量已知的浸膏，每份約0.05 g，精密稱定，精密加入對照品適量，按“2.3.4” 項下方法測定吸光度，計算回收率。結果，蘆丁平均加樣回收率為99.28% （RSD＝2.95%）。

2.4 相對密度測定 按2015 年版《中國藥典》 四部通則中“相對密度測定法” 項下第一法（比重瓶法） 進行。

2.5 得粉率測定 取100 mL 涼粉草水煎濃縮液進行噴霧干燥，計算粉末量； 同體積水浴至完全蒸干，在100 ～105 ℃干燥3 h，冷卻，精密稱定，計算含固量。出粉率＝（粉末量/含固量） ×100%。

2.6 含水量測定 按2015 年版《中國藥典》 四部通則中“水分測定法” 項下第二法（烘干法） 進行。

2.7 評價指標的組合賦權

2.7.1 G1 法 根據(jù)G1 法，對8 項指標的重要程度排序為含水量＞出粉率＞總黃酮＞咖啡酸＝紫云英苷＝迷迭香酸＝紫草酸＝丹酚酸B （y1＞y2＞y3＞y4＝y(tǒng)5＝y(tǒng)6＝y(tǒng)7＝y(tǒng)8，yk為評價指標），通過rk＝y(tǒng)k－1/yk，k＝n，n－1，…，2 （rk為兩者之間的重要性程度之比）［12］，確定各指標的權重評價標度r，r2＝1.2，r3＝1.2，r4＝1.1，r5＝1.0，r6＝1.0，r7＝1.0，r8＝1.0，由公式（Wk－1＝rkwk，k＝n，n－1，…，2） 計算各指標的主觀權重wk。

2.7.2 CRITIC 法 對比強度以標準差σj體現(xiàn)，沖突性以指標之間相關性Rj體現(xiàn)，結合兩者進行計算，（rij為評價指標i和j之間的相關系數(shù)）［13-14］。

將表中的數(shù)據(jù)進行標準化處理，指標成分＝ （實測值－最小值） /（最大值－最小值），得到相矩陣如下。

表2 各評價指標權重計算結果

2.8 Box-Behnken 響應面法 在單因素試驗基礎上，選擇進風溫度（A）、空氣體積流量（B）、泵數(shù)（C） 作為影響因素，含水量（y1）、得粉率（y2）、總黃酮（y3）、咖啡酸（y4）、紫云英苷（y5）、迷迭香酸（y6）、紫草酸（y7）、丹酚酸B （y8） 的綜合評分（Y） 作為評價指標，進行三因素三水平設計，具體見表3，結果見表4。

表3 Box-Behnken 響應面法因素水平

表4 Box-Behnken 響應面法設計與結果

2.9 回歸模型的建立及分析 通過Design Expert 8.0.5b 軟件進行擬合，得綜合評分（Y） 二次多項回歸方程為Y＝0.82－0.021A＋3.700×10－3B＋0.013C＋0.018AB＋8.860 0×10－3AC－0.061BC－0.024A2＋0.018B2＋3.310×10－3C2。再進行方差分析，發(fā)現(xiàn)回歸模型的P＜0.05，說明它具有顯著性； 失擬項（P＝0.665 1） 不顯著，說明擬合度良好，可用來分析和預測； 一次項A的P＜0.05，表明其對噴霧干燥工藝影響極顯著； 影響涼粉草噴霧干燥工藝的因素依次為進風溫度＞泵速＞空氣體積流量，見表5。響應面分析見圖2。

表5 方差分析結果

2.10 BP 人工神經(jīng)網(wǎng)絡研究

2.10.1 模型建立 本實驗建立BP 神經(jīng)網(wǎng)絡模型（3 層），輸入節(jié)點3 個，即進風溫度（A）、空氣體積流量（B）、泵數(shù)（C）； 輸出節(jié)點1 個，即綜合評分Y。為增加訓練空間內的樣本密度，根據(jù)響應面試驗數(shù)據(jù)，讓每組數(shù)據(jù)增加8個虛擬樣本（每組數(shù)據(jù)增加1 個△±X值，X＝±0.2%），其中17 組作為測試樣本，其余作為訓練樣本。

2.10.2 隱含層節(jié)點確定 分別建立隱含層單元數(shù)為1～10的模型，并利用其平均絕對誤差MAEtrain、平均絕對誤差MAEtext、數(shù)據(jù)整體均方誤差MSE 等指標進行分析，最終確定隱層節(jié)點數(shù)為9，見表6。

表6 神經(jīng)元數(shù)目優(yōu)化結果

2.10.3 尋優(yōu) 建立輸入層＝3、輸出層＝1、隱藏層＝9 的模型，并對其進行訓練（循環(huán)次數(shù)＝1 000，學習速率＝0.01，誤差目標＝0.00 001），設置進風溫度、空氣體積流量、泵數(shù)3 個因素的步長為1，并設定每個因素定義域，通過Sim 函數(shù)進行仿真輸出，尋求輸出最大值及對應組合，優(yōu)化得最佳噴霧干燥工藝為進風溫度171 ℃，空氣體積流量45 m3/h，泵數(shù)12，步距最優(yōu)值為0.915 1。

2.11 驗證試驗 利用Design Expert 8.0.5 b 軟件得噴霧干燥最佳工藝為進風溫度165.47 ℃，空氣體積流量45.05 m3/h，泵數(shù)11.99%，考慮設備參數(shù)設定，將其修正為進風溫度165 ℃，空氣體積流量45 m3/h，泵數(shù)12%。驗證試驗表明，Box-Behnken 響應面法測得綜合評分平均值為0.915 0，BP 人工神經(jīng)網(wǎng)絡測得綜合評分平均值為0.915 9，與理論預測值相比無顯著性差異，提示工藝穩(wěn)定可靠，可用于噴霧干燥，見表7。

表7 驗證試驗結果（n＝3）

3 討論

本實驗通過噴霧干燥方法直接將提取液干燥成粉狀，省去濾過、粉碎等工序，簡化生產(chǎn)工藝，提高效率。本實驗對相對密度、進風溫度、泵數(shù)與空氣體積流量進行單因素實驗考察，結果表明當相對密度過大時，出粉率急劇降低、含水量上升，故在后續(xù)實驗中選擇藥液相對密度1.06進行考察。由于物料本身極易吸潮，應快速裝入密封袋內，立即放入干燥器中密封保存。

與主客觀賦權（G1-熵權法、AHP-CRITIC 法等） 相關研究比較，主觀賦權G1 法是對主觀賦權代表AHP 的一種優(yōu)化評價方法［15-18］； 本實驗中水分是噴霧干燥浸膏的基本性質參數(shù)，其數(shù)值越低越好，其它評價指標值越高越好，客觀賦權CRITIC 法同時考慮了各指標性間的沖突性，因此選擇CRITIC 法進行客觀賦權。

采用基于G1-CRITIC 法的主客觀組合賦權方法，結合Box-Behnken 響應面法回歸方程準確度高的優(yōu)勢，確保多指標評價結果的科學性和合理性。與BP 神經(jīng)網(wǎng)絡相關研究比較，采用經(jīng)G1-CRITIC 法賦權的綜合評分，同時利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡技術的預測與推斷能力，自主學習尋找到大范圍內的最優(yōu)的工藝條件，不增加試驗次數(shù)，同時獲得不同因素的最優(yōu)組合，節(jié)約研究時間與成本，結果更加準確，為其他藥材的干燥工藝提供了一種新的思路，有望應用于藥材提取、干燥、成型等工藝研究中，具有一定的實際開發(fā)利用前景［19］。