低共熔溶劑提取魚腥草中綠原酸工藝優化

顧東雅，金紹娣，謝佳伶，史怡穎

（鹽城工業職業技術學院藥品與健康學院，江蘇 鹽城 224000）

魚腥草俗稱折耳根，具有清熱解毒、利尿消腫的功效［1］，具有抗菌、抗病毒、提高機體免疫力、化痰、利尿、抗癌等作用［2-4］。綠原酸是魚腥草中活性成分之一，具有增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降壓降脂、抗艾滋病作用［5-6］。目前，對于綠原酸提取方法主要是酶法、微波、超聲波等［7］，主要采用傳統的有機溶劑，對環境不友好［8］，探索一種綠色高效提取方法很有必要。低共熔溶劑是由氫鍵接受體和氫鍵提供體組成的共熔混合物［9］，溶解度高、可生物降解、無毒［10-11］，具有原料成本低、合成簡單、不產生三廢等優點［12］。目前，以魚腥草為原料提取綠原酸的文獻報道較少，而且低共熔溶劑提取魚腥草中綠原酸也尚未有研究報道。

本實驗制備7 種低共熔溶劑并進行篩選，以篩選后的低共熔溶劑提取魚腥草中的綠原酸，以綠原酸提取率為評價指標，單因素試驗考察低共熔溶劑含水量、料液比、提取溫度和時間對提取率的影響； 正交試驗優化提取工藝，與水、60%乙醇等傳統溶劑進行比較，以期為低共熔溶劑在魚腥草綠原酸的高效提取提供科學依據。

1 材料

1.1 試劑與藥物 魚腥草購于頌藥堂精品藥材店，經江蘇天宇檢測技術有限公司裴麗高級研究員鑒定為正品。綠原酸對照品（分析純，廣州市江順化工科技有限公司）。氯化膽堿、尿素（分析純，茂名市雄大化工有限公司）。乙腈（色譜純，濟南元素化工有限公司）； 乙二醇、丙三醇、1，4 丁二醇、丁二酸、檸檬酸、乙酸、甲醇均為分析純。

1.2 儀器 FA2204B 電子分析天平（濟南程騰生物技術有限公司）； UV759 高分辨紫外分光光度計（青島聚創華業分析儀器有限公司）； Prominence LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津公司）； HJ-6 恒溫磁力攪拌器（深圳市鼎鑫宜實驗設備有限公司）； KS50R 高速冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）； LAB-BL2 冷凍干燥機（悅高致實驗儀器有限公司）。

2 方法

2.1 低共熔溶劑制備 將氫鍵接受體氯化膽堿與氫鍵提供體乙二醇、丙三醇、1，4 丁二醇、尿素、乳酸、檸檬酸、乙酸等按一定比例置于圓底燒瓶中，60～85 ℃水浴加熱1～2 h，磁力攪拌混合均勻，直至溶液澄清，干燥，冷卻至室溫，即得［13］。

2.2 綠原酸提取 按照文獻［14］ 報道精密稱取2.50 g魚腥草藥材粉末若干份，置于圓底燒瓶中，加入低共熔溶劑，控制料液比、溫度、時間和含水量，提取綠原酸，離心分離，上清液置于100 mL 量瓶中，乙腈-水（25 ∶75）定容至刻度，計算提取率，公式為提取率＝ （c×V×n/m） ×100%，其中c為提取液中綠原酸質量濃度，V為提取液體積，n為提取液稀釋倍數，m為魚腥草質量。

2.3 對照品溶液制備 按照文獻［15］，精密稱取5.25 mg 綠原酸對照品，置于25 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得。

2.4 色譜條件 流動相乙腈-水（25 ∶75）； 體積流量1 mL/min； 柱溫室溫； 檢測波長327 nm； 進樣量25 μL。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 對照品溶液，置于10 mL 量瓶中，定容至刻度。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程為Y＝4 608X＋2.845 （r＝0.999 6），在0.102 ～0.637 mg/mL 范圍內線性關系良好。

2.5.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液25 μL，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得綠原酸峰面積RSD 為0.36%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性試驗 取同一份綠原酸提取液適量，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得提取率RSD 為0.42%，表明該方法重復性良好。

2.5.4 穩定性試驗 取綠原酸提取液適量，于1、6、12、24、36、48 h 在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，測得綠原酸含量RSD 為1.49%，表明提取液在48 h 內穩定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取綠原酸含量已知的提取液6 份，精密加入0.21 mg/mL 對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，綠原酸平均加樣回收率為99.21%，RSD 為1.00%。

2.6 單因素試驗

2.6.1 低共熔溶劑組成 本實驗采用氯化膽堿作為氫鍵受體，與不同氫鍵供體（乙二醇、丙三醇、1，4 丁二醇、尿素、乙酸、丁二酸、檸檬酸） 制備低共熔溶劑，固定含水量20%，料液比1 ∶30，提取溫度60 ℃，提取時間40 min，考察氯化膽堿與氫鍵供體比例1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5對綠原酸提取率的影響。

2.6.2 含水量 以氯化膽堿-乙酸（1 ∶3） 為提取劑，固定料液比1 ∶30，提取溫度60 ℃，提取時間40 min，改變氯化膽堿-乙酸體系中的含水量 （0、10%、20%、30%、40%、50%、60%），考察其對綠原酸提取率的影響。

2.6.3 料液比 以氯化膽堿-乙酸（1 ∶3） 為提取劑，固定含水量為20%，提取溫度60 ℃，提取時間40 min，改變料液比（1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50），考察其對綠原酸提取率的影響。

2.6.4 提取溫度 以氯化膽堿-乙酸（1 ∶3） 為提取劑，固定含水量20%，料液比1 ∶30，提取時間40 min，改變提取溫度 （ 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃），考察其對綠原酸提取率的影響。

2.6.5 提取時間 以氯化膽堿-乙酸（1 ∶3） 為提取劑，固定含水量20%，料液比1 ∶30，提取溫度60 ℃，改變提取時間 （10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min），考察其對綠原酸提取率的影響。

2.7 正交試驗 基于單因素試驗，以氯化膽堿-乙酸（1 ∶3） 為提取劑，選取料液比、提取溫度和提取時間作為影響因素，綠原酸提取率作為評價指標，設計正交試驗。

2.8 數據處理 單因素試驗平行3 次，取平均值，采用正交設計助手、Excel 等軟件進行分析。

3 結果

3.1 單因素試驗

3.1.1 不同組成的低共熔溶劑 由表1 可知，隨著比例增大綠原酸提取率先升高后降低，為1 ∶3 時最高，主要是由于比例變化導致提取液中氫鍵的網格體系變化，從而使其擴散系數、極性等性質發生變化。當氫鍵供體為多元醇時，綠原酸的提取率普遍較低； 當氫鍵供體為尿素時，綠原酸提取率最低； 當氫鍵供體為有機酸時，綠原酸的提取率普遍較高，因為綠原酸在氫鍵供體呈堿性時結構不穩定，易被破壞； 酸性條件下最穩定，表現出較高的提取率，但檸檬酸是三元羧酸，使得提取綠原酸時受到一定的阻力，故提取率較其他有機酸略低。最終，選擇氯化膽堿-乙酸比例1 ∶3。

表1 不同低共熔溶劑對綠原酸提取率的影響

3.1.2 含水量 由圖1A 可知，綠原酸提取率隨氯化膽堿-乙酸體系中含水量的增加先升高后降低，為20% 時最高，主要是因為氯化膽堿-乙酸體系通過氫鍵連接，而水作為極性溶劑能降低其黏度，增大擴散系數，從而提高對綠原酸的提取能力； 但含水量過高時會導致體系極性過大，引起氫鍵斷裂，從而影響綠原酸的提取。最終，選擇含水量20%。

圖1 單因素試驗結果

3.1.3 料液比 由圖1B 可知，綠原酸的提取率隨料液比的增大逐漸升高，為1 ∶30 時最高，之后再增大時提取率變化不大甚至略有下降，因為料液比增大降低了氯化膽堿-乙酸體系的黏度，增加了擴散性，從而提高了體系的提取率； 當提取液中綠原酸已達到一定的飽和度時再增大料液比對提高提取率作用不大，反而導致提取出的綠原酸重新吸附到原待提物中，使其略有下降。最終，選擇料液比1 ∶30。

3.1.4 提取溫度 由圖1C 可知，綠原酸提取率隨溫度增加先升高后降低，為60 ℃時最高，主要是因為溫度較低時氯化膽堿-乙酸與綠原酸結合作用力較弱，不利于后者溶出，從而提取率較低； 溫度升高能使體系的黏度下降，擴散系數提高使得擴散速率增加，同時提高綠原酸的溶出；但綠原酸本身不穩定，對強光和高溫很敏感，若繼續升高溫度會導致其結構改變，使得提取率降低。最終，選擇提取溫度60 ℃。

3.1.5 提取時間 由圖1D 可知，綠原酸提取率隨時間延長先快速升高，為60 min 時最高，隨后趨于平緩，變化不大，主要是因為60 min 后提取液中綠原酸基本飽和，再延長時間對其提取幫助較小。最終，選擇提取時間60 min。

3.2 正交試驗 依據單因素試驗結果，以綠原酸提取率為評價指標，料液比、提取溫度、提取時間為影響因素，每個因素3 個水平［16］，具體見表2，結果見表3。

表2 正交試驗因素水平

表3 正交試驗結果

由表3 可知，料液比對綠原酸提取率的影響最主要，各因素影響次序為A＞B＞C，最優提取工藝為A2B3C2，即料液比1 ∶30，提取溫度70 ℃，提取時間60 min，提取率為5.43%，與單因素試驗中在料液比1 ∶30、提取溫度60 ℃、提取時間60 min 條件下提取率為5.32%基本接近。從實際考慮，最終確定最優工藝為提取溶劑氯化膽堿-乙酸（1 ∶3），含水量20%，料液比1 ∶30，提取溫度70 ℃，提取時間60 min。

3.3 提取結果比較 以料液比1 ∶30、提取溫度70 ℃、提取時間60 min 為提取工藝，采用水、60%乙醇、氯化膽堿-乙酸（1 ∶3，含水量20%） 作為提取劑對魚腥草中的綠原酸進行提取，重復3 次，取平均值。由表4 可知，相同條件下低共熔溶劑對魚腥草中綠原酸的提取率明顯高于傳統溶劑，可實現高效提取的優點。

表4 2 種溶劑提取結果比較

4 結論

文獻［17］ 中提取魚腥草最佳提取溶劑是60%的乙醇，而本實驗發現氯化膽堿與不同氫鍵供體共混，氫鍵供體呈酸性且比例為1 ∶3 時綠原酸提取率最高，原因可能是綠原酸在酸性條件比較穩定，氯化膽堿分別與氫鍵供體乙酸、丁二酸、檸檬酸組成的低共熔溶劑體系使得提取液中氫鍵的網格體系發生變化，使其擴散系數、極性等性質也發生變化，更利于綠原酸溶出，但多元羧酸又阻礙了綠原酸的進一步提取。另外，低共熔溶劑體系中含水量對綠原酸的提取率也有較大的影響，無水時體系黏度高，流動性差，低共熔溶劑不利于滲透入提取液中，從而不利于綠原酸的提??； 當低共熔溶劑體系中加入一定量的水時，可使體系黏度下降，低共熔溶劑能較好進入提取液的基質內部，破壞植物細胞壁，利于綠原酸的提取，但含水量過高，也不利于綠原酸的提取，最后篩選出氯化膽堿-乙酸（1 ∶3，含水量20%） 為最佳提取溶劑，具有制備簡單、提取率高、可生物降解、不產生三廢等優點［8］，為其在天然植物方面的提取及綠原酸提取新工藝提供了參考。