半硫丸調控AMPK/PPARγ/GPAT3 信號通路對甲減模型大鼠脂質代謝異常的保護作用

曾明星，陳繼東，向 楠，鄒小娟

［1.湖北中醫藥大學基礎醫學院，湖北 武漢 430065； 2.湖北中醫藥大學第一臨床學院，湖北 武漢 430061； 3.湖北省中醫院（湖北中醫藥大學附屬醫院） 內分泌病科，湖北 武漢 430070］

甲減是臨床上常見的內分泌疾病。在我國，甲減的患病率已高達17.8%，甲減可引起低代謝癥群，進而引起多臟器和組織損傷，嚴重威脅身體健康［1］。其中，血脂異常是甲減的常見并發癥之一，由此帶來的動脈粥樣硬化性心血管疾病備受關注［2］； 同時，甲減引起的高膽固醇血癥還會增加膽結石形成，引起肝臟脂肪變性，使得ALT/GGT 輕度異常，非酒精性脂肪性肝病風險增加［3］； 甲減還可改變卵巢脂質的含量和相關信號通路，進而影響卵泡的成熟，引起女性不孕的發生［4］。可見，甲減引起的血脂代謝障礙可引起心血管、肝臟、膽囊、生殖等多系統功能障礙，危害性大，需要展開深入研究。

Ma 等［5］研究發現，TSH 可通過與TSHR 結合，抑制AMPKThr172磷酸化，激活PPARγ 轉錄，進而促進成熟脂肪細胞GPAT3表達，AMPK/PPARγ/GPAT3信號通路可能是甲減合并血脂異常的重要機制之一。甲減合并血脂異常屬于中醫“癭勞” “血濁” 病范疇，其中以脾腎陽虛證最為多見［6］。本研究選取具有溫腎健脾、化痰通濁功效的經典方劑半硫丸，探討其對甲減合并血脂異常的作用及其效應機制，以期為臨床提供新的治療方法和思路。

1 材料

1.1 動物 5 周齡SPF 級SD 雄性大鼠，體質量（200±20） g，由三峽大學提供，實驗動物生產許可證號SCXK（鄂） 2017-0012，自由飲食，溫度20 ～22 ℃，相對濕度50% ～60%，適應性飼養1 周，飼養于湖北中醫藥大學實驗動物中心。本研究經湖北中醫藥大學實驗動物中心動物倫理委員會批準（倫理號HUCMS202009007）。

1.2 藥物 半硫丸膠囊，0.5 g/粒，由湖北省中醫院藥劑科提供，用生理鹽水配成3% 混懸液備用； 丙硫氧嘧啶片（規格100 mg，批號31180401，精華制藥集團股份有限公司）； 左甲狀腺素鈉片（規格50 μg，批號241246，德國Merck 公司）。

1.3 試劑 蘇木素（美國Sigma 公司，貨號H9627）； 伊紅Y （水溶性，國藥集團化學試劑有限公司，貨號71014544）； 大鼠促甲狀腺素 （TSH）、游離甲狀腺素（FT4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3） 酶聯免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號EEL-R0976c、E-EL-0122c、E-EL-0079c）； 兔多抗GAPDH（杭州賢至生物科技有限公司，貨號AB-P-R001）； 兔多抗GPAT3、PPARγ、p-AMPK （美國Affinity Biosciences 公司，貨號Af0485、Af6284、Af3422）； 兔多抗AMPK （英國Abcam 公司，貨號Ab131512）； HRP 標記羊抗兔二抗、兔多抗TSHR （武漢博士德生物工程有限公司，貨號BA1054、A00576-1）。

1.4 儀器 全自動生化分析儀（美國Rayto 公司，型號Chemray）； 病理切片機（德國Leica 公司，型號RM 2016）；組織攤烤片機（武漢俊杰實業集團有限公司，型號JK-6）；顯微鏡（日本Olympus 公司，型號BX53）； 微型高速離心機（美國Labnet 公司，型號C2500-R-230V）； 電熱恒溫培養箱（日本ASONE 公司，型號ICV-450）； 多功能酶標儀（美國Molecular Devices 公司，型號Flex Station 3）； 垂直電泳槽、電轉儀 （北京六一儀器有限公司，型號DYCZ-24DN、DYCZ-40）； 實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司，型號QuantStudio 6）； 水平電泳儀、紫外分析儀（北京君意東方電泳設備有限公司，型號JY300、JY02S）。

2 方法

2.1 造模與分組 將60 只SD 大鼠隨機分為正常組（10只），灌胃給予等體積生理鹽水； 造模組（50 只），灌胃給予含10 mg/kg 丙硫氧嘧啶片的生理鹽水，連續28 d。造模成功后，將模型大鼠隨機分為模型組、優甲樂組、半硫丸低劑量組、半硫丸高劑量組和聯合用藥組（優甲樂聯合半硫丸），每組10 只。藥物劑量按實驗動物與人體表面積比換算，即200 g 大鼠所需劑量相當于成人量×0.018。

2.2 給藥 優甲樂組大鼠每天灌胃給予0.04%優甲樂混懸液1.8 mL，半硫丸低、高劑量組大鼠每天分別灌胃給予3%半硫丸混懸液0.9、1.8 mL，聯合用藥組大鼠每天灌胃給予0.04% 優甲樂混懸液0.9 mL 和3% 半硫丸混懸液0.9 mL，正常組、模型組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水，持續6 周。

2.3 標本制備 麻醉各組大鼠，經心臟采血，分離血清用于甲狀腺功能和血脂檢測，每組8 只大鼠斷頭處死，分別取甲狀腺、腎周脂肪，置于－70 ℃保存，用于形態學檢查、相關蛋白和mRNA 表達檢測。

2.4 ELISA 法檢測大鼠甲狀腺功能、血脂水平 按照相關試劑盒說明書操作，檢測各組大鼠的甲狀腺功能相關指標（FT3、FT4、TSH） 和血脂水平（TC、TG、LDL、HDL）。

2.5 HE 染色觀察腎周脂肪組織 取相應組織，固定、脫水、包埋、切片、脫蠟、染色，顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 RT-qPCR 法檢測腎周脂肪組織PPARγ、GPAT3mRNA表達 通過Primer Premier 5.0 軟件設計引物，由武漢擎科生物技術有限公司合成，引物序列為PPARγ正向5′-GACATCCCGTTCACAAGAGC-3′，反向 5′-GCTCTTCATGT GGCCTGTTG-3′，產物長度151 bp；GPAT3正向5′-CATCA GTCCAAAGCTCACCA-3′，反向5′-ACAGGGAGCGAACACA GATC-3′，產物長度212 bp。擴增反應條件為50 ℃2 min，95 ℃10 min； 95 ℃30 s，60 ℃30 s，共40 個循環。繪制熔解曲線，數據以2－ΔΔCT法進行分析，計算目的基因的mRNA 相對表達量。

2.7 Western blot 法檢測腎周脂肪組織TSHR、p-AMPK、PPARγ、GPAT3蛋白表達 提取大鼠腎周脂肪組織總蛋白，檢測蛋白濃度，蛋白通過SDS-PAGE 凝膠電泳分離并轉移至PVDF 膜。5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，4 ℃下分別加入兔多抗TSHR （1 ∶500）、GPAT3（1 ∶1 000）、PPARγ（1 ∶1 000）、p-AMPK （1 ∶1 000）、AMPK （1 ∶500）、GAPDH （1 ∶1 000） 抗體孵育24 h。用TBST 稀釋相應的HRP 標記二抗（1 ∶50 000），使PVDF 膜浸泡于二抗孵育液中，室溫搖床孵育2 h，顯影、曝光，采用IPP 6.0 分析軟件對各組條帶進行分析，得到蛋白相對表達量。

2.8 統計學分析 通過SPSS 24.0 軟件進行處理，計量資料均符合正態分布且方差齊，數據以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 半硫丸對甲減大鼠腎周脂肪組織病理形態的影響 與正常組比較，模型組大鼠脂肪滴明顯聚集增多； 與模型組比較，各給藥組脂肪滴聚集改善； 與優甲樂組比較，半硫丸各劑量組與聯合用藥組改善更為明顯； 與半硫丸低劑量組比較，半硫丸高劑量組效果更好，見圖1。

圖1 各組大鼠腎周脂肪組織HE 染色（×200）

3.2 半硫丸對甲減大鼠血清FT3、FT4、TSH 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清FT3、FT4水平降低（P＜0.01），TSH 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，優甲樂組和聯合用藥組大鼠血清FT3、FT4水平升高（P＜0.01），TSH 水平降低（P＜0.01），而半硫丸高、低劑量組改變不明顯，沒有統計學差異（P＞0.05），見表1。

表1 半硫丸對甲減大鼠血清FT3、FT4、TSH 水平的影響（±s，n＝8）

表1 半硫丸對甲減大鼠血清FT3、FT4、TSH 水平的影響（±s，n＝8）

注： 與正常組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別FT3/（pg·mL－1） FT4/（pg·mL－1） TSH/（ng·mL－1）正常組39.94±2.5238.16±2.9419.70±5.70模型組20.78±2.66?? 15.26±2.24?? 44.33±10.05?優甲樂組36.07±1.58＃＃31.75±2.31＃＃24.88±3.86＃＃半硫丸低劑量組 22.41±3.7516.18±3.0040.00±8.72半硫丸高劑量組 25.00±4.3717.14±2.2834.38±9.41聯合用藥組30.23±3.97＃＃25.77±2.97＃＃29.89±2.34＃＃

3.3 半硫丸對甲減大鼠血清TC、TG、LDL、HDL 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C 水平升高（P＜0.01），HDL-C 水平無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清TC、LDL-C 水平降低（P＜0.01），優甲樂組和聯合用藥組大鼠血清TG 水平降低（P＜0.01），見表2。

表2 半硫丸對甲減大鼠血清TC、TG、LDL、HDL 水平的影響（mmol/L，±s，n＝8）

表2 半硫丸對甲減大鼠血清TC、TG、LDL、HDL 水平的影響（mmol/L，±s，n＝8）

注： 與正常組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別TCTGLDL-CHDL-C正常組3.07±0.141.80±0.171.10±0.161.57±0.23模型組4.64±0.16??2.25±0.20??2.87±0.08??1.28±0.24優甲樂組3.14±0.17＃＃1.84±0.10＃＃1.24±0.18＃＃1.42±0.28半硫丸低劑量組3.70±0.40＃＃1.99±0.102.07±0.20＃＃1.30±0.14半硫丸高劑量組3.52±0.33＃＃1.86±0.151.90±0.20＃＃1.54±0.32聯合用藥組3.25±0.11＃＃1.85±0.40＃＃1.55±0.11＃＃1.40±0.12

3.4 半硫丸對甲減大鼠腎周脂肪組織PPARγ、GPAT3mRNA 表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎周脂肪組織PPARγ、GPAT3mRNA 表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，半硫丸各劑量組和聯合用藥組大鼠腎周脂肪組織PPARγmRNA 表達降低（P＜0.01），各給藥組大鼠腎周脂肪組織GPAT3mRNA 表達降低（P＜0.01），見表3。

表3 半硫丸對甲減大鼠腎周脂肪組織PPARγ、GPAT3 mRNA 表達的影響（±s，n＝8）

表3 半硫丸對甲減大鼠腎周脂肪組織PPARγ、GPAT3 mRNA 表達的影響（±s，n＝8）

注： 與正常組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別PPARγGPAT3正常組0.98±0.111.01±0.14模型組2.68±0.26??1.84±0.19??優甲樂組2.51±0.131.11±0.11＃＃半硫丸低劑量組2.18±0.18＃＃1.15±0.12＃＃半硫丸高劑量組1.74±0.21＃＃1.15±0.26＃＃聯合用藥組1.65±0.16＃＃1.16±0.19＃＃

3.5 半硫丸對甲減大鼠腎周脂肪組織TSHR、p-AMPK、PPARγ、GPAT3蛋白表達的影響 與正常組比較，半模型組大鼠腎周脂肪組織TSHR、PPARγ、GPAT3蛋白表達升高（P＜0.01），p-AMPK 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，半硫丸各劑量組和聯合用藥組大鼠腎周脂肪組織TSHR、PPARγ、GPAT3蛋白表達降低 （P＜0.01），p-AMPK 蛋白表達升高（P＜0.01），優甲樂組大鼠腎周脂肪組織GPAT3蛋白表達降低（P＜0.01），見表4、圖2。

圖2 腎周脂肪組織TSHR、p-AMPK、PPARγ、GPAT3 蛋白條帶圖

表4 半硫丸對甲減大鼠腎周脂肪組織TSHR、p-AMPK、PPARγ、GPAT3 蛋白表達的影響（±s，n＝8）

表4 半硫丸對甲減大鼠腎周脂肪組織TSHR、p-AMPK、PPARγ、GPAT3 蛋白表達的影響（±s，n＝8）

注： 與正常組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別TSHRp-AMPKPPARγGPAT3正常組0.32±0.040.63±0.020.10±0.010.31±0.03模型組0.82±0.09??0.17±0.04??0.51±0.04??0.67±0.05??優甲樂組0.74±0.070.22±0.040.48±0.040.33±0.04＃＃半硫丸低劑量組0.66±0.06＃＃0.31±0.04＃＃0.41±0.03＃＃0.47±0.06＃＃半硫丸高劑量組0.54±0.05＃＃0.34±0.04＃＃0.31±0.04＃＃0.52±0.06＃＃聯合用藥組0.53±0.04＃＃0.39±0.09＃＃0.30±0.03＃＃0.47±0.04＃＃

4 討論

甲減是繼發性血脂異常的常見病因［7］。升高的血脂可以影響內膜厚度，促進高血壓發展［8］，嚴重者可出現心衰［9］。甲狀腺激素治療雖能改善脂代謝狀態，但需終生服藥，同時也增加了心血管疾病的風險［10］，而中醫藥在防治甲減及合并癥方面具有一定的優勢和特色［11］。

甲減屬于中醫“癭勞” 病范疇，以脾腎陽虛為主，可夾雜痰濕、瘀血、郁熱等變證［12-14］。半硫丸出自《太平惠民和劑局方》，可用于甲減的治療，療效頗佳，半硫丸能降低Thc 水平［15］，但具體機制不清。研究發現，敲除TSHR可增加脂肪細胞的大小，減少TSH 誘導的脂解［16］。Ma等［5］研究發現，TSH 與TSHR 結合后，可抑制AMPKThr172磷酸化，激活PPARγ 轉錄，增加GPAT3表達，增加TG 的生成。本研究發現甲減大鼠血清TG、TC、LDL-C 水平升高，提示甲減合并血脂紊亂［17］。還發現，腎周脂肪組織PPARγ、GPAT3mRNA 基因表達升高，TSHR、PPARγ、GPAT3蛋白表達升高，p-AMPK 蛋白表達降低，提示其存在AMPK/PPARγ/GPAT3信號通路異常表達［5］。

AMPK 激活后通過下調脂肪生成酶，抑制脂肪酸合成，促進游離脂肪酸氧化，減少脂質合成［18］。本研究中甲減大鼠p-AMPK 蛋白表達較正常組降低，AMPK 信號通路被抑制，脂肪酸合成增加，PPARγ 表達上調，進而導致血脂升高。PPARγ 活化后通過參與脂代謝相關基因的調控，抑制脂質代謝。PPARγ 表達升高可能是模型組脂滴過度積聚的原因，半硫丸能抑制PPARγ 的表達，抑制脂滴的積累。綜合半硫丸能升高p-AMPK 蛋白表達，降低PPARγ 蛋白表達，推測半硫丸可能是通過激活AMPK 信號通路，下調PPARγ 表達，進而限制脂肪生成，減少脂質合成，起到改善脂質代謝的作用［19］。

特定的GPAT 亞型在不同的細胞中啟動甘油三脂的合成［20］，GPAT3主要位于內質網［21］，是一種參與TG 合成的限速酶［22］。在本研究中，模型組脂滴增大，GPAT3表達升高； 經半硫丸給藥后，脂滴的數量減少和大小變小，同時GPAT3mRNA 和蛋白表達降低，這可能與半硫丸降低GPAT3表達，減少TG 合成有關。綜合半硫丸能升高p-AMPK 蛋白表達，降低PPARγ 的表達，推測隨著TSH 水平和TSHR 蛋白表達降低，AMPK/PPARγ/GPAT3通路被抑制，血脂水平隨之下降。

綜上所述，各藥物干預均能有效降低血脂水平，優甲樂和半硫丸均能下調GPAT3mRNA 表達，半硫丸還能下調PPARγmRNA 表達，降低TSHR、PPARγ、GPAT3蛋白表達，升高p-AMPK 蛋白表達； 聯合用藥組降低TG 的效果與優甲樂組相當，聯合用藥后還可降低TSHR、PPARγ 蛋白表達，提示半硫丸的加入起到了減量增效作用。因此，半硫丸可能通過多靶點調控AMPK/PPARγ/GPAT3信號通路，在改善甲減合并脂質代謝紊亂中發揮重要作用。