黃龍病發(fā)病蘆柑根際土壤細(xì)菌群落組成與多樣性特征

雷美玲 饒文華 胡進(jìn)鋒 岳琪 吳祖建 范國成

（1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州 350002；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福州 350013）

柑橘黃龍病（citrus Huanglongbing,HLB）是一種由韌皮部桿菌（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）引起的細(xì)菌性病害，該細(xì)菌寄生在柑橘韌皮部。CLas 屬于α-變形菌綱、根瘤菌目、根瘤菌科、韌皮部桿菌屬。它主要感染蕓香科柑橘屬（Citrus L.）、枳屬（Poncirus Raf.）和金柑屬（Fortunella Swing）［1］。該病害具有傳播速度快、危害性大、潛伏期長等特點(diǎn)，難以通過化合物進(jìn)行有效的防治［2］。柑橘黃龍病主要是由宿主植物、環(huán)境、病原菌和柑橘木虱4 個(gè)主要因素相互作用而引起的。由于CLas無法進(jìn)行離體培養(yǎng)，研究難度大，導(dǎo)致對(duì)其的防治極其困難［3-4］。目前，一些研究通過使用納米藥劑來提高柑橘韌皮部對(duì)藥物的吸收效率，提高防治效果［5］。此外，還有研究使用石灰土壤pH 改良劑［6］、中微量營養(yǎng)元素［7］、抗氧化劑和赤霉素等方法來增強(qiáng)柑橘的抗病性。盡管這些措施具有一定的防治效果，尚無法從根本上解決問題。

有研究表明，柑橘黃龍病病原菌可以通過嫁接或木虱傳播到柑橘韌皮部，然后通過維管束運(yùn)輸?shù)礁涕俑坎⒎敝常瑢?dǎo)致根部受損。此外，根際的病原菌也會(huì)隨著韌皮部汁液流動(dòng)擴(kuò)散到柑橘的其他部位，并表現(xiàn)出典型的黃龍病癥狀，健康水平也會(huì)下降［8-10］。植物與保護(hù)性根際微生物群之間存在相互作用。研究表明，當(dāng)植物感染病原體后，會(huì)向根系發(fā)出信號(hào)，招募具有抗病和促進(jìn)生長作用的有益微生物，以調(diào)整根際微生物群的組成，最大程度提高后代在同一土壤中的生存機(jī)會(huì)［11］。根際微生物群對(duì)植物的健康起著積極作用，幫助植物從土壤中獲得所需的養(yǎng)分，并提供額外的宿主功能。它們通過各種生物化學(xué)機(jī)制實(shí)現(xiàn)互利共生，包括改變土壤肥力、提高植物抵御非生物和生物脅迫的能力，與植物病原體競(jìng)爭等［12-14］。根際微生物群落由豐富的核心成員（在至少95%的葉片或根樣本中檢測(cè)到）、一些地點(diǎn)特定性的代表性成員以及低豐度可變的微生物群組成。其組成和多樣性不僅與地理位置顯著相關(guān)，還與植物品種有關(guān)［15］。根際細(xì)菌群落與植物之間的相互作用是雙向的。研究表明，長刺蒺藜草（Cenchrus longispinus（Hack.）Fern.）入侵可以增加根際土壤中鏈霉菌屬、紅色桿菌屬和類諾卡氏菌屬微生物的豐度，從而影響根際土壤中的氮代謝過程［16］。CLas感染柑橘后會(huì)導(dǎo)致柑橘根際微生物群的重組，許多物種的豐度會(huì)下降，或者沒有被檢測(cè)到，或者被其他物種所取代。這種重組的菌群可以更好地耐受或適應(yīng)壓力條件［17-18］。

當(dāng)前的研究表明，患病和健康的柑橘植株在根際土壤細(xì)菌群落上存在差異，但對(duì)其與根際微生物群的相互作用尚未有深入研究。本研究通過對(duì)福建南平地區(qū)患有黃龍病和健康的蘆柑樹根際土壤細(xì)菌群落多樣性特征和組成的分析，探討顯著差異細(xì)菌的功能，并研究根際微生物群落結(jié)構(gòu)特征與柑橘黃龍病發(fā)病情況之間的關(guān)系。旨在為柑橘根際土壤微生物組調(diào)控方式提供理論基礎(chǔ)，為尋找綠色防治技術(shù)模式提供依據(jù)，促進(jìn)柑橘產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

葉片和根系樣品采集：本研究采集了福建省南平市順昌縣羅坑蘆柑園的紅壤土壤樣本，采樣日期為2022 年3 月8 日。該蘆柑園位于東經(jīng)117.8°，北緯27.0°，海拔170 m。根據(jù)蘆柑樹病癥情況和田間經(jīng)驗(yàn)，初步評(píng)估采集“健康”與“黃龍病”的蘆柑樹葉片與根際土壤樣品。為了確保采樣的均勻性和代表性，從每棵蘆柑植株東西南北4 個(gè)方向，分別采集5-10 片成熟葉片并混合。采集時(shí)，盡可能保證每棵樹上所采集的葉片在樹體上基本處于相同的位置。根際土壤采用五點(diǎn)采樣法來收集細(xì)根，且根系上附著土壤。共采集11 棵樹的葉片和根際土壤樣品，存放冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，葉片置于4℃冰箱，須根置于-80℃冰箱，以備后續(xù)試驗(yàn)。

根際土壤分離：將采集的蘆柑須根放入無菌管中，加入50 mL PBS 緩沖液，用無菌鑷子用力攪拌，以便從根表面分離根際土。移除根后，PBS 離心30 s，離心沉淀即為根際土，后續(xù)用于開展16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序?qū)嶒?yàn)。

試劑及儀器：植物DNA 試劑盒（杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司）、真空冷凍干燥機(jī)（LGJ-25D，北京四環(huán)起航科技有限公司）、球磨儀（MM 400，Retsch）、漩渦振蕩儀（MIX-25，杭州米歐儀器有限公司）、離心機(jī)（1-14，SIGMA）、電熱恒溫水浴鍋（DK-S26，常州高德儀器制造有限公司）、電子天平（2011F145-11，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）、超微量分光光度計(jì)（NanoDrop ONEc，Thermo Scientific NanoDrop Microvolume Instruments）、手掌型離心機(jī)（LX-100，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、q-PCR 儀（realplex4，Eppendorf）。

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)檢測(cè) 土壤pH 測(cè)定以水為浸提劑，采用電位法測(cè)定。全氮（TN）利用凱氏定氮法、連續(xù)流動(dòng)分析儀法和元素分析儀法測(cè)定，堿解氮（AN）采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定，速效鉀（AK）采用中性乙酸銨溶液浸提、火焰光度計(jì)法測(cè)定，有機(jī)質(zhì)（OM）采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測(cè)定，有效磷（AP）采用氟化銨-鹽酸溶液浸提酸性土壤、以鉬銻抗比色法測(cè)定［19］。

1.2.2 柑橘黃龍病病原菌檢測(cè) 采用無菌刀片取葉片中脈，并將其切碎成2-3 mm 的小段，置于無菌1.5 mL 離心管中，放入無菌鋼珠，用真空冷凍干燥機(jī)處理24 h，球磨儀研磨至粉末，運(yùn)用植物組織提取DNA 的試劑盒提取葉脈的總DNA，并使用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 濃度與質(zhì)量。利用qPCR 法檢測(cè)柑橘黃龍病菌，qPCR 反應(yīng)引物購自艾科瑞生物公司：上游引物5'-TCGAGCGCGTATGCAATACG-3'，下游引物5'-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3'，熒光探 針5'-（FAM）AGACGGGTGAGTAACGCG（BHQ-1）-3'。反應(yīng)體系為20 μL［引物F（5 μmol/L）、引物R（5 μmol/L）、Taq Man（2.5 μmol/L）和樣品各1 μL，2× Pro Taq HS Probe Premix 為10 μL，ddH2O 為6 μL］，反應(yīng)程序?yàn)?5.0℃預(yù)熱2 min；95.0℃ 10 s，58.0℃退火30 s，循環(huán)40 次。

根據(jù)qPCR 鑒定所采集的樣品的真實(shí)患病情況，選擇4 棵健康樹體作為健康組樣品，以及4 棵黃龍病樹體作為發(fā)病組樣品（qPCR 檢測(cè)結(jié)果見表 1，田間蘆柑植株和葉片情況見圖1）。每個(gè)樹體均進(jìn)行3次重復(fù)，以進(jìn)行微生物多樣性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

圖1 田間蘆柑植株和葉片F(xiàn)ig.1 Plant and leaf of C.reticulata in field

1.2.3 文庫構(gòu)建和測(cè)序 基于16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，抽提黃龍病發(fā)病蘆柑與健康蘆柑的根際土壤DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。在16S rRNA的338F/806R 區(qū)域，合成帶有barcode 的特異引物。每個(gè)樣本3 次重復(fù)，將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后，使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司）切膠回收PCR 產(chǎn)物，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，對(duì)PCR 產(chǎn)物定量與均一化，構(gòu)建PE2×300文庫，進(jìn)行Illumina 測(cè)序（委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成）。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 原始測(cè)序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，使用FLASH 軟件進(jìn)行拼接。使用Uparse（version 7.0.1090）對(duì)序列進(jìn)行OTU 聚類，根據(jù)97%相似度對(duì)序列進(jìn)行OUT 聚類，并在聚類過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva 數(shù)據(jù)庫（138），設(shè)置比對(duì)閾值為0.7。OTU 水平上，對(duì)發(fā)病組和健康組樣品進(jìn)行Alpha 多樣性分析，全面了解兩組樣本的物種多樣性及差異。門、科和屬水平上，通過Venn 圖比較發(fā)病組和健康組中的共有和特有細(xì)菌群落。門水平上，通過群落Pie 圖直觀展示樣本中微生物的存在情況和各微生物的相對(duì)豐度分布。隨后，屬水平上篩選出發(fā)病組和健康組（其中發(fā)病組為黃龍病發(fā)病蘆柑植株根際土壤樣品組，健康組為健康蘆柑植株根際土壤樣品組）中顯著差異的細(xì)菌物種。最后，通過分析環(huán)境因子與物種層級(jí)之間的關(guān)系，探討它們之間的相互影響，為深入理解微生物群落在發(fā)病過程中的作用提供重要線索。

表1 柑橘黃龍病病原菌qPCR 檢測(cè)結(jié)果Table 1 qPCR detection of citrus HLB pathogen

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有統(tǒng)計(jì)分析利用開源軟件R 3.3.1 完成。微生物群落的Alpha 多樣性通過mothur（version v.1.30.2）進(jìn)行指數(shù)分析，采用97%的OTU 相似水平作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，全面了解樣本內(nèi)的多樣性水平。為進(jìn)一步探索樣本之間的差異，采用Venn 圖分析，選取門、科和屬水平的樣本表，并借助R 語言（version 3.3.1）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和圖示處理。此外，基于tax_summary_a 文件夾中的數(shù)據(jù)表，利用R 語言繪制不同分組群落的餅圖，直觀展示了各類群的相對(duì)豐度分布情況。NMDS 分析beta 多樣性距離矩陣。利用R 語言中的vegan 軟件包（v2.4.3）進(jìn)行NMDS 分析和作圖，揭示樣本間的群落結(jié)構(gòu)差異。差異物種分析采用Student-t 檢驗(yàn)，對(duì)P 值不進(jìn)行校正，置信度設(shè)定為0.95。此外，運(yùn)用DP 方法計(jì)算影響大小，通過Welch t 檢驗(yàn)方法計(jì)算置信區(qū)間，使用R 語言的stats 包和python 的scipy 包（v1.0.0）進(jìn)行分析。最后，采用Spearman 等級(jí)相關(guān)系數(shù)計(jì)算環(huán)境因子與物種之間的關(guān)聯(lián)，將相關(guān)矩陣可視化為Heatmap 圖，利用R 語言中的pheatmap package 進(jìn)行展示。

2 結(jié)果

2.1 健康與黃龍病發(fā)病蘆柑植株根際土壤理化性質(zhì)

健康與黃龍病發(fā)病蘆柑植株根際土壤理化性質(zhì)結(jié)果顯示，蘆柑園土壤呈酸性土壤，而黃龍病發(fā)病蘆柑根際土壤的速效鉀（164 mg/kg）、有效磷（81.50 mg/kg）、全氮（0.225%）以及有機(jī)質(zhì)（38.7 g/kg）的含量低于健康蘆柑根際土壤（速效鉀：167 mg/kg，有效磷：82.20 mg/kg，全氮：0.233%，有機(jī)質(zhì)：40.9 g/kg），但pH 值（3.85）高于健康蘆柑根際土壤（pH 3.78），表明黃龍病發(fā)病蘆柑根際土壤的營養(yǎng)成分含量低于健康蘆柑根際土壤。

2.2 健康與黃龍病發(fā)病蘆柑植株根際土壤細(xì)菌群落的多樣性

經(jīng)Alpha 多樣性分析（圖2）發(fā)現(xiàn)，黃龍病發(fā)病蘆柑和健康蘆柑根際的coverage 值均超過98%，這表明測(cè)序數(shù)據(jù)的完整性較高，可用于進(jìn)一步的分析。黃龍病發(fā)病組的平均Chao 指數(shù)為1 404.12，而健康組的平均Chao 指數(shù)為1 265.33，表明黃龍病發(fā)病蘆柑根際土壤中的細(xì)菌豐富度高于健康樣本。此外，黃龍病發(fā)病蘆柑植株根際土壤的Shannon 指數(shù)為5.35；而健康植株根際土壤的Shannon 指數(shù)為5.28。表明黃龍病發(fā)病蘆柑植株根際土壤中的細(xì)菌多樣性與健康蘆柑植株的差異并不顯著，但整體上略高于健康蘆柑。

圖2 健康組與發(fā)病組在OTU 水平的Alpha 多樣性指數(shù)分析Fig.2 Alpha diversity index of healthy group and HLB group at the OTU level

2.3 健康與黃龍病發(fā)病蘆柑植株根際土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)

非度量多維尺度分析（NMDS）結(jié)果（圖3）顯示，stress 值為0.133，小于0.2，表明二維點(diǎn)圖具有一定的解釋意義。此外，P 值為0.002，小于0.05，并且R2值為0.119 2，說明兩個(gè)樣本點(diǎn)的分布存在一定的距離，且它們的物種組成之間存在顯著差異。

圖3 健康組與發(fā)病組在OTU 水平的非度量多維尺度分析Fig.3 NMDS analysis of healthy group and HLB group at the OTU level

2.4 健康與黃龍病發(fā)病蘆柑植株根際土壤細(xì)菌群落的組成

對(duì)健康和黃龍病發(fā)病蘆柑植株根際土壤中的細(xì)菌進(jìn)行OTU 聚類分析，共鑒定出2 601 個(gè)OTU，分屬27 個(gè)門、78 個(gè)綱、196 個(gè)目、327 個(gè)科、579 個(gè)屬和1 086 個(gè)種。通過圖4 可統(tǒng)計(jì)發(fā)病組和健康組樣品中細(xì)菌群落中特有和共有的物種，直觀展現(xiàn)了在門、科和屬的分類水平上，健康組和發(fā)病組樣本中細(xì)菌群落的組成情況。結(jié)果表明，健康組和發(fā)病組樣本中細(xì)菌群落的組成存在較大的差異。在門的水平上，健康組和黃龍病發(fā)病蘆柑根際共有23 個(gè)門，發(fā)病組有27 個(gè)門，其中4 個(gè)門是特有的，包括脫硫桿菌門（Desulfobacterota，占比0.003 6%）、鹽厭氧菌門（Halanaerobiaeota，占比0.002 7%）、纖維桿菌門（Fibrobacterota，占比0.002 1%）和彎曲桿菌門（Campilobacterota，占比0.001 8%），而健康組沒有獨(dú)有的門。在科的水平上，健康組和發(fā)病組共有283 個(gè)科，健康組有299 個(gè)科，其中16 個(gè)科是特有的，而發(fā)病組有311 個(gè)科，其中28 個(gè)科是特有的。在屬的水平上，健康組和發(fā)病組共有491 個(gè)屬，健康組有517 個(gè)屬，其中26 個(gè)屬是特有的，而發(fā)病組有553 個(gè)屬，其中62 個(gè)屬是特有的。

圖4 發(fā)病組與健康組樣品在門、科和屬水平上共有和獨(dú)有的物種情況圖Fig.4 Common and unique species of HLB group and healthy group at the phylum,family and genus level

發(fā)病組和健康組的細(xì)菌群落組成基本相同，但相對(duì)含量有所不同（圖5）。在門的水平上，健康組和發(fā)病組的細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)菌種主要包括酸桿菌門（Acidobacteriota）、厚壁菌 門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、變形菌 門（Proteobacteria）、WPS__2、浮霉菌 門（Planctomycetota）和擬桿菌門（Bacteroidota）。然而，在黃龍病發(fā)病蘆柑根際土壤中，酸桿菌門、變形菌門和擬桿菌門的相對(duì)含量明顯上升。其中，變形菌門的相對(duì)含量最高，達(dá)到29.24%。相比之下，健康植株的優(yōu)勢(shì)菌群屬于放線菌門，其相對(duì)含量為30.19%，明顯高于黃龍病發(fā)病蘆柑植株（26.35%）。

圖5 健康組（A）與發(fā)病組（B）細(xì)菌群落豐度在門水平上的相對(duì)豐度比較Fig.5 Comparison of bacterial community abundance at the phylum level between healthy group（A）and HLB group（B）

在屬水平上，發(fā)病組相對(duì)于健康組，芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、中根瘤菌屬（Mesorhizobium）的相對(duì)含量比健康組低（低0.002%-0.476%），銅菌屬（Cupriavidus）、細(xì)胞弧菌屬（Cellvibrio）、變異菌屬（Variovorax）的相對(duì)含量比健康組高（高0.002%-0.047%）（表2）。

表2 健康組與發(fā)病組柑橘根際部分細(xì)菌群在屬水平上的相對(duì)豐度比較Table 2 Comparative study on the relative abundance of rhizosphere part of the bacteria between healthy group and HLB group at the genus level

2.5 健康與黃龍病發(fā)病蘆柑植株根際土壤細(xì)菌群落的顯著性差異物種

在門水平上具有顯著差異的前15 個(gè)門中，F(xiàn)CPU426 門在兩個(gè)樣本之間存在極顯著差異（P ＜0.01），且發(fā)病組豐富度（0.046 1%）高于健康組（0.006 8%），其他門的差異不顯著（圖6-A）。在屬水平上具有顯著差異的前15 個(gè)屬中，發(fā)病組的豐度極顯著高于健康組的有薔薇屬（Roseiarcus）、norank_f_Xanthobacteraceae（黃桿菌 科）、norank_f_Acetobacteraceae（醋酸桿菌科），顯著高于健康組的有嗜酸性桿菌屬（Acidiphilium）、norank_f_SC-I-84、unclassified_f_Streptomycetaceae（鏈霉菌科）（P＜0.05），而發(fā)病組豐度極顯著低于健康組的有康奈斯氏桿菌屬（Conexibacter）、褚氏桿菌屬（Chujaibacter）、Jatrophihabitans、嗜酸菌屬（Acidipila）、Sporosarcina、Nitrolancea，顯著低于健康組的有FCPS473、norank_f_norank_o_IMCC26256、norank_f_JG30-KF-CM45（圖6-B）。

圖6 健康組與發(fā)病組細(xì)菌群落在門（A）、屬（B）水平相對(duì)豐度顯著差異分析Fig.6 Significant difference in relative abundance of bacteria at the phylum（A）and genus（B）level between healthy and HLB groups

2.6 健康與黃龍病發(fā)病蘆柑植株根際土壤細(xì)菌群落和環(huán)境因子之間的相關(guān)性

相關(guān)性熱圖結(jié)果（圖7）顯示，健康與黃龍病發(fā)病蘆柑植株的根際土壤微生物群落受到環(huán)境因子的影響。屬水平上，norank_f_Xanthobacteraceae、薔薇屬、norank_f_Acetobacteraceae、norank_f_SC-I-84、norank_f_norank_o_Subgroup_2、嗜酸性桿菌屬和unclassified_f_Streptomycetaceae 的相對(duì)豐度與速效鉀、有效磷以及有機(jī)質(zhì)的含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而與pH 值呈顯著正相關(guān)。與之相反，F(xiàn)CPS473、褚氏桿菌屬、嗜酸菌屬、Sporosarcina、康奈斯氏桿菌屬、Jatrophihabitans、Nitrolancea、norank_f_norank_o_IMCC26256、norank_f_Gemmataceae 和norank_f_JG30-KF-CM45 與速效鉀、有效磷以及有機(jī)質(zhì)呈顯著正相關(guān)，與pH 值呈顯著負(fù)相關(guān)。

圖7 屬水平健康與黃龍病發(fā)病蘆柑植株根際土壤細(xì)菌群落和環(huán)境因子之間的相關(guān)性Fig.7 Correlation between bacterial community and environmental factors in the rhizosphere soil of healthy and HLB-infected citrus plants at the genus level

3 討論

植物根際微生物與其根系分泌物相互作用，形成了復(fù)雜的根際生態(tài)系統(tǒng)以維持植物健康生長環(huán)境。根際微生物群對(duì)植物適應(yīng)生物和非生物脅迫具有重要調(diào)節(jié)作用［20］。根際細(xì)菌群落多樣性和穩(wěn)定性影響著土壤質(zhì)量、植物健康和生態(tài)系統(tǒng)能量流動(dòng)。病原體感染也會(huì)引發(fā)植物生理變化，對(duì)根際群落組成和功能產(chǎn)生不同影響［14,18］。本研究以擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)方法，系統(tǒng)分析了福建南平地區(qū)患有黃龍病和健康蘆柑樹的根際土壤細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)組成，探討顯著差異細(xì)菌的潛在功能，明確了根際微生物群落結(jié)構(gòu)特征與柑橘黃龍病發(fā)病情況間的關(guān)系，為通過土壤改良，調(diào)控柑橘根際土壤微生物組成的柑橘健身栽培提供理論基礎(chǔ)。

黃龍病發(fā)病與健康的蘆柑植株根際土壤微生物群落組成和多樣性存在顯著差異。黃龍病發(fā)病蘆柑的根際土壤細(xì)菌群落多樣性稍高于健康蘆柑，這與秦泰春等［21-23］的研究結(jié)果相似，表明黃龍病病菌可能會(huì)破壞蘆柑植株根際土壤細(xì)菌群落的生態(tài)平衡，導(dǎo)致某些細(xì)菌菌群的數(shù)量異常增加或減少。然而，在建立新的平衡之前，這種變化可能會(huì)持續(xù)存在。因此，需要進(jìn)一步研究來了解黃龍病病菌與根際土壤細(xì)菌群落之間的相互作用機(jī)制，以及其對(duì)長期的影響。研究結(jié)果表明，發(fā)病組與健康組的優(yōu)勢(shì)物種組成基本相同，但優(yōu)勢(shì)物種的相對(duì)含量存在差異。健康組中最主要的優(yōu)勢(shì)種屬于放線菌門，這些放線菌能夠產(chǎn)生廣泛的抗細(xì)菌、抗真菌和植物生長代謝物，有助于柑橘植株對(duì)抗黃龍病病原體和調(diào)節(jié)自身生長［24］。屬水平上，發(fā)病組的芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、慢生根瘤菌屬、伯克霍爾德菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和中根瘤菌屬的豐度較健康植株低。已有研究結(jié)果顯示，芽孢桿菌與根瘤菌的共同接種可以促進(jìn)維生素和植物激素的產(chǎn)生，進(jìn)而增加結(jié)瘤［25-26］。Bacillus sp.能夠促進(jìn)植物生長，并增加作物產(chǎn)量［27］。研究還指出伯克霍爾德菌屬、農(nóng)桿菌屬、慢生根瘤菌屬、銅菌屬、根瘤菌屬、假單胞菌屬、中根瘤菌屬、細(xì)胞弧菌屬、變異菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和副根瘤菌屬是柑橘根際的核心細(xì)菌群。其中，伯克霍爾德菌屬、假單胞菌屬、慢生根瘤菌屬和根瘤菌屬在不同環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)具有抑制植物病害的潛力，可作為潛在的益生菌［28-30］。

黃龍病會(huì)改變柑橘植株根際土壤理化特征，并影響有益細(xì)菌的相對(duì)豐度。黃龍病發(fā)病蘆柑植株的根際土壤含有較低的速效鉀、有效磷和有機(jī)質(zhì)，而pH 值變高，該結(jié)果與陳杰等［31］、段春梅等［32］的研究結(jié)果一致，可能是由于蘆柑植株在抵抗黃龍病菌侵害時(shí)需要消耗更多的能量，從而增加對(duì)土壤營養(yǎng)物質(zhì)的消耗。屬水平分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)病組9 種細(xì)菌（康奈斯氏桿菌屬、褚氏桿菌屬、Jatrophihabitans、嗜酸菌屬、Sporosarcina、Nitrolancea、FCPS473、norank_f_norank_o_IMCC26256、norank_f_JG30-KF-CM45）的豐富度低于健康組，并且存在顯著差異。這些細(xì)菌與速效鉀、有效磷以及有機(jī)質(zhì)呈顯著正相關(guān)。研究表明，康奈斯氏桿菌屬的相對(duì)豐度增加與植物生長正相關(guān)［33］，而其相對(duì)豐度的降低可能不利于植物成長。此外，褚氏桿菌屬在硫丹脅迫下可能降解有機(jī)氯農(nóng)藥林丹［34］。Jatrophihabitans sp.GAS493 在土壤中對(duì)非重氮類多糖進(jìn)行降解，具有潛在的功能［35］，其相對(duì)豐度的降低會(huì)導(dǎo)致土壤中潛在的有機(jī)質(zhì)分解減少。Nitrolancea 有的菌株是溫和條件下需氧的化石自營細(xì)菌，能將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，并以二氧化碳作為碳源［36］，其相對(duì)豐度的降低會(huì)導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)含量降低。另一方面，發(fā)病組的6 種細(xì)菌（薔薇屬、norank_f_Xanthobacteraceae、norank_f_Acetobacteraceae、嗜酸性桿菌屬、norank_f_SC-I-84、unclassified_f_Streptomycetaceae）的相對(duì)豐度與健康組相比具有顯著差異，且高于健康組，與速效鉀、有效磷以及有機(jī)質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)。研究表明醋酸桿菌科的一些菌株，如藥用內(nèi)桿菌（Endobacter medicaginis），可以促進(jìn)植物生長，具有固氮、植物激素合成、磷和鋅的增溶以及生物防治等特性［37-39］。薔薇屬在根際氮礦化中起著重要作用，參與營養(yǎng)礦化、生物控制和脅迫耐受等生理生化過程［40］。嗜酸性桿菌屬是一種嚴(yán)格的好氧、無機(jī)鹽自養(yǎng)細(xì)菌，能夠抵抗高濃度的鋅和鎳重金屬離子［41］，能利用鐵作為電子受體氧化有機(jī)化合物［42-44］，并具有CO2同化、甲烷代謝能力和氮源利用等水平轉(zhuǎn)移基因［45］，在根際環(huán)境中對(duì)植物生長和土壤健康起到重要的積極作用。另外，鏈霉菌科菌株JX02 和JX06 在土壤修復(fù)等方面發(fā)揮積極的作用［46］。上述研究結(jié)果表明，蘆柑感染黃龍病后，蘆柑樹體能夠招募具有促進(jìn)植物根際生長、固氮和利用氮源能力的細(xì)菌來增強(qiáng)對(duì)黃龍病的防御和控制能力。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)黃龍病菌侵染不僅對(duì)蘆柑植株根際土壤細(xì)菌群物種組成和相對(duì)豐度變化產(chǎn)生顯著影響，還導(dǎo)致蘆柑植株根際土壤pH 值升高，速效鉀和有效磷等土壤理化指標(biāo)降低，從而降低康奈斯氏桿菌屬和褚氏桿菌屬等有益細(xì)菌的相對(duì)豐度。黃龍病發(fā)病蘆柑植株能夠吸引薔薇屬和嗜酸性桿菌屬等有益細(xì)菌，以對(duì)抗病原微生物侵害。

致謝

感謝福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源環(huán)境與土壤肥料研究所劉國紅副研究員在試驗(yàn)設(shè)計(jì)與論文寫作方面提供的幫助。