嗜熱毀絲菌裂解性多糖單加氧酶TtLPMO9I 的酶學性質及其功能研究

鄭菲 楊俊釗 牛羽豐 李蕊麟 趙國柱

（北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083）

纖維素能夠轉化為可發酵的糖類，生產出具有重要應用價值的工業產品，這對于解決當今世界面臨的環境污染、糧食短缺、飼料資源緊張和能源危機等問題都具有重要的現實意義［1］。傳統的纖維素降解酶系能夠有效的將木質纖維素資源轉化為小分子糖類，因此得到了廣泛應用。近年來，研究人員不斷挖掘出一些新型的木質纖維素降解輔助酶（auxiliary activities,AA），包括漆酶、過氧化物酶、纖維二糖脫氫酶等［2］。其中，裂解性多糖單加氧酶（lytic polysaccharide monooxygenase，LPMO）是一種氧化裂解酶，可通過氧化裂解的方式破壞纖維素的結構，在纖維素的高效酶解中發揮重要作用［3］。

LPMO 屬于銅離子依賴型單加氧酶，通過破壞纖維素、幾丁質等多糖的結晶表面，輔助糖苷水解酶對底物的催化，在工業生物質轉化過程中具有較高的應用潛力［4］。隨著對LPMO 酶資源的挖掘和對催化機制的深入研究，目前LPMO 被歸類于CAZy 數據庫中的輔助活性蛋白家族AA9-AA11以 及AA13-AA17［5-9］。其 中，真菌源 的LPMO 主要分布在AA9 家族，即LPMO9，具有高活性和廣泛的底物譜［8］。例如，來源于梭孢殼屬（Thielavia australiensis）的TausLPMO9B 和H2O2共同降解磷酸膨脹纖維素時，促進了底物的裂解［10］；來源于黏褶菌屬（Gloeophyllum trabeum）的GtLPMO9S 對纖維素、羧甲基纖維素、木葡聚糖等具有較高活性［11］。此外，LPMO 作為輔助活性蛋白，大多都與糖苷水解酶表現出一定的協同作用效果。例如，Agrawal等［12］用來源于曲霉屬（Aspergillus terreus 9DR）的LPMO（PMO_08942、PMO_07920）對甘蔗渣/稻草進行預處理可顯著提高纖維素酶的糖化率；Müller等［13］將商業纖維素酶與15%的LPMO（TaLPMO9A）混合后，葡萄糖產量提高了31%。

研究發現，LPMO 的催化機制相對比較復雜，在還原劑，如抗壞血酸、還原性谷胱甘肽等和銅離子存在的情況下，從底物糖環上的1 位碳或4 位碳上奪取一個氫原子，同時反向摻入一個氧原子，在水分子的參與下可將底物轉變為糖醛酸或二元醇［14-15］。因此，根據生成底物類型可以初步將LPMO 分 為C1 催化酶、C4 催化酶或是C1 和C4共催化酶3 種類型。此外，近期研究還發現部分LPMO 可以氧 化C6 位，但并不 裂解糖苷鍵［16］。LPMO9 的結構具有高度的保守性，其催化結構由β三明治結構組成，一般包含8-10 個由loop 結構相連的β 折疊［17］。活性位點呈平面結構，活性中心的銅離子由平面中兩個保守的組氨酸殘基共同穩定，形成組氨酸支架［4］。此外，結合平面附近的芳香族殘基對底物的裂解方式具有選擇性。例如，Danneels等［18］將來源于紅褐肉座菌（Hypocrea jecorina）的LPMO9A 與底物結合平面的芳香族氨基酸殘基Y211突變成丙氨酸后，C4 氧化能力增強，C1 氧化能力減弱。

嗜熱毀絲菌（Thermothelomyces thermophilus）具有強效降解纖維素的能力，其基因組中除編碼多個糖苷水解酶外，還存在大量的LPMO9，目前，僅有少數幾個功能被鑒定［19-25］，需進一步加深對LPMO9性質及協同效率的研究。本文以嗜熱毀絲菌為出發菌株，系統地分析其基因組編碼的LPMO9 序列的多樣性，篩選出功能未鑒定的LPMO9 序列并進行異源表達，對重組蛋白的功能進行探究，獲得新型、高效的LPMO9。此外，本研究還探究了LPMO9 與商品化纖維素酶之間的協同作用效果，為高效降解纖維素提供新的策略，對提高生物質轉化效率具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因和菌株 Ttlpmo9i 基因編碼序列由北京睿博興科生物技術有限公司合成；用于目的基因克隆的大腸桿菌感受態細胞Trans1-T1 購自北京全式金生物技術有限公司；用于構建表達載體的質粒和外源基因表達的pPIC9 和畢赤酵母GS115 購自美國Invitrogen 生命技術有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 無縫克隆與重組試劑盒、快速凝膠提取試劑盒、PCR 聚合酶2×TransStart?FastPfu Fly PCR SuperMix（-dye），限制性 內切酶FlyCut?Bgl II,FlyCut?EcoR I,和FlyCut?Not I 均購自北京全式金生物技術有限公司；質粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉購自賽默飛世爾科技公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）和微晶纖維素購自Sigma-Aldrich；瓊脂糖購自Biowest 公司、YNB 購自北京蘭博利德生物技術有限公司。不同量程的移液器購自艾本德公司；PCR 儀、核酸電泳儀、蛋白電泳儀、凝膠成像儀均購自伯樂生命醫學產品有限公司；培養箱購自上海一恒科學儀器有限公司；分子過濾膜包購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；M200 PRO 多功能酶標儀購自帝肯Tecan 上海貿易有限公司；?KTA Pure蛋白純化儀購自思拓凡Cytiva。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 在CAZy（http://www.cazy.org/）和NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中獲取LPMO 的序列信息；使用在線網站ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）對蛋白的理論分子量、等電點進行分析；使用在線網 站SignalP 6.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）對蛋白的信號肽進行預測；使用在線網站NetOGlyc 4.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0）預測蛋白O-糖基化位點；利用BLASTp（Basic Local Alignment Search Tool protein）對蛋白序列進行同源性分析；利用MEGA11 將LPMO9 已解析出晶體結構的C1 催化酶：TtGH61E（Thermothielavioides terrestris，PDB ID：3EII）、PcLPMO9D（Phanerochaete chrysosporium，PDB ID：4B5Q）；C4 催化酶：NcLPMO9C（Neurospora crassa，PDB ID：4D7U）、NcLPMO9D（N.crassa，PDB ID：4EIR）；C1/4 催化酶：TaLPMO9A（Thermoascus aurantiacus，PDB ID：2YET）、NcLPMO9M（N.crassa，PDB ID：4EIS）蛋白氨基酸序列與嗜熱毀絲菌LPMO9 蛋白進行多序列比對并構建系統發育樹；利用Smart 在線網站（http://smart.embl-heidelberg.de/）對蛋白質的結構域進行預測；利用SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/），以來源于大麗輪枝菌（Verticillium dahlia）的A0A2J8EXP9 為模板對蛋白質進行同源建模，將TtLPMO9I 序列相似度為67.11%的NcLPMO9C 中的銅疊加到TtLPMO9I蛋白模型上。LPMO 的命名參考Berka 等［26］的報道。Pymol（https://pymol.org/2/）用于模型結構的可視化和制圖。

1.2.2 基因的克隆 將去除信號肽后的TtLpmo9i 編碼基因重組至pPIC9 表達質粒的EcoR I/Not I 克隆位點處，然后轉化到大腸桿菌Trans1-T1 細胞中。利用3'AOX 和5'AOX 通用引物進行菌落PCR，驗證陽性克隆子并測序。將測序正確的陽性克隆子轉接到LB培養基（體積質量分數為0.5%酵母浸粉，1%胰蛋白胨，1%氯化鈉）中，37℃過夜培養后提取重組質粒pPIC9-Ttlpmo9i。

1.2.3 蛋白的表達與純化 用限制性內切酶Bgl Ⅱ線性化處理重組質粒pPIC9-Ttlpmo9i，通過電擊轉化至畢赤酵母感受態細胞，涂布在固體MD 培養基（體積質量分數為1.5%瓊脂糖，2%葡萄糖，滅菌后加入體積質量分數為1.34% YNB，4×10-5%生物素）上。30℃倒置培養48 h 后，在MD 培養基中挑選24個單克隆，培養在3 mL BMGY（體積質量分數為0.5%酵母粉，1%胰蛋白胨，體積分數為0.5%甘油，經121℃高溫滅菌20 min 后加入體積質量分數為1.34%YNB，4×10-5%生物素）培養基中。在30℃，200 r/min 條件下培養48 h 后，收集細胞并重新懸浮于1 mL 的BMMY（體積質量分數為0.5%酵母粉，1%胰蛋白胨，經121℃高溫滅菌20 min 后加入體積質量分數為1.34% YNB，4×10-5%生物素，體積分數0.5% 甲醇）誘導培養基中。在30℃，200 r/min 條件下誘導表達72 h 后，以12 000 r/min 離心10 min收集上清液，并通過基質輔助激光解吸飛行時間質譜儀（MALDI-TOF）和SDS-PAGE 篩選出重組蛋白。將篩選出陽性克隆子接種至30 mL YPD 液體培養基（體積質量分數為1%酵母浸粉，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖）中，30℃，200 r/min 培養48 h 后，以體積分數 0.5%的接種量接種至400 mL BMGY 液體培養基中。30℃，200 r/min 培養48 h 后，收集菌體轉移至200 mL BMMY 誘導培養基中，繼續誘導培養48 h，每隔24 h 補加一次甲醇（體積分數0.5%）。48 h 后收集上清液，利用10 kD 膜包濃縮至15 mL 體積后進行脫鹽處理。然后加入到平衡后的HiTrap QXL 陰離子交換層析柱中，在10 mmol/L 的pH 8.0 的Tris-Hcl 緩沖液中，使用0-1 mol/L NaCl 進行線性梯度洗脫，收集相應的峰所對應的蛋白并進行酶活性的測定和SDS-PAGE 分析。

1.2.4 酶活力的測定 將含有體積質量分數1%CMC-Na、3 μmol/L 酶液、1 mmol/L 抗壞血酸和0.1 mmol/L CuSO4的反應體系在特定條件下培養6 h，后采用DNS 法檢測反應過程中還原糖的釋放量來測定LPMO 的活性。以葡萄糖為標準建立校正曲線。酶活定義為：在酶的最適條件下，每分鐘產生1 μmol還原糖所需的酶量為1 個單位（U）。

1.2.5 酶學性質分析

1.2.5.1 不同濃度抗壞血酸對酶活性的影響 以10 mg/mL CMC-Na 為底物，取3 μmol/L TtLPMO9I，0.1 mmol/L CuSO4，以不同濃度抗壞血酸（0、0.1、1、10 mmol/L）在50℃，pH 5.0 的條件下處理12 h。在各濃度抗壞血酸反應體系中，以沸水浴10 min 滅活后的TtLPMO9I 作為實驗對照，每組3 次重復，計算不同濃度抗壞血酸條件下還原糖的產生量并繪制柱形圖。

1.2.5.2 最適溫度和溫度穩定性的測定 在不同溫度（40-80℃）和酶的最佳pH 值下確定酶的最適溫度。將最大酶活值設定為100%，計算相對酶活。取3 μmol/L 酶分別在60℃、70℃和80℃下處理4 h、8 h 和12 h，在最佳條件下測定剩余酶活力。未處理酶液的初始酶活定義為100%，計算各時間點和溫度點下的相對酶活值并繪制溫度穩定性趨勢圖。

1.2.5.3 最適pH 及pH 穩定性的測定 在不同pH值（pH 3.0-7.0：100 mmol/L 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；pH 8.0-9.0：100 mmol/L Tris-HCl 緩沖液；pH 10.0：甘氨酸-NaOH）和酶的最佳溫度下測定酶的最適pH 值。將最大酶活值設定為100%，計算相對酶活，繪制最適pH 趨勢圖。將酶在pH 6.0-8.0、37℃條件下孵育4、8、12 h 后，在最佳條件下測定剩余酶活性。以初始酶活定義為100%，計算各時間點和pH 條件下的相對酶活值并繪制pH 穩定性趨勢圖。

1.2.6 TtLPMO9I 與商業酶的協同作用 分別以20 mg/mL 預處理玉米秸稈、10 mg/mL 微晶纖維素為底物，將50、100、200 μg TtLPMO9I 在50℃、pH 5.0的條件下與適當稀釋的商業酶（Novozymes 188）分別對預處理玉米秸稈、微晶纖維素進行協同酶解，反應時間為12 和24 h。以單獨添加各濃度TtLPMO9I 和單獨添加纖維素酶的反應作為對照。將反應后的體系進行離心，取上清液，采用DNS 法測定還原糖含量，并計算TtLPMO9I 與商業酶作用的還原糖增長率與協同度。

預處理玉米秸稈的制備：取10 g 玉米秸稈，用100 mL 1%（W/V）NaOH 溶液在121℃下處理1 h；用蒸餾水洗滌至中性，并通過120 目濾網過濾收集；在烘箱中干燥24 h 備用。

2 結果

2.1 生物信息學分析

從CAZy 數據庫中獲得嗜熱毀絲菌基因組序列，分析編碼LPMO9 的22 個蛋白氨基酸序列（表1）。結果顯示，這些氨基酸數目和相對分子質量分別在151-444 aa 和16.2-46.6 kD 之間。對蛋白結構域進行分析顯示，僅有4 個LPMO（LPMO9B、AEO54509.1、MtLPMO9、LPMO9I）在催化結構域的C 端存在一個碳水化合物結合結構域（CBM）。圖1為該菌株LPMO9 家族成員與同家族已解析出晶體結構的LPMO 系統發育樹結果圖，由圖可知，按照底物切割方式可分為3 類，大部分集中在C1/C4 催化酶的分類中。

圖1 嗜熱毀絲菌AA9 家族LPMO 蛋白系統發育樹分析Fig.1 Phylogenetic tree of LPMO proteins in the AA9 family of T.thermophilus

表1 嗜熱毀絲菌AA9 家族LPMO 蛋白性質預測Table 1 Protein property prediction of the LPMO AA9 family from T.thermophilus

本研究的核心材料TtLPMO9I（GenBank Accession No.: AEO56416.1）核苷酸序列全長為921 bp，編碼了306 個氨基酸，前15 個氨基酸為信號肽序列，去除信號肽后的成熟蛋白理論分子量為29.9 kD，等電點為5.81。多序列比對結果顯示（圖2-A），TtLPMO9I 包含了大多數LPMO9 的保守氨基酸殘基，如H1、H84、H156、G163、Q165、Y167、Y205。其中，H1 和H84，Y167 是主要的銅離子結合位點，構成TtLPMO9I 的活性中心。

圖2-B 為SWISS-MODEL 同源建模得到的TtLPMO9I 模擬結構。預測結果表明，TtLPMO9I 為雙結構域蛋白，包含一個由226 個殘基組成的催化結構域（H1-I226），在蛋白C 端存在一個由34 個氨基酸殘基組成的CBM1（P258-P291）。TtLPMO9I 的催化結構域具有8 個β 折疊片，形成β 三明治結構。前組由β1、β3、β6 組成，另一組由β4、β7、β8 組成。β2 參與兩組β 折疊的形成，每個β 折疊片相互疊加、包裹形成蛋白質的核心。CBM1 結構域則由β9和β10 與連接兩個折疊片的loop 區構成。TtLPMO9I的活性位點呈平面結構，銅離子與H1（3.0 ?）和H84（2.2 ?）的側鏈和H1 的氨基末端的氮原子（3.5 ?）相連形成一個“T 型”結構的組氨酸支架，并且兩個組氨酸與Y167 的側鏈酚基（2.8 ?）與銅離子之間的相互作用，共同穩固了銅離子，對底物的催化具有重要作用。在催化結構域中，有3 個loop 區（L2 loop：L17-I50；LS loop：G115-G131；LC loop：G177-I226）共同參與形成TtLPMO9I 的催化平面，其中，LS loop 中的G119 與LC loop 中的G214-G215之間可形成疏水作用，維持蛋白的穩定。

2.2 TtLPMO9I的表達和純化

SDS-PAGE 結果（圖3-A）顯示，TtLPMO9I 的表觀分子量大于其理論分子量（TtLPMO9I：31.4 kD）。經網站預測，其包含3 個O 糖基化位點（S227、S229、S231），均位于兩個結構域之間的連接區。這可能是造成表觀分子量大于理論分子量的原因之一。為進一步確認表達的蛋白是否為目的蛋白，將表達純化的TtLPMO9I 通過MALDI-TOF 進行質譜分析（圖3-B）。如圖所示，共有8 段肽段序列與目標蛋白的理論序列匹配，蛋白序列的覆蓋度為24.4%，因此能夠確定純化后的蛋白即為目的蛋白，可將該蛋白進行后續的研究。

圖3 重組蛋白TtLPMO9I 的驗證Fig.3 Validation of the recombinant protein TtLPMO9I

2.3 TtLPMO9I酶學性質分析

2.3.1 不同濃度抗壞血酸對TtLPMO9I 活性影響 由于LPMO 通過氧化裂解的方式作用于纖維素底物，在加入抗壞血酸、還原性谷胱甘肽等還原劑的條件下可顯著提高反應效率。由圖4 可知，當抗壞血酸終濃度為1 mmol/L 時，TtLPMO9I 的還原糖產生量達到最高值（579 ± 9）mg/L，較不加抗壞血酸時增加84%，顯著提高了TtLPMO9I 的催化活性。

圖4 抗壞血酸對TtLPMO9I 酶活性的影響Fig.4 Effect of ascorbic acid concentration on the enzyme activity of TtLPMO9I

2.3.2 最適溫度及溫度穩定性分析 在pH 5.0 條件下測定TtLPMO9I 在不同溫度（40-80℃）下的酶活力，由圖5-A 可知，TtLPMO9I 的最適溫度為60℃，在50-70℃之間的酶活力均在80%以上，對溫度的耐受性較好。將TtLPMO9I 分別在60-80℃下分別孵育4、8、12 h，檢測其剩余酶活力（圖5-B）。結果表明，TtLPMO9I 在60℃條件下孵育4、8、12 h 后，其剩余酶活隨孵育時間延長逐漸降低，處理12 h 后剩余酶活為54%。TtLPMO9I 在70℃孵育8 h、80℃孵育4 h 條件下，其剩余酶活降為0。

圖5 TtLPMO9I 的酶學性質Fig.5 Enzymatic properties of TtLPMO9I

2.3.3 最適pH 及pH 穩定性分析 在pH 3.0-10.0范圍內 測定最 適pH 值（圖5-C）。TtLPMO9I 在pH 5.0 達到酶活最高值，在pH 5.0-9.0 相對酶活均保持在80%以上，說明其對pH 耐受性的范圍較廣。此外，TtLPMO9I 在pH 6.0-8.0 條件下孵育12 h 后，其相對酶活均在80%以上，表明TtLPMO9I 具有良好的pH 穩定性（圖5-D）。

2.4 TtLPMO9I與纖維素酶在反應中的協同效應

由圖6-A-B 的結果圖顯示，添加不同量的TtLPMO9I 后，與纖維素酶協同降解玉米秸稈所產生的還原糖增加了34%-142%，根據1.2.6 協同度計算公式得到協同度在1.14-2.10 之間。當以玉米秸稈為底物時，在反應體系中分別添加50、100、200 μg的TtLPMO9I 和100 μL 稀釋后的纖維素酶，反應12 h 后體系中的還原糖含量與未添加TtLPMO9I 相比分別增加了34%、70%、99%，協同度為1.14、1.36、1.51。反應24 h 后協同產糖量較未添加TtLPMO9I 增加了45%、102%、142%，協同度分別為1.20、1.73、2.10。由以上數據可知，在降解玉米秸稈過程中，還原糖產量和協同度隨反應時間及TtLPMO9I 濃度的增加而增加。在纖維素酶中添加200 μg TtLPMO9I 反應24 h，還原糖增加量和協同度達到最大值。

圖6 TtLPMO9I 與纖維素酶（Novozymes 188）降解玉米秸稈、微晶纖維素的協同反應Fig.6 Synergistic reaction between TtLPMO9I and cellulase（Novozymes 188）for the degradation of pretreated corn straw and Avicel

此外，在降解微晶纖維素的過程中，TtLPMO9I與纖維素酶也表現出協同作用效果，但還原糖的增加量與協同度均低于玉米秸稈，分別為6%-46%和0.92-1.24（圖6-C-D）。在反應體系中分別添加50、100、200 μg 的TtLPMO9I 和100 μL 稀釋后的纖維素酶，反應12 h 后還原糖含量較未添加TtLPMO9I 增加了11%、38%、46%，協同度為0.92、1.20、1.24。反應24 h 后，較未添加TtLPMO9I 的還原糖增加量分別為6%、15%、18%，協同度為0.96、1.04、1.05。

3 討論

LPMO9 分布廣泛，大多數來源于真菌，如在構巢曲霉（Aspergillus nidulans）基因組中編碼9 個LPMO9 基因［27］；柄孢霉（Podospora anserina）基因組中編碼33 個LPMO9 基因［28］；粗糙脈孢霉（Neurospora crassa）基因組中編碼14 個LPMO9 基因［29］，這些真菌均具有良好的木質纖維素降解能力，因此，推測LPMO 在降解木質纖維素過程中扮演著重要角色。嗜熱毀絲菌基因組中也編碼了大量的木質纖維素降解酶基因，是潛在的高效中高溫酶庫［26］。測序結果顯示，嗜熱毀絲菌基因組中共編碼22 個LPMO9 蛋白的基因［26］，目前，僅有7 個被報道［19-25］。本研究基于已報道的嗜熱毀絲菌基因組序列，挖掘其中未鑒定的TtLPMO9I，探究其功能，豐富LPMO9 酶資源庫。此外，選擇工業應用中常見的商業纖維素酶與TtLPMO9I 進行協同作用，探究協同作用效果，優化酶資源的復配方案，從而提高生物質的轉化效率。

生物信息學分析表明，TtLPMO9I 是一類雙結構域的LPMO，在催化結構域的C 端包含了一個CBM1結構域。研究發現，大約30%的LPMO 含有非催化性的CBM［30］，CBM 在結合纖維素底物并增強催化效率方面具有重要作用［31］。通常，雙模塊LPMO9的催化結構域在N 端，因為N 末端的組氨酸可與銅結合，對活性至關重要，C 端含有第一家族非催化性CBM，可與纖維素中的結晶區結合［32］。Agrawal等［12］通過比較單結構域LPMO 和含有CBM1 的雙結構域LPMO 的酶學性質發現，雙結構域的LPMO有更加廣泛的底物譜，其對纖維素和木聚糖均表現出明顯的活性。綜上所述，CBM 的存在可以加強LPMO 和底物的結合能力，有利于增加可溶性產物的釋放。

酶學性質結果顯示，純化的TtLPMO9I 蛋白在60℃，pH 5.0 時具有最高活性，在pH 5.0-9.0 范圍內活性在80%以上，這與大多數LPMO9 性質相似，均在50-60℃和pH 4.0-6.0 的范圍內表現出較高的酶活性［12,33-34］。此外，TtLPMO9I 具有良好的熱穩定性，在60℃條件下處理12 h，剩余酶活為54%。然而，在相同溫度條件下，來源于灰霉菌的flLPMO處理20 min，酶活完全喪失［35］；來源于黃孢原毛平革菌的PMO_08942 和PMO_07920 最適溫度均為50℃，溫度升高催化活性急劇下降［12］。綜上，TtLPMO9I可以長時間抵抗高溫環境，具有商業應用的潛力。

LPMO 是一類新型的木質纖維素降解輔助酶，通過氧化作用裂解糖苷鍵，使木質纖維素的結構更加松散，有利于糖苷水解酶降解底物，達到協同效果。例如Dimarogona 等［36］證明LPMO StCel61a 和纖維素酶Celluclast 的比例為1∶2 時，對云杉的降解效率提高了42%；Bulakhov 等［37］將3 種LPMO9 分別與纖維素酶進行協同降解微晶纖維素底物，與纖維素酶單獨降解相比，協同作用后的還原糖產量提高了17%-31%；Li 等［34］將PdLPMO9A 與纖維素酶共同作用在玉米秸稈上，還原糖產量比PdLPMO9A與纖維素酶單獨降解產生還原糖量高29.9%。本研究中，TtLPMO9I 促進纖維素降解效果較為顯著。當200 μg TtLPMO9I 添加到商業酶中處理玉米秸稈，產糖效率和協同度隨反應時間的增加而增加，反應24 h 后，產糖量較未添加時增加142%，其協同作用效果較其他材料具有突出的優勢。此外，Harris 等［38］發現，GH61 蛋白（現已歸類于LPMO）對纖維素酶活性的促進作用僅發生在木質纖維素底物上，而不是純纖維素底物。有研究報道，LPMO 發揮功能需要電子供體，除可以外加抗壞血酸等還原劑外，底物中的木質素也可以提供電子，并且激活LPMO 的能力與木質素預處理的水平有關［39］。本研究以玉米秸稈為底物時，TtLPMO9I 與纖維素酶的最大協同度達到2.10，而以純纖維素類底物—微晶纖維素為底物時，最大協同度僅為1.24。由此推測，TtLPMO9I與纖維素酶的協同效果可能與底物的組成有關。

4 結論

本研究從嗜熱毀絲菌基因組中獲得了一個新型的氧化裂解酶TtLPMO9I 的編碼基因并成功進行了異源表達。酶學性質檢測發現TtLPMO9I 的pH 穩定性和溫度穩定性較好，并且與纖維素酶表現出良好的協同作用效果，顯著提高還原糖的產生量。本研究豐富了AA9 家族LPMO 的酶資源庫，可以為木質纖維素的高效降解提供新的材料。