高效液相色譜法測(cè)定試驗(yàn)雞肉中水飛薊賓含量

侯澤樺，李羨鈺，孫雯可，謝艾伶，劉全瑞，劉鼎闊，于曉雪 ，李留安

（1.天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392；2.鼎正新興生物技術(shù)（天津）有限公司 天津市生物飼料添加劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300383）

水飛薊賓（silybin，SLB）是菊科植物水飛薊果實(shí)提取物的主要生物活性物質(zhì)，是天然的黃酮木質(zhì)素類(lèi)化合物[1]，其已有上千年的藥用歷史。研究表明，水飛薊賓具有保肝、抗腫瘤、抗炎、抗代謝功能失調(diào)等多種生物活性功能[2-3]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。雞肉具有低脂肪、高蛋白的特點(diǎn)，是國(guó)民膳食中肉類(lèi)的重要組成部分。功能性食品是指具有特定營(yíng)養(yǎng)保健功能的食品，即具有調(diào)節(jié)機(jī)體功能、不以治療為目的的食品。功能性食品形式多種多樣，如飲料、沖劑、烘焙制品等[4]，雞肉也可作為功能性食品的一種。檢測(cè)功能性食品中活性物質(zhì)含量對(duì)于保證營(yíng)養(yǎng)供給和品質(zhì)檢測(cè)是非常必要的。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于水飛薊賓含量的測(cè)定研究多集中在植物提取、醫(yī)藥等方面。石萬(wàn)銀等[5]利用高效液相色譜法測(cè)定得到水飛薊提取物中水飛薊賓的含量不低于20%。周旖璇等[6]通過(guò)建立高效液相色譜法測(cè)定大鼠血漿中水飛薊賓的含量，測(cè)得水飛薊賓在大鼠體內(nèi)的消除半衰期為（9.9±0.9）h。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于動(dòng)物產(chǎn)品中水飛薊賓含量檢測(cè)方法未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)在雞基礎(chǔ)飼糧中添加水飛薊賓，獲得富含水飛薊賓的雞肉，并建立高效液相色譜法檢測(cè)試驗(yàn)雞肉中水飛薊賓含量的方法，以期為后續(xù)開(kāi)發(fā)含水飛薊賓的功能性雞肉及其有效含量檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)雞肉樣品：天津農(nóng)學(xué)院實(shí)訓(xùn)基地。將135 只雞隨機(jī)分為3 組，每組45 只。第1 組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)飼料；第2 組在基礎(chǔ)日糧中添加0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的水飛薊賓；第3 組在基礎(chǔ)日糧中添加1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的水飛薊賓。30 d 后每組隨機(jī)抽取10 只雞進(jìn)行屠宰采集雞肉，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

水飛薊素（純度≥98%）：陜西云奇生物科技有限公司；水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)品（純度95.7%）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純）：德國(guó)Merck 公司；乙酸乙酯（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（1260）：安捷倫科技有限公司；超聲波清洗機(jī)（SB-100D）：寧波新芝生物科技股份有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA RV 10）：上海予申儀器有限公司；多用途渦旋混合器（VORTEX-6）：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；電子分析天平（FB223）：上海舜寧恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件的優(yōu)化

參照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 版一部[7]中水飛薊賓含量測(cè)定方法的高效液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。色譜柱：Agilent-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為水∶甲醇= 43∶57、47∶53、53∶47（體積比）；流速：0.65、0.70 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：288 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)品20 mg 于50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到400 μg/mL 水飛薊賓溶液，取400 μg/mL 水飛薊賓溶液250 μL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻放置備用，所得水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為10 μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：依次吸取0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 mL 水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到系列濃度為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL的水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將配制好的0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液參照1.3.1 的液相色譜條件進(jìn)行分析，以水飛薊賓的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到水飛薊賓的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程。

1.3.4 精密度測(cè)定

用1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，重復(fù)測(cè)定6 次，計(jì)算精密度。

1.3.5 樣品前處理

稱(chēng)10 g 雞肉樣品剪碎置于50 mL 離心管中，加入20 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻，超聲30 min，以10 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)濾紙過(guò)濾置于圓底燒瓶中，90 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，2 mL 甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，待高效液相色譜儀檢測(cè)。

1.3.6 回收率測(cè)定

精密稱(chēng)取10 g 空白雞肉樣品9 份，將濃度為0.5、1.0、2.5 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別加入樣品中，每個(gè)濃度3 份，每份加1 mL，按1.3.5 方法進(jìn)行處理，測(cè)得峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，算出實(shí)際濃度，計(jì)算回收率。

1.3.7 雞肉樣品測(cè)定

按照1.3.5 方法對(duì)試驗(yàn)雞肉樣品進(jìn)行處理，按照1.3.1 色譜條件進(jìn)行測(cè)定。樣品中的水飛薊賓含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行換算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因子方差分析（one-way analysis of variance，One-way ANOVA），并采用Duncan法進(jìn)行多重比較，進(jìn)行組間顯著性分析，P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

色譜基本條件的優(yōu)化見(jiàn)表1。

由表1 可知，有機(jī)相比例越大，保留時(shí)間越短，在水飛薊賓A、B 兩峰分離完全的前提下，當(dāng)水與甲醇體積比為47∶53 時(shí)，保留時(shí)間最短。當(dāng)流速提高到0.70 mL/min，由于柱壓過(guò)大，檢測(cè)程序終止。為使兩峰完全分離，準(zhǔn)確定量檢測(cè)水飛薊賓，最終選用色譜條件為水∶甲醇=47∶53（體積比），流速0.65 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of silybin

由圖1 可知，水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=95.16x-0.875 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，表明水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.1~5.0 μg/mL 時(shí)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3 檢出限和定量限

以峰高為3 倍平均信噪比時(shí)的濃度為檢出限（limit of detection，LOD），以峰高為10 倍平均信噪比時(shí)的濃度為定量限（limit of quantitation，LOQ），計(jì)算得本方法的LOD 和LOQ 分別為0.022 μg/g 和0.073 μg/g。

2.4 精密度測(cè)定

精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Precision test results

由表2 可知，此方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為2.89%，表明精密度良好。

2.5 回收率測(cè)定

樣品加標(biāo)回收率如表3 所示。

表3 樣品加標(biāo)回收率Table 3 Recovery rate of samples with added standard substance

由表3 可知，水飛薊賓的平均回收率在88.45%~104.34% 之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最大為2.94%。該結(jié)果表明，本檢測(cè)方法具有良好的回收率。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)品和雞肉樣品色譜圖

水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)品和試驗(yàn)樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard substance and sample

由圖2 可知，試驗(yàn)雞肉中水飛薊賓色譜峰的分離情況和峰形良好，對(duì)照雞肉樣品中無(wú)目的峰。水飛薊賓由水飛薊賓a 和水飛薊賓b 兩個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體等比例組成，為雙峰。

2.7 試驗(yàn)雞肉樣品水飛薊賓含量測(cè)定結(jié)果

按照1.3.5 和1.3.1 的方法對(duì)試驗(yàn)雞肉進(jìn)行前處理和測(cè)定，試驗(yàn)雞肉樣品水飛薊賓含量測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

圖3 高效液相色譜法檢測(cè)試驗(yàn)雞肉中水飛薊賓含量Fig.3 Determination of silybin in experimental chicken by HPLC

由圖3 可知，對(duì)照組雞肉中未檢測(cè)出水飛薊賓，0.5% 試驗(yàn)組雞肉中水飛薊賓平均含量為（0.167±0.010）μg/g，1.0% 試驗(yàn)組雞肉中水飛薊賓平均含量為（0.302±0.033）μg/g，結(jié)果表明，在日糧中添加的水飛薊賓能夠在雞肉中富集，且富集效果與添加比例有關(guān)，1.0% 試驗(yàn)組含量顯著高于0.5% 試驗(yàn)組（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

水飛薊素的護(hù)肝、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性功能，使其在保健品、醫(yī)藥行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。自我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)全面禁抗后，水飛薊素在畜牧業(yè)中展現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。有研究表明，在飼糧中添加水飛薊素可有效促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，維護(hù)機(jī)體健康，有利于抵抗各種不良應(yīng)激反應(yīng)[8-9]。Bendowski 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞的飲用水中添加水飛薊提取物可促進(jìn)機(jī)體健康，提高生產(chǎn)性能，血清抗氧化能力更強(qiáng)，試驗(yàn)組傳染性法氏囊炎發(fā)生率顯著低于對(duì)照組。上述研究均為開(kāi)發(fā)水飛薊賓作為畜禽飼料添加劑提供了理論基礎(chǔ)。此前有在雞肉中成功富集硒元素的試驗(yàn)，朱梅芳等[11]在靈山土雞日糧中使用自主配制的紅棗富硒飼料，獲得了富硒雞肉和雞蛋，且改善了雞肉和雞蛋的風(fēng)味。也有關(guān)于水飛薊賓在動(dòng)物內(nèi)臟中分布的研究，李秋紅等[12]通過(guò)給大鼠靜脈注射水飛薊賓葡甲胺鹽注射液后，以叔丁基甲醚為提取劑從大鼠心、肝、脾、肺、腎組織勻漿中均檢測(cè)到了水飛薊賓，且在體內(nèi)分布的濃度大小順序依次為肺、肝、心、腎、脾。但由于水飛薊賓具有高度疏水性和非電離性的化學(xué)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致水飛薊賓水溶性差，口服生物利用率低[13]，推測(cè)其導(dǎo)致水飛薊賓在機(jī)體內(nèi)富集效率較低。通過(guò)將水飛薊賓制成納米晶體，有效改善了藥物在體內(nèi)的吸收，提高了生物利用度[14]。

本試驗(yàn)通過(guò)在雞基礎(chǔ)飼糧中添加0.5%、1.0% 的水飛薊賓來(lái)獲得試驗(yàn)雞肉樣品，結(jié)合水飛薊賓易溶于有機(jī)溶劑的特性，以乙酸乙酯作為提取試劑對(duì)試驗(yàn)雞肉進(jìn)行預(yù)處理，建立了一種高效液相色譜測(cè)定試驗(yàn)雞肉中水飛薊賓含量的方法，在色譜條件為流動(dòng)相（水∶甲醇=47∶53，體積比）、流速0.65 mL/min、柱溫30 ℃時(shí)，可在飼糧添加水飛薊賓后獲得的試驗(yàn)雞肉中檢測(cè)出水飛薊賓，此方法操作簡(jiǎn)便、定量準(zhǔn)確、所出色譜峰峰型良好，精密度和回收率較高，為水飛薊賓在雞肉中的含量測(cè)定提供了方法參考。