鐵皮石斛多糖與Toll 樣受體4 互作機制的計算模擬

崔萌菲，張悅，張志宇，許慧敏，劉翠，成穎，李居行，劉歡歡，4，賀超，郭慶彬 ，劉岯

（1.天津科技大學 食品科學與工程學院，天津 300457；2.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；3.中國科學院 天津工業生物技術研究所 低碳制造工程生物學重點實驗室生物設計中心，天津 300308；4.天津益膳康生物科技有限公司，天津 300305；5.中國科學院天津工業生物技術研究所 人工合成淀粉研究中心，天津 300308）

鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimura & Migo）是一種無毒無害的中草藥和新型食品資源。多糖是鐵皮石斛中主要的生物活性成分之一，研究表明鐵皮石斛多糖（Dendrobiumofficinalepolysaccharide，DOP）具有免疫調節[1]、抗腫瘤[2]、抗炎[3]、保肝[4]和胃保護[5]等作用。DOP 還可以與細胞表面的特定受體結合以激活各種細胞內信號轉導途徑[6]，主要通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）活化，促進細胞因子的分泌[7]和巨噬細胞的吞噬活性[8]，進而調節人體的免疫功能。多糖是鐵皮石斛中最主要的生物活性物質，尤其在增強免疫方面展現了優異的活性。因此，DOP 引起越來越多研究者的關注[9]。DOP 的組成[10]得到廣泛研究，不同來源的石斛多糖組分存在一定差異，但主要由不同比例、通過β-1，4糖苷鍵連接的D-甘露糖和D-葡萄糖組成。其中有些甘露糖單元的O-2 或O-3 上存在乙酰基單取代，也存在少量O-2 和O-3 位同時取代的二取代形式[11]。已有研究表明[12]，多糖的乙酰基取代數量和取代位置與多糖的活性有一定的關系。當所有O 位都被乙酰基取代時，多糖的抗腫瘤活性完全消失。當O-3 位被乙酰基取代時，多糖的抗腫瘤活性明顯增強。因此，在適當的位置保有適量的乙酰基可能是鐵皮石斛多糖發揮功效的關鍵。

Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是先天性和適應性免疫反應的關鍵調節因子，并參與許多疾病的發生和發展，可直接使用或作為疫苗中的佐劑，具有潛在的治療癌癥和感染的功能[13]。TLR4 是一種保守的I 型跨膜蛋白，包括胞外域、跨膜區和胞內域3 個部分，分子量約為96 kDa[14]，其中胞外域由608 個氨基酸殘基構成，具有富含亮氨酸重復單元（leucine-rich repeats，LRR）N 端，相對保守，呈現LRR 超家族特有的馬蹄形結構，可用于識別生物大分子。胞內域由187 個氨基酸殘基構成[15]。髓樣分化因子-2（myeloid differentiation protein-2，MD-2）具有β折疊結構，由160 個氨基酸組成，具有一個大的疏水口袋，可與TLR4 形成穩定的異二聚體復合物TLR4-MD-2[16]。TLR4-MD-2 的經典底物脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），主要是由3 個結構域組成：一個相對保守的非重復核心寡糖、O抗原和一個嵌入在外膜中被稱為脂質A 或內毒素的疏水結構域。其中核心寡糖影響外膜的滲透特性；O抗原有助于分子的抗原性[17]；脂質A 結構域與免疫受體相互作用，賦予LPS 分子一系列免疫和潛在的內毒素特性。LPS 的結合能夠引導兩個TLR4-MD-2-LPS復合物對稱排列，形成由兩個拷貝組成的m 形受體多聚體。

研究表明，DOP 可作為激活巨噬細胞的TLR4 激動劑[18]。Zhang 等[19]研究多糖和TLR4 的結構和生物活性之間的關系，發現葡萄糖、甘露糖和半乳糖是TLR4 相關活性多糖的藥效團。然而，由于結構的復雜性，包括DOP 在內的多糖仍然難以確定哪一部分是免疫活性片段以及如何與TLR4 相互作用[20]。 目前TLR4 與DOP 相互作用的研究也主要側重于實驗層面[21-22]，仍然缺乏在原子水平上的相互作用機制研究。分子對接、分子動力學模擬等計算模擬方法是一種通過計算機平臺模擬分子性質的技術手段[23]，能夠在原子水平上準確直觀地預測結合模式，揭示體外實驗難以捕獲的機理細節[24]，是研究分子間相互作用機制的有效方法。

本文通過類比經典底物脂多糖的結合模式，通過對TLR4-MD-2 底物結合口袋的親疏水性分析，提出對DOP 分別進行疏水性寡糖片段和親水性寡糖片段的篩選，進而組合得到與TLR4-MD-2 作用最佳的多糖結合片段。基于DOP 的分子組成，構建由二糖、三糖、四糖組成的疏水寡糖庫，借助分子對接分析，找出最佳疏水結合片段。進一步引入三糖和四糖組成的親水結合片段，得到與TLR4-MD2 作用最佳的DOP 片段。通過分子動力學模擬和結合自由能計算（molecular mechanics generalized born surface area、MMGBSA）及殘基分解結合能計算，確定最佳DOP 寡糖片段的作用模式及與TLR4-MD2 的作用機制。本研究所采用的模擬方法，不僅可以用于鐵皮石斛多糖與受體蛋白的相互作用研究，也可為其他多糖-蛋白質的相互作用研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 結構處理和數據準備

蛋白質處理：使用從蛋白質數據庫（protein data bank，PDB）下載的晶體結構3FXI 作為初始結構，使用Schrodinger 2018 軟件的Protein Preparation Wizard 模塊進行蛋白的預處理，去除水分子，在pH7.0 條件下加氫，然后用OPLS3e 力場進行蛋白質復合物的結構優化，去除不合理的結構沖突。利用ExPASy[25]的ProtScale工具中氨基酸疏水性標準等級數值[26]對TLR4-MD-2蛋白進行親疏水性分析。利用Pymol 的APBS 插件計算TLR4-MD2 的表面靜電分布。

寡糖片段生成：為了進行疏水寡糖片段的篩選，對組成石斛多糖的5 種主要糖殘基（D-甘露糖、D-葡萄糖、O-2 或O-3 乙酰基單取甘露糖、O-2 和O-3 同時取代的甘露糖），利用編寫的python 腳本生成所有二糖、三糖和四糖片段的可能組合。根據得到的組合寡糖的序列，利用Schrodinger 2018 的Custom R-Group Enumeration 模塊完成疏水寡糖分子庫的構建。對于親水寡糖片段庫的構建，考慮到葡萄糖和甘露糖的親水性，選取3~4 個葡萄糖和3 個甘露糖，使用同樣的方法構建得到所有可能的親水多糖片段組合。初始結構組成及LPS 的結構組成見圖1。

圖1 初始結構組成及LPS 的結構組成Fig.1 Initial structural composition and LPS structural composition

1.2 分子對接

利用Schrodinger 2018 軟件中的LigPrep 模塊，選用OPLS 分子力場，對構建好的疏水寡糖片段庫進行結構優化處理。與準備好的TLR4-MD-2 蛋白結構一起載入Ligand Docking 模塊進行分子對接分析。基于晶體結構3FXI 中的天然配體脂多糖分子，使用Receptor Grid Generation 模塊設置對接盒子位置，根據對接打分挑選最佳疏水性片段。在最佳疏水性片段的基礎上引入親水性片段組合后，同樣參照脂多糖的位置進行DOP 片段的分子對接。

1.3 分子動力學模擬

使用分子動力學模擬軟件Amber 20[27]對最后得到的DOP 片段與TLR4-MD-2 蛋白的復合體系進行分子動力學模擬。在模擬中，使用了ff19SB 力場，采用SHAKE 方法約束鍵長振動，將所有的模擬體系放入水層厚度為15 ? 的矩形TIP3P 水盒子中，采用周期性邊界條件，使用Na+作為抗衡離子使整體電荷保持中性。所有的體系首先經過2 輪4 000 步的能量最小化，其中2 000 步為最陡下降法，2 000 步為共軛梯度法。第一輪優化，給體系施加2 kcal/（mol·A）的限制力常數，第二輪優化無限制。之后進行了500 ps 的加熱模擬，目標溫度為300 K。緊接著使用20 輪密度平衡模擬，每輪20 ps，使體系密度達到均衡。之后是500 ps 的平衡模擬，使體系達到300 K 下的平衡狀態。最后進行3 條平行的1 000 ns 的長時生產模擬。使用average linkage聚類方法對力學軌跡中非氫原子進行疊合，基于底物的距離進行聚類分析，得到體系的代表性結合構象。對優勢結合模式進行結合能和殘基分解結合能計算分析，找到有重要貢獻的結合殘基和作用機制。

1.4 數據處理和可視化

軌跡分析使用Amber 20 的Cpptraj 模塊進行，所得數據使用Excel 進行歸納處理與分析，用Origin 2021、PowerPoint 2021 對所得到的數據進行作圖。通過將復合物的PDB 文件上傳至蛋白質配體相互作用分析器（protein-ligand interaction profiler，PLIP）[28]進行寡糖-蛋白相互作用分析。使用三維結構顯示軟件Pymol[29]對結果進行可視化展示。

2 結果與討論

2.1 TLR4-MD-2 蛋白性質

TLR4-MD-2 蛋白的親疏水性分布如圖2 所示。

圖2 TLR4-MD-2 親疏水性分布Fig.2 Hydrophilic and hydrophobic distribution of TLR4-MD-2

圖2 中紅色代表疏水性區域，顏色越深代表疏水性越強。由圖2 可知，TLR4 結合口袋呈現親水性特征（位置1 附近），為經典底物LPS 的多糖結合區。MD-2結合口袋（位置2 附近）形成大的疏水性結合腔，LPS的疏水性脂質A 結構域插入該結合腔中形成疏水性相互作用。因此，TLR4-MD-2 的底物結合口袋可以認為由親水性區域和疏水性區域兩部分組成。TLR4-MD-2的表面靜電勢分布如圖3 所示，藍色、紅色和白色分別表示電正性、電負性和電中性，顏色越深，則表示電勢越強。

圖3 TLR4-MD-2 表面靜電勢分布Fig.3 Electrostatic potential distribution on the surface of TLR4-MD-2

在TLR4 的底物結合區（位置1）附近，TLR4 亞基作用界面呈現強的正電性（位置3 附近），TLR4 與MD-2的作用界面呈現強的電負性（位置4 附近）。TLR4 底物結合區本身主要呈正電性，LPS 帶有兩個磷酸基團，具有一定的電負性，能夠和該正電區域進行結合，其末端糖基向TLR4 與MD-2 作用界面的電負性區域延伸。MD-2 的疏水性口袋主要表現為電中性（位置2 附近）。此外，C 端TLR4 亞基作用界面也呈現比較強的電負性。

2.2 DOP 疏水性片段篩選結果

2.2.1 疏水寡糖片段分子庫

基于TLR4-MD-2 蛋白體系具有親水和疏水結合腔的結構特點，對鐵皮石斛多糖片段的篩選分為疏水性寡糖片段的篩選和親水性寡糖片段的篩選。對于疏水性片段的篩選，使用組成石斛多糖的5 種主要糖殘基，組合構建25 個二糖、125 個三糖以及625 個四糖共775 個疏水寡糖片段，具體如圖4 所示。

圖4 疏水寡糖片段分子庫示意圖Fig.4 Schematic diagram of the molecular library of hydrophobic oligosaccharide fragments

2.2.2 疏水片段分子對接

將處理好的775 個DOP 寡糖分別對接到TLR4-MD-2 的活性口袋中，對接盒子的中心坐標為-7.334、-12.03、-23.18 ?，外部盒子的長寬高分別為30、42、33 ?，內部盒子的長寬高分別為10、22、13 ?。表1 展示了二糖、三糖和四糖中對接排名前十的結果。對接打分是對對接的寡糖片段與蛋白匹配程度的評價指標，以判斷兩者的結合強弱。

表1 疏水片段庫對接結果Table 1 Docking results of hydrophobic fragment library

由表1 可知，隨著糖殘基的增加，結合強度逐漸增大，說明分子量對結合強度有一定的影響。其中結合最強片段為一個四糖片段，結合能為-8.06 kcal/mol，由M-2，3、M-2、3、M-2、G 組成，含有3 個乙酰基取代的甘露糖片段。

2.2.3 最佳疏水片段與TLR4-MD-2 的相互作用

最佳四糖片段與TLR4- MD-2 的相互作用見圖5。

圖5 最佳四糖片段與TLR4- MD-2 的相互作用Fig.5 Interaction between the optimal tetrasaccharide fragment and TLR4-MD-2

由圖5 可知，DOP 寡糖已插入TLR4-MD-2 的活性位點，結合在MD-2 的疏水性口袋內。與氨基酸殘基Leu 61、Leu 78、Ile 80、Tyr 102、Ser 118、Ser 120、Val 135和Arg 264 形成相互作用。其中，與氨基酸殘基Tyr 102、Ser 118、Ser 120 和Arg 264 之間存在氫鍵相互作用，與氨基酸殘基Leu 61、Leu 78、Ile 80、Tyr 102 和Val 135 之間通過疏水形成相互作用。

2.3 DOP 親水性片段篩選結果

考慮到葡萄糖和甘露糖的親水性，在得到的最佳疏水性四糖片段的基礎上引入3~4 個葡萄糖和3 個甘露糖，組合得到8 個七糖和16 個八糖多糖片段。同樣參照經典底物LPS 的結合模式設置對接盒子進行分子對接，結果見表2。

表2 最佳七糖和八糖片段分子對接結果Table 2 Molecular docking results of the optimal heptasaccharide and octasaccharide fragments

表2 表明，最佳八糖片段對接打分為-7.89 kcal/mol，最佳七糖片段對接打分為-8.2 kcal/mol。八糖與TLR4-MD-2 的結合能力較弱且不能對接至親水區域，通過對比七糖片段發現，在可對接區域內，增加的糖環并未再進一步增強與親水性結合區域的結合強度，反而由于去溶劑化等不利因素，造成結合能下降。因此，使用七糖來進一步研究鐵皮石斛多糖與TLR4-MD-2 的可能作用機制。

2.4 分子動力學模擬結果

為進一步研究七糖片段與TLR4-MD-2 的可能作用機制，對七糖與TLR4-MD-2 的復合物進行3 條平行的1 000 ns 長時分子動力學模擬。對3 條軌跡后900 ns共225 000×3 幀結構的分簇分析，結果見圖6。

圖6 七糖兩種結合模式對比Fig.6 Comparison of two binding modes of heptasaccharides

由圖6 可知，在得到的代表性構象中，七糖有兩種結合模式：在第一種結合模式中（圖6 黃色底物），最佳四糖片段結合在MD-2 的疏水口袋中，親水性的3 個葡萄糖結合在TLR4 正電性底物結合區，末端糖基像經典底物LPS 一樣向TLR4 與MD-2 作用界面的電負性區域延伸（圖3 位置4 附近）。第二種結合模式中（圖6 青色底物），四糖片段同樣位于MD-2 的疏水口袋中，3 個葡萄糖片段經TLR4 電正性底物結合區向電正性的TLR4 亞基作用界面延伸（圖3 位置3 附近）。其中，第一種結合模式為優勢結合模式，在整個動力學過程中占到70.8%，與經典底物LPS 結合模式類似。

為了進一步研究優勢結合模式中DOP 寡糖片段與TLR4-MD-2 的作用機制，進行結合自由能和分解殘基結合能的計算分析，結果見表3。

表3 對七糖片段結合有重要貢獻的氨基酸殘基Table 3 Amino acid residues that contribute significantly to the binding of the heptasaccharide fragment

表3 顯示，找到的DOP 七糖片段與TLR4-MD-2有較強的相互作用，結合能達到-67.528 9 kcal/mol。對該模式的分解殘基結合能計算找到了對七糖結合有重要貢獻的氨基酸殘基，其相互作用見圖7。

圖7 最佳七糖片段與TLR4-MD-2 的相互作用Fig.7 Interaction of the optimal heptasaccharide fragment with TLR4-MD-2

由圖7 可知，氨基酸殘基R90、S120、F121、S118、R264、K122、E439 及M414 主骨架與七糖底物形成氫鍵作用（圖7 洋紅色虛線表示）。殘基F121、L78、I80、F119、I124、K58、F151、L61、C133、F440、I52、F126、L60和V135 與底物形成疏水相互作用（圖7 灰色虛線表示）。由此可知，鐵皮石斛多糖主要通過氫鍵和疏水作用與TLR4-MD-2 進行相互作用，發揮免疫活性。

3 結論

在本研究中，根據對TLR4-MD-2 結合腔的親疏水性分析，將DOP 寡糖的研究分為疏水片段篩選和親水片段篩選兩個部分。通過分子對接和動力學模擬找到了與TLR4-MD-2 有較強結合能力的七糖DOP 片段，具有與經典底物脂多糖相似的結合模式。其中的疏水性四糖片段結合在MD-2 的疏水結合腔，親水性三糖片段結合在電正性區域。作用機制分析表明，DOP 和TLR4-MD-2 主要通過氫鍵和疏水作用力進行相互作用，其中疏水四糖片段帶有的4 個乙酰基，可能是DOP具有潛在免疫活性的關鍵。