基于混菌發酵改善火龍果酒品質

胡陸軍 ，陳曉蝶，曹雨瀾，趙長青，王佐軍，趙志峰

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644005；2.四川輕化工大學 釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644005；3.四川大學輕工科學與工程學院，四川 成都 610000）

火龍果（HylocereusundulatusBritt）又名仙人果，一般基于果皮和果肉的顏色分為紅皮紅心、紅皮白心、黃皮白心3 種，以紅皮白心和紅皮紅心為上品[1]。紅心火龍果含有多種生物活性物質，如酚類化合物、多糖和萜類化合物，這些化合物的抗氧化活性可保護身體免受氧化損傷，具有重要的功能特性[2]。火龍果香氣獨特，顏色鮮艷，營養價值豐富，這些特點使得火龍果成為一種優良的釀酒原料。但是，目前火龍果酒多采用市售商業酵母[3]，菌種相對單一，發酵產生的有機酸、酯類等香氣成分含量偏低，導致其風味單調，難以充分反映火龍果酒的復雜性和典型性。

近年來，報道證明非釀酒酵母在果酒發酵過程中可以產生多種風味物質，這在很大程度上有助于改善火龍果酒品質。非釀酒酵母能產生果膠酶、β-葡萄糖苷酶等多種胞外酶，這為火龍果酒獨特香氣成分的形成提供了可能[4]。此外，基于菌種之間互補作用，釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）和非釀酒酵母組合發酵對改善火龍果酒的感官特性具有重要作用[5]。Lin 等[6]利用巴氏酵母（S.bayanus）和梅奇酵母（Metschnikowiaagaves）共同發酵紅心火龍果酒，發現混菌發酵可以增加火龍果酒風味物質的種類。有研究證明庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichiakudriavzevii）能夠產生更多的甘油、琥珀酸或一些雜醇及其相應的酯[7]，能豐富果酒的香氣，但關于庫德里阿茲威畢赤酵母在火龍果酒發酵中的應用研究鮮見。

從一定意義上來說，消費者對果酒的喜愛程度受酸度影響較大。研究表明乳酸菌在果酒發酵過程中能夠通過蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）將蘋果酸轉化為乳酸，為果酒帶來順滑、飽滿的口感[8]。不僅如此，MLF 在一定程度上也能夠增加發酵果酒中微生物穩定性[9]。酒酒球菌（Oenococcusoeni）和植物乳植桿菌（Lactiplantibacillusplantarum）常被作為降酸發酵劑用于果酒發酵的研究[10-11]，但目前較少用于火龍果酒降酸的研究。

基于此，本研究以紅心火龍果為原料，利用釀酒酵母、庫德里阿茲威畢赤酵母和植物乳植桿菌混合發酵火龍果酒，通過探究混菌發酵對發酵火龍果酒理化性質、抗氧化性、風味物質、感官特性等影響的研究，以期為提高火龍果酒品質及產品開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅心火龍果：市售；釀酒酵母SCFF201、庫德里阿茲威畢赤酵母SCFF163、植物乳植桿菌SCFF195：四川輕化工大學發酵食品實驗室；果酒釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司。

食用小蘇打、焦亞硫酸鉀、果膠酶（30 000 U/mL）、白砂糖、無水檸檬酸：日照金禾博源生化有限公司；氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、無水乙酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司；酵母膏、蛋白胨：北京奧博星生物技術有限責任公司；超氧陰離子檢測試劑盒、羥自由基清除能力檢測試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

GI54DWS 立式自動壓力蒸汽滅菌鍋：廈門致微儀器有限公司；BSP-250 生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；MITR-50ATC 糖度計、MITR-80ATC酒精計：長沙米琪儀器設備有限公司；PhS-10 酸度計：成都世紀方舟科技有限公司；UV-1900I 紫外可見分光光度計：蘇州烏津儀器有限公司；TSQ 8000 氣相色譜-質譜聯用儀：美國賽默飛世爾科技公司；LC1100 高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗組合

本研究試驗分組如表1 所示，酵母菌接種量為6%，釀酒酵母和非釀酒酵母的菌種數量按照1∶1 的比例進行接種，酵母菌和植物乳植桿菌的菌種數量按照2∶1 的比例進行接種。

表1 發酵火龍果酒混菌組合Table 1 Mixed strains combination for the fermentation of pitaya wine

1.3.2 火龍果酒發酵條件

1.3.2.1 工藝流程

火龍果酒發酵工藝流程如圖1 所示。

圖1 火龍果酒發酵工藝流程Fig.1 Technological process for the fermentation of pitaya wine

1.3.2.2 操作要點

新鮮火龍果去皮打成漿，在果漿中添加60 mg/kg焦亞硫酸鉀和3 g/100 kg 果膠酶，于20 ℃條件下酶解24 h，然后再用白砂糖調節糖度至23?Bx。首先，將植物乳植桿菌接種于MRS 固體培養基中培養24 h（37 ℃），然后再將其接種于MRS 液體培養基中進行活化，制成發酵種子液。采用同樣的方式活化并制備釀酒酵母和庫德里阿茲威畢赤酵母種子液（YPD 培養基）。本研究中火龍果酒發酵溫度保持在20 ℃，每間隔2 d 對發酵樣品理化指標進行測定，當還原糖含量不再發生變化或變化不明顯時認為火龍果酒發酵結束。發酵完成后對其過濾，并于4 ℃條件下陳釀。

1.3.3 火龍果酒理化指標的測定

1.3.3.1 常規理化指標測定

發酵火龍果酒總酸、還原糖含量、酒精度等指標根據GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定[12]。采用pH 計測定樣品pH 值。每個指標重復測定3 次。

1.3.3.2 甜菜紅素含量測定

參照肖默艷等[13]的方法，按以下公式以甜菜苷計算出甜菜紅素的含量（H，mg/L）。

式中：D為稀釋倍數；A536為波長在536 nm 處的吸光度；L為比色皿的光路長度，1 cm；M為甜菜苷摩爾分子質量，550.46 g/mol；ε 為標準甜菜苷摩爾消光系數，60 600 L/（mol?cm）。

1.3.3.3 總酚含量測定

總酚含量根據Khalili 等[14]的方法進行測定，并稍作修改。從0~0.8 mL 每間隔0.1 mL 吸取沒食子酸標準溶液（0.1 mg/mL）到不同的容量瓶中，分別加入2.0 mL福林酚試劑和8.0 mL 的碳酸鈉溶液（60 g/L），加蒸餾水定容至25 mL，測量其吸光度（OD760）。以沒食子酸濃度作為橫坐標，以樣品吸光度作為縱坐標，繪制標準曲線，求出回歸方程和相關系數。精確量取待測樣品1.0 mL，定容至10.0 mL，按上述方法測定發酵樣品吸光度（OD760），發酵樣品總酚含量根據標準曲線回歸方程y=12.699x+0.082（R2=0.999 2）進行計算。

1.3.4 火龍果酒抗氧化性檢測

1.3.4.1 羥自由基清除率檢測

按照試劑盒說明書步驟測定發酵火龍果酒樣品的羥自由基清除率。依據下列公式對羥自由基清除率（D，%）進行計算。

式中：A0為空白管吸光度；A1為對照管吸光度；A2為測定管吸光度。

1.3.4.2 超氧陰離子含量測定

按照超氧陰離子檢測試劑盒比色法說明書步驟測定超氧陰離子含量。

1.3.5 火龍果酒風味物質測定

1.3.5.1 有機酸測定

有機酸參考Peng 等[15]的方法測定，采用95% 磷酸二氫鉀（pH2.4）為流動相A 溶液，5% 甲醇為流動相B溶液。使用Agilent ZORBAX SB-Aq 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），紫外檢測器檢測波長設定為210 nm。待測樣品進樣量設定為15 μL，流速設定為0.4 mL/min，柱溫設定為25 ℃。

1.3.5.2 揮發性風味物質檢測

風味物質鑒定和定量主要參照Mustafa 等[16]的方法。該方法進樣口溫度設定為250 ℃，離子源溫度設定為200 ℃，接口溫度設定為250 ℃。采用的色譜柱為SH-Rxi-5Sil MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。載氣選擇氦氣，流速設定為1.5 mL/min，進樣量設定為1 μL，進樣方式選擇不分流進樣。升溫方式：首先保持在50 ℃條件下保留1 min；隨后以25 ℃/min 的速度升溫至125 ℃；其次以10 ℃/min 速度升溫至300 ℃，最后在300 ℃條件下保留10 min。

1.3.6 感官評價

遴選10 名食品科學與工程專業學生并做感官評價培訓，根據劉琨毅等[17]的評價方法對不同發酵樣品的色澤、口感、香氣和典型性進行評價，具體評價標準如表2 所示。

表2 火龍果酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria of pitaya wine

1.4 數據分析

本研究數據分析采用IBM SPSS Statistics 26.0 軟件，結果差異分析利用單因素方差分析和Duncan 法，繪圖利用GraphPad Prism 6.0 軟件。

2 結果與分析

2.1 不同發酵火龍果酒基本理化指標

2.1.1 pH 值和總酸含量

pH 值和總酸含量的變化是有機酸、無機酸等多種酸類物質分解和合成交替進行的結果，是體現發酵火龍果酒品質的關鍵參數，對發酵過程中微生物的代謝以及火龍果酒的口感和色澤等感官品質影響較大[18]。火龍果酒發酵樣品pH 值和總酸含量變化如圖2 所示。

圖2 不同火龍果酒發酵組pH 值和總酸含量變化Fig.2 Changes in pH and total acid contents in different fermentation groups of pitaya wine

在發酵前期pH 值呈上升趨勢，可能是微生物在早期利用火龍果汁中的有機酸、氨基酸等營養物質[19]；發酵14 d 時，Aq 組pH 值最低（P<0.05），可能是因為非釀酒酵母生長代謝的能力較弱，無法利用火龍果酒中的大分子酸類物質，導致酸度過高，這可能導致火龍果酒感官的下降[20]。各發酵組的總酸含量均呈現出先上升后降低的趨勢，并在第8 天達到最大值，除了火龍果中的酸性成分，還可能含有酵母菌自身代謝而產生的酸類物質[19]，以及微生物在高濃度糖的刺激下，發生了對糖的應激效應而形成的酸[21]。在發酵過程中，Zw組總酸含量變化波動大于Sk 組和Aq 組，可能是因為酵母的體積和質量更大，酵母菌比植物乳植桿菌更快地吸收營養物質，產生了菌種之間對營養物質（如有機酸、糖等）的競爭，因此Zw 組的總酸含量變化波動較大[20]。但在發酵后期Zw 組相比于其他組，總酸含量一直處于最低水平（P<0.05），可能是因為后期酵母代謝產生了一部分營養物質，刺激了植物乳植桿菌的生長代謝，從而降低了火龍果酒的酸度[22]。

2.1.2 糖度、還原糖含量和酒精度

酵母菌等微生物可借助糖酵解方式分解糖類物質形成乙醇及其他產物，酵母菌等微生物對糖的發酵效率是衡量其發酵特性的關鍵參數[23]。不同發酵樣品糖度、還原糖含量的變化如圖3 所示，酒精度變化如圖4 所示。

圖3 不同火龍果酒發酵組糖度、還原糖含量的變化Fig.3 Changes in sugar and reducing sugar contents in different fermentation groups of pitaya wine

圖4 不同火龍果酒發酵組的酒精度Fig.4 Alcohol contents in different fermentation groups of pitaya wine

不同菌種在單獨發酵和混合發酵過程中，由于微生物的利用，糖度和還原糖含量總體上一直呈下降趨勢。在第4 天時各發酵樣品的糖度下降幅度較小，同時各火龍果酒發酵樣品還原糖有一定程度的升高，其原因可能是由于火龍果肉的浸漬作用或分泌的果膠酶分解了火龍果中的果膠類物質[24]。在火龍果酒發酵中后期，相較于其他火龍果酒發酵組，Sn 組對糖的利用效率最低（P<0.05），最終的還原糖濃度高達（37.84±0.09）g/L，而Zw 組對糖的利用效率相對較高（P<0.05），最終含量僅為（5.27±0.02）g/L，其原因可能是因為酵母菌釋放了維生素、氨基酸等營養物質，這些物質在一定程度上加速了植物乳植桿菌的生長繁殖，從而在整體上促進了混菌發酵組（Zw 組）對糖的利用程度[25]。

由圖3 和圖4 可知，火龍果發酵產生的酒精度的高低與微生物對糖的利用率有非常緊密的聯系。Zw組發酵體系對糖度的利用程度最高，其酒精度最高為（12.47±0.06）% vol（P<0.05）；而Sn 組在火龍果酒發酵過程中對糖的利用率最差，產酒精能力也最差，酒精度最低為（6.7±0.1）% vol（P<0.05）。這表明混菌發酵相對于單菌發酵在糖利用方面的效率得到明顯提升。

2.2 甜菜紅素

甜菜紅素是存在于火龍果中的一種天然色素，其含量會對火龍果酒的顏色等感官造成較大影響，其穩定性較低，較易受到氧氣、光照、酶等多種因素的影響[26]。不同發酵組中甜菜紅素含量的變化如圖5 所示。

圖5 不同火龍果酒發酵組甜菜紅素含量的變化Fig.5 Changes of betacyanin contents in different fermentation groups of pitaya wine

在發酵過程中，甜菜紅素含量整體上呈降低趨勢，主要原因可能是火龍果酒中的多種降解酶（如β-葡萄糖苷酶、多酚氧化酶等）和微生物之間的相互作用造成的[27]。而在發酵前期和末期，甜菜紅素含量都有一定的增加，在發酵前期火龍果肉通過浸漬的作用將果肉中一部分甜菜紅素釋放出來[24]，而后期可能是因為微生物通過細胞自溶釋放出細胞壁吸附的一小部分甜菜紅素[23]。從整體上來看，發酵后Zw 組的甜菜紅素含量最高，為（84.84±0.18）mg/L，Sn 組最低，為（70.67±0.18）mg/L，各組間存在顯著差異（P<0.05），說明在火龍果酒的發酵中添加植物乳植桿菌，可以有效減少甜菜紅素的損失。

2.3 抗氧化性

總酚是決定發酵果酒品質的重要參數，在一定程度上對果酒的顏色、苦澀味等感官特性有較大影響[28]。不同火龍果酒發酵樣品的總酚含量、超氧陰離子含量和羥自由基清除率如圖6 所示。

圖6 不同火龍果酒發酵組的總酚含量、超氧陰離子含量和羥自由基清除率Fig.6 Total Phenol content，superoxide anion content and hydroxyl radical scavenging rate in different fermentation groups of pitaya wine

由圖6（a）可知，在發酵過程中，微生物通過自身新陳代謝會產生多種次級代謝產物，這些物質可與酚類物質發生氧化、聚合和沉淀等多種反應，從而降低各發酵樣品中的總酚含量[29]。由圖6（b）可知，與對照組（JP 組）相比，其他火龍果酒發酵組超氧陰離子含量和羥自由基清除率明顯下降，其原因可能是因為火龍果的細胞壁在微生物酶催化下分解形成蛋白質、糖苷等物質[30]。不同發酵樣品中，Aq 組多酚含量最高，為（570.67±4.16）mg/L，而三菌發酵火龍果酒組（Zw 組）超氧陰離子含量最高，為（44.36±0.24）μmol/mL，而羥自由基清除率略低于Aq 組。綜合來看，Zw 組的抗氧化能力最優（P<0.05），其原因可能是由于植物乳植桿菌代謝改善了混菌發酵體系的抗氧化性[10]。

2.4 不同發酵體系風味物質分析

2.4.1 不同發酵火龍果酒樣品有機酸比較

有機酸也在很大程度上對火龍果酒品質有較大影響，它不僅影響火龍果酒的酸度和苦澀味等口感，而且對火龍果酒的色澤、化學穩定性和保存品質等因素也有顯著影響[31]。不同微生物菌種代謝有機酸的能力有較大差異，有機酸的變化對某些酯類、揮發性脂肪酸等風味物質的變化會產生重要影響[32]。不同發酵體系有機酸含量對比結果如圖7 所示。

圖7 不同發酵體系有機酸含量Fig.7 Organic acid contents in different fermentation systems of pitaya wine

由圖7 可知，在所有火龍果酒發酵樣品中，酒石酸和檸檬酸含量較低，其原因可能是由于發酵過程中酒石酸被微生物降解或形成了酒石酸氫鉀沉淀[32]；而檸檬酸被微生物分解產生乙酸等其他物質[33]。火龍果酒中主要的有機酸是乳酸和乙酸，一般認為，過高的乙酸濃度會導致火龍果酒產生難聞的氣味[34]。Sc 組乙酸相對含量最高，為8.99%，這可能會影響火龍果酒的口感。而三菌發酵火龍果酒組（Zw 組）的乙酸相對含量最低，為1.66%，其原因可能是因為植物乳植桿菌分解己糖，規范了火龍果酒發酵，減少了乙酸的產生[35]。因此，三菌混合發酵的方式可以在一定程度上減少火龍果酒難聞氣味的形成，同時植物乳植桿菌表現出明顯的降低酸度的作用。

蘋果酸可經由丙酮酸的固定和草酰乙酸的還原生成[36]。低含量的蘋果酸具有青蘋果的香味，若含量高會帶來刺鼻的氣味。Sk 組和Aq 組蘋果酸相對含量較高，分別為1.83% 和1.82%，可能會對火龍果酒的香氣帶來負面影響。并且在相同條件下，Sk 組的蘋果酸相對含量高于Zw 組，這可能是發生了植物乳植桿菌主導的蘋果酸-乳酸發酵。

相對于蘋果酸來說，乳酸在口感上更加柔和，在果酒發酵過程中可通過丙酮酸的還原或蘋果酸的分解產生[36-37]。由圖7 可知，所有火龍果發酵樣品的乳酸相對含量均較高，與低含量的蘋果酸具有一定對應關系。與兩菌發酵火龍果酒組（Sk 組）相比，含有植物乳植桿菌的三菌發酵火龍果酒組（Zw 組）乳酸相對含量較低，從而使發酵產生的火龍果酒酸度較低，口感更加柔和。

綜上來看，三菌混合發酵火龍果酒組（Zw 組）總有機酸含量顯著低于其他發酵組，這與前文總酸分析結果相對應，表明含有植物乳植桿菌的混菌發酵有利于降低火龍果酒的酸度，改善了口感。

2.4.2 不同發酵火龍果酒樣品揮發性風味物質比較

果酒揮發性風味物質形成受發酵菌種影響較大。不同火龍果酒發酵樣品揮發性風味物質如表3 所示。

表3 不同火龍果酒發酵組揮發性風味物質Table 3 Volatile flavor substances in different fermentation groups of pitaya wine

由表3 可以看出，5 組發酵火龍果酒樣品中共鑒定出63 種香氣化合物，醇類化合物27 種，酯類化合物20 種，酸類化合物有8 種，酮類化合物有8 種。

揮發性酸類物質是形成酯類物質不可缺少的前提物質，適應濃度的酸類物質可使果酒口感清爽，當酸類物質濃度過高時則會導致果酒產生尖酸難聞的氣味[38]。Aq 組揮發性酸種類較多、相對含量較高，Sn 組相對含量較低，這可能是果酒釀酒酵母與庫德里阿茲威畢赤酵母代謝能力差異造成的。相對于其他發酵組，三菌發酵火龍果酒組（Zw 組）的酸類物質的含量較低，其原因可能是植物乳植桿菌分泌的脂肪酶在火龍果酒的發酵過程中分解了揮發性脂肪酸[39]。

高級醇對火龍果酒中的風味貢獻較大，乙醇、2，3丁二醇、異戊醇、苯乙醇等是火龍果酒的主要醇類物質。乙醇在各發酵組中的相對含量最高，可為火龍果酒提供柔和、愉快的玫瑰香氣[40]。此外，Zw 組和Sn 組苯乙醇和異戊醇相對含量較高，苯乙醇可以賦予火龍果酒良好的花果香，異戊醇可以賦予其酒香，有助于增加酒體的復雜性[41]。但是，相對于其他發酵組，三菌發酵火龍果酒組（Zw 組）高級醇相對含量較高，說明多菌株聯合發酵有助于改善火龍果酒香味物質，而產生這種現象的原因可能是由于菌株的代謝不同造成的。研究發現2，3-丁二醇在釀酒酵母SCFF201 發酵組（Sc組）和三菌發酵火龍果酒組（Zw 組）的相對含量最高。2，3-丁二醇作為食用香料乙偶姻的還原產物，在果酒中會帶來青香味，而它的含量在很大程度上受火龍果酒的氧化還原電位以及依賴還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的雙乙酰還原酶和丙酮還原酶的活性影響[42-43]。

酯類化合物大多具有怡人的揮發性氣味，有助于改善火龍果酒的感官價值。本試驗各發酵組酯類分布各不相同，與Gong 等[44]的研究結果差異較大，可能是因為檢測方法存在差異。乙酸乙酯在各組中占比最多，主要為火龍果酒帶來甜香；乳酸乙酯、己酸乙酯等具有果香和奶油香氣[45]，在混菌發酵體系Sk 組有一定占比，而在Sn 組、Sc 組和Zw 組中未檢測出該物質，但Sn 組的酯種類最多，說明庫德里阿茲威畢赤酵母在一定程度上能促進這些酯的產生，有利于提升火龍果酒的感官特征。

2.5 不同發酵火龍果酒樣品的感官評價

火龍果酒的品質與其顏色、香味、口感等因素有關，而這些指標與菌種、甜菜紅素含量、pH 值、總酸含量等密切相關。在pH 值為4~7 時，甜菜紅素呈現紫紅色，穩定性好[26]，火龍果酒感官評價結果如表4 所示。

表4 火龍果酒感官評價結果Table 4 Sensory evaluation results of pitaya wine

由表4 可知，Sn 組的色澤與其他組有顯著差異，Zw 組得分最高，Sn 組得分最低，與前文pH 值和甜菜紅素含量變化相對應；Zw 組的口感得分最高，酸味較柔，有明顯的花香、果香味，與苯乙醇、異丁醇、2，3-丁二醇相對含量較高有關。總體上Zw 組混菌發酵的火龍果酒降酸優勢明顯，顏色鮮艷，風格獨特，口感更加柔和，更受歡迎。

3 結論

本研究以釀酒酵母、庫德里阿茲威畢赤酵母和植物乳植桿菌單菌或聯合發酵火龍果酒為基礎，分析不同發酵火龍果酒的發酵特性及產生的風味物質的差異。與單菌發酵相比，釀酒酵母、庫德里阿茲威畢赤酵母和植物乳植桿菌三菌組合發酵提高了糖的利用率，在一定程度上減少了甜菜紅素損失和抗氧化能力降低的程度。在總酸、有機酸方面，三菌發酵的總酸、有機酸含量明顯低于其他組，說明植物乳植桿菌在降酸方面有顯著優勢。結合風味物質種類及相對含量來看，三菌發酵產高級醇的種類和相對含量優于其他組。感官評價顯示，三菌發酵的火龍果酒顏色鮮艷，香氣濃郁，口感酸甜適中。因此，利用釀酒酵母、庫德里阿茲威畢赤酵母和植物乳植桿菌聯合發酵的方式明顯改善了火龍果酒品質，為火龍果酒品質調控和產品開發提供科學依據。