乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物工藝條件優化及其對抗氧化活性影響

叢珊滋，曹雨佳，張欣欣，李冠龍，劉曉蘭 ，胡楠

（1.齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

玉米蛋白水解物（corn protein hydrolysates，CPH）是玉米蛋白經蛋白酶酶解后得到的低分子量寡肽混合物，其氨基酸種類多，能夠滿足人體日常所需，促進人體健康。玉米蛋白水解物具有多種生物活性，如抑制血管緊張素轉換酶活性、抗氧化、解酒護肝、抗疲勞等[1]。然而，在玉米蛋白水解物的制備過程中，存在生物活性釋放程度低、味苦等問題[1-2]，極大地影響了其發展。

發酵可以較好地解決玉米蛋白水解物目前加工中存在問題。玉米蛋白水解物通過發酵可以進一步分解其中的大分子蛋白，增強其生物活性，而且發酵過程中產生的風味物質可中和玉米蛋白水解物原有的苦味，使產品的口感更柔和，容易被消費者接受。隨著人們健康意識的增強，發酵產品的市場需求也在逐漸擴大，特別是益生菌發酵產品備受消費者的青睞。益生菌可以定殖于人體內，從多方面改善人體健康狀況，如促進營養物質的消化吸收、改善胃腸道菌群微環境、調節免疫力、抗氧化、減輕內毒素等[3]。乳酸菌是目前常被應用于食品工業中的益生菌，乳酸菌發酵可以提高食品的營養價值、抑制有害菌的繁殖[4]，改善原料的風味，如保加利亞乳桿菌可以去除牛奶的生臭味，并產生微弱的香味[5]，增強保藏性。乳酸菌常用的發酵形式主要是單一菌種發酵或混合菌種發酵[6]。與單一菌種發酵相比，混合菌種發酵更具優勢，一是益生菌活性更高，發酵效果更好，這是由于微生物之間可以相互利用代謝產物或交換信號分子，從而相互促進生物轉化，產生更好的發酵效果；二是復合的微生物菌群對外界環境更具耐受力[7]。在發酵乳的生產中常用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌協同發酵，菌株之間可以互利共生，在發酵過程中，可以利用彼此的代謝產物來促進各自的生長[8]。杭鋒等[9]發現混合乳酸菌間存在協同作用，互相促進，使得生長繁殖速度顯著增加，并且混合菌種發酵的產品酸度是單一菌種發酵的2 倍，同時還延遲了酸化現象。基于乳酸菌在發酵食品中的優點，科研人員對其發酵蛋白水解物的能力做了相關研究。Oliveira 等[10]發現酪蛋白酶解物對酸奶中嗜熱鏈球菌的生長具有明顯的促進作用。張根生等[11]研究發現含金屬硫的蛋白雞蛋水解物有利于動物雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌生長，且混合菌種發酵增殖效果優于單一菌種發酵。段旭昌等[12]利用乳酸菌發酵法改良甲魚蛋白酶解液的風味，發現大部分的苦味氨基酸被轉化，使甲魚酶解液的整體風味得到了明顯改善。方磊等[13]利用嗜酸乳桿菌制備發酵大豆蛋白肽，發現其能增強小鼠機體的免疫力和抗疲勞能力。目前，國內外關于乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的研究報道較少。

本研究利用課題組前期從野生果實表皮上篩選出的鼠李糖乳桿菌YY-15（LactobacillusrhamnoseYY-15）和發酵乳桿菌YY-16（LactobacillusfermentumYY-16）為發酵菌株，以玉米蛋白水解物為發酵原料，通過單因素試驗和響應面試驗優化發酵工藝參數，并對發酵后產品的氨基酸和抗氧化能力進行分析，旨在為玉米蛋白水解物在食品領域的開發和利用開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 菌種與樣品

鼠李糖乳桿菌（LactobacillusrhamnoseYY-15，保藏號CGMCC NO.26821）、發酵乳桿菌（LactobacillusfermentumYY-16，保藏號CGMCC NO.26822）：保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心；玉米蛋白水解物干粉：黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室自制。

1.2 主要試劑

MRS 肉湯培養基、MRS 固體培養基：北京索萊寶科技有限公司；果葡糖漿F55（55% 果糖，40% 葡萄糖，5% 低聚糖）：湖北千鳳香食品有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl radical，DPPH）、菲啰嗪：生工生物工程（上海）有限公司；硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸：天津市科密歐化學試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

恒溫培養搖床（ZWY-211B）：上海智城分析儀器制造有限公司；隔水式恒溫培養箱（GSP-9270MBE）：上海博迅實業有限公司；噴霧干燥器（B-290）：瑞士BUCHI公司；超凈臺（SW-CJ-2FD）：蘇凈安泰空氣技術有限公司；全自動高壓滅菌器（XS-500）：日本KAGOSHIMA公司；多功能酶標儀（EnSpire）：珀金埃爾默儀器有限公司；全自動氨基酸分析儀（1-8900）：日本日立公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種的活化

分別挑取1~2 環保藏的菌株YY-15 與YY-16 轉接于MRS 肉湯培養基中，37 ℃培養24 h。分別吸取0.1 mL 菌液至20 mL MRS 肉湯培養基中，37 ℃培養12 h，連續活化2~3 次，作為種子培養液，備用。

1.4.2 試驗工藝流程

CPH 干粉→溶解→添加碳源→滅菌→接菌→發酵→成品。

操作要點如下。

溶解：將CPH 和去離子水按一定料液比（g/L）進行混合。

滅菌：將CPH 溶液在121 ℃、30 min 條件下進行滅菌處理。

接菌：在無菌環境中，將活化后的菌株YY-15 與YY-16 按照一定體積比接種到玉米蛋白水解物溶液中，體系中初始活菌數約為106CFU/mL。

1.4.3 抗氧化活性的測定

抗氧化活性參考劉玥等[14]的方法，測定乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物發酵前后對DPPH 自由基、·OH、·O2-的清除能力和Fe2+螯合能力，并計算IC50值。

1.4.4 總酸的測定

根據Hu 等[15]的方法進行總酸測定，結果以乳酸計。

1.4.5 乳酸菌活菌數的測定

根據Hu 等[16]的方法進行乳酸菌活菌計數。

1.4.6 氨基酸的測定

采用全自動氨基酸分析儀，利用酸水解法測定氨基酸含量。

1.4.7 感官評價

感官評價小組由10 名食品專業人員組成，乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的感官評價標準見表1。

表1 乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standard of CPH fermented by lactic acid bacteria

1.4.8 單因素試驗

基礎發酵條件：菌株YY-15 與YY-16 體積比3∶1，玉米蛋白水解物濃度20%（質量體積比），接種量4%（體積分數），果葡糖漿添加量4%（體積分數），發酵溫度37 ℃，發酵時間24 h。

以乳酸菌發酵玉米蛋白水解物中的活菌數、總酸含量（以乳酸計）、感官評分以及DPPH 自由基清除能力（蛋白濃度1 mg/mL）為指標，分別對菌種體積比（1∶0、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、0∶1）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%）、果葡糖漿添加量（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%）、發酵時間（16、20、24、28、32、36、40、44、48 h）、發酵溫度（35、37、39、41、43 ℃）和CPH 濃度（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%）進行單因素試驗。

1.4.9 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，選取發酵溫度、接種量、CPH 濃度和果葡糖漿添加量為自變量，以乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物對DPPH 自由基清除能力為響應值，設計四因素三水平的響應面試驗。響應面試驗設計因素與水平見表2。

表2 響應面試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface test design

1.5 數據處理

利用Design-Expert version 8.0.6 軟件進行Box-Behnken 試驗設計。使用Office 2021 對數據及圖片進行處理，SPSS Statistics 20.0 對結果進行單因素方差分析（ANOVA），當P<0.05 時表明數據間存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物單因素試驗

2.1.1 菌種體積比對乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物的影響

在CPH 濃度20%、果葡糖漿添加量4%、接種量4%、發酵溫度37 ℃、發酵時間24 h 的發酵條件下，研究菌株YY-15 和YY-16 不同體積比對乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物影響，結果如圖1 所示。

圖1 菌種體積比對乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的影響Fig.1 Effect of strain ratio on CPH fermented by lactic acid bacteria

鼠李糖乳桿菌和發酵乳桿菌是食品發酵中常用的菌株，也是具有較強益生性和穩定遺傳性的益生菌[17]。在發酵食品中，乳酸菌表現出其重要發酵特性和生理功能的前提是完成菌體的大量增殖。因此，在乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物過程中，需將乳酸菌活菌數作為重要考察指標。

由圖1 可以看出，各試驗組在發酵24 h 后乳酸菌活菌數均能達到108CFU/mL 以上，表明菌株YY-15和YY-16 能夠較快適應玉米蛋白水解物的發酵環境，從而快速完成菌體增殖。與單一菌種發酵相比，混合菌種發酵中的乳酸菌活菌數均顯著提高（P<0.05）。當菌株YY-15 與YY-16 體積比為3∶1 時，發酵后乳酸菌活菌數達到最大值，為2.4×109CFU/mL，是菌株YY-15、YY-16 單一菌種發酵的3.73 倍和9.49 倍，可見，菌株YY-15 和YY-16 具有一定的共生性，可以相互促進生長。混合菌種發酵可以有效提高發酵液中水解酶的含量，并且彌補了單一菌種發酵產生胞外酶系不全面的缺點，對發酵基質營養轉化效率更高，提高發酵效率[18]。

本研究中鼠李糖乳桿菌和發酵乳桿菌具有相似的生長條件，其均能利用相似的底物進行發酵。尹彥洋等[19]研究了鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌的共生關系，發現兩株菌具有相似的生長條件，均能利用單糖進行發酵。鼠李糖乳桿菌的終端產物乳酸可以縮短嗜酸乳桿菌的發酵時間，嗜酸乳桿菌可降解蛋白質產生多種氨基酸，為鼠李糖乳桿菌提供氮源，說明二者具有良好的共生發酵能力。但是目前對于鼠李糖乳桿菌和發酵乳桿菌的相互作用機制報道較少。

鼠李糖乳桿菌屬于同型乳酸發酵菌株，其終產物大部分為L-乳酸，發酵乳桿菌是專性異型乳酸發酵菌株，代謝產物較為豐富，除乳酸外，還產生乙醇、乙酸和二氧化碳等其他物質[20]。Driehuis 等[21]最早將同型乳酸發酵和異型乳酸發酵兩類菌株結合使用，結果發現混合菌種發酵相比于布氏乳桿菌單獨發酵的乳酸含量明顯增加。本研究中，當菌株YY-15 與YY-16 體積比為3∶1 時，發酵24 h 后乳酸菌活菌數和總酸含量均達到最大值，顯著高于兩株菌單獨發酵的總酸含量（P<0.05），與Driehuis 等[21]報道結果一致。使用兩種類型的乳酸菌混合發酵，可以使其優勢結合，同型乳酸發酵菌可以控制前期發酵，抑制雜菌生長；專性異型乳酸發酵菌在發酵后期會產生更多的風味物質，賦予產品獨特的風味[22]，在感官評價結果中也驗證了這一說法，并且當菌株YY-15 與YY-16 體積比為3∶1 時，感官評分最高，為81.00。當菌種體積比為1∶1~1∶3 時，乳酸菌活菌數和總酸含量隨YY-16 添加量的增加而降低，這可能是由于YY-16 添加量過多，形成了優勢菌群，抑制YY-15 的生長，兩株菌的共生平衡被打破。綜合考慮，選擇鼠李糖乳桿菌YY-15 和發酵乳桿菌YY-16 菌種體積比為3∶1 進行后續的發酵試驗。

2.1.2 接種量對乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物的影響

在菌株YY-15 與YY-16 體積比為3∶1、CPH 濃度20%、果葡糖漿添加量4%、發酵溫度37 ℃、發酵時間24 h 的發酵條件下，研究不同接種量對乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物的影響，結果如圖2 所示。

圖2 接種量對乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on CPH fermented by lactic acid bacteria

由圖2 可知，隨著接種量的增加，乳酸菌活菌數和DPPH 自由基清除能力呈現先上升后下降的趨勢。原因可能是接種量過低，乳酸菌產生胞外酶分解底物的速率不能滿足乳酸菌大量增殖的需求；或是接種量過高，鼠李糖乳酸菌生長代謝旺盛，產生大量的乳酸，使發酵液pH 值迅速降低，抑制發酵乳酸菌的生長，延長發酵時間，最終導致乳酸菌活菌數和DPPH 自由基清除能力降低。當接種量為4% 時，乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的乳酸菌活菌數達到最大值，為1.15×109CFU/mL，同時，DPPH 自由基清除能力和感官評分也達到最大，與陳瑩艷[23]的研究結果相似。總酸含量隨接種量的增加呈先持續升高后趨于平緩的趨勢，當接種量大于5%后總酸含量略有下降，各組間無顯著性差異（P>0.05）。結合感官評分結果可知，總酸積累不足，發酵產品的口感寡淡，風味不明顯，難以掩蓋CPH 的苦味；總酸含量過高，亦會使發酵酸味過濃，影響其他風味，導致感官品質下降。綜合判斷，選取接種量3%、4%、5% 進行后續響應面優化試驗。

2.1.3 果葡糖漿添加量對乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物的影響

在菌株YY-15 與YY-16 體積比3∶1、CPH 濃度20%、接種量4%、發酵溫度37 ℃、發酵時間24 h 的發酵條件下，研究不同果葡糖漿添加量對乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物的影響，結果如圖3 所示。

圖3 果葡糖漿添加量對乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的影響Fig.3 Effect of fructose syrup addition on CPH fermented by lactic acid bacteria

微生物生長過程中，既需碳源作為活動能量，又要氮源構成自己的細胞結構。玉米蛋白水解物中可溶性肽含量高，可以滿足發酵氮源的需要。本研究中玉米蛋白水解物由于進行了去淀粉的處理，因此碳源含量較低，為保證發酵順利進行，需要補充碳源。果葡糖漿是一種發酵行業常用的碳源補充劑，由于其中含有不同比例的果糖、葡萄糖和低聚糖，將其應用于發酵食品中不僅可以補充碳源，還可以改善產品的口感和功能性。

由圖3 可以看出，隨著果葡糖漿添加量的增加，總酸含量和乳酸菌活菌數呈先上升后下降趨勢，均在果葡糖漿添加量為5% 時達到最高值。果葡糖漿添加量過少，乳酸菌生長所需能量不足，致使增殖能力下降，產酸過少，風味不足；果葡糖漿的滲透壓高于雙糖，添加過多則會導致細菌的細胞壁破裂，同時也會使酸甜比失調，口感過于甜膩。當果葡糖漿添加量為4%~6%時，乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的酸甜適中，質地均勻，無分層和沉淀，感官評分較高。DPPH 自由基清除能力的變化規律與乳酸菌活菌數呈正相關，原因可能是由于乳酸菌自身具有一定的抗氧化能力，乳酸菌的數量增加，從而增強了發酵液的抗氧化能力；或是由于乳酸菌數量增加，發酵液中的蛋白酶含量增加，使發酵底物水解速度加快，更多的寡肽游離出來，增強了發酵液的抗氧化能力。由圖3 可知，果葡糖漿添加量對DPPH 自由基清除能力的影響較小，但具有顯著性差異。綜合考慮，選取果葡糖漿添加量為4%、5%、6% 進行后續優化試驗。

2.1.4 發酵溫度對乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物的影響

在菌株YY-15 與YY-16 體積比為3∶1、CPH 濃度20%、接種量4%、果葡糖漿添加量5%、發酵時間24 h的發酵條件下，研究不同發酵溫度對乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物的影響，結果如圖4 所示。

圖4 發酵溫度對乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on CPH fermented by lactic acid bacteria

發酵溫度偏高或偏低都會導致細胞生長代謝速率下降，影響發酵速度和產酸能力，不利于乳酸菌的生長[24]。由圖4 可以看出，發酵溫度對乳酸菌活菌數的影響較大，當發酵溫度為35~39 ℃時，隨著發酵溫度的升高，乳酸菌活菌數顯著上升，并在發酵溫度為39 ℃時乳酸菌活菌數達到最大值，為9.8×108CFU/mL，繼續升高發酵溫度時，乳酸菌活菌數開始下降；總酸含量、DPPH 自由基清除能力與乳酸菌活菌數的變化規律相似。感官評分方面，除35 ℃和43 ℃時的感官評分較低外，發酵溫度在37~41℃范圍內的感官評分差異不顯著（P>0.05）。發酵乳桿菌可在45 ℃以內的發酵溫度下生長，其最適生長溫度為41~42 ℃，而鼠李糖乳桿菌的最適生長溫度為37 ℃，發酵溫度過高時細胞內酶的催化能力會大大降低，甚至會導致其喪失催化活性，從而影響菌株的正常生長[25]。綜合考慮，選取發酵溫度為37、39、41 ℃進行后續響應面優化試驗。

2.1.5 CPH 濃度對乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物的影響

在菌株YY-15 與YY-16 體積比為3∶1、接種量4%、果葡糖漿添加量5%、發酵溫度39 ℃、發酵時間24 h 的發酵條件下，研究不同CPH 濃度對乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物的影響，結果如圖5 所示。

圖5 CPH 濃度對乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的影響Fig.5 Effect of CPH concentration on CPH fermented by lactic acid bacteria

在發酵體系中，底物的濃度直接影響乳酸菌的發酵能力。與大分子蛋白相比，CPH 是經酶解后得到的小分子肽類和氨基酸的混合物，可以直接被乳酸菌利用，提高發酵效率。由圖5 可以看出，當CPH 濃度為20% 時，乳酸菌活菌數、感官評分、DPPH 自由基清除能力及總酸含量均達到最大值。且隨著CPH 濃度逐漸增大，各指標均呈現下降趨勢，這可能是由于過量的CPH 使菌體細胞內外滲透壓升高，致使菌體破裂，從而使乳酸菌活菌數減少。同時，反應體系的黏度增大，整體流動性降低，CPH 與乳酸菌的接觸面積變小，物質傳遞速率下降，降低代謝速率，也會導致DPPH 自由基清除能力、乳酸菌活菌數和總酸含量的下降。可見，適當濃度的CPH 具有促進乳酸菌生長的作用。目前，關于蛋白水解物促進乳酸菌生長可能的機制主要有：1）蛋白水解物作為氮源為益生菌的生長提供必需的氨基酸[26]。2）蛋白水解物可作為益生菌多肽轉運系統的促進劑，即蛋白質分子進入益生菌細胞前，先由胞外蛋白酶將其水解成短的多肽片段，才能被發酵菌株吸收利用[27]。3）蛋白水解物可以提高發酵菌株在酸性環境中的耐受力，保持菌體數量[28]。但不同的蛋白水解物對菌株生長的促進作用不同，潘芬等[18]研究發現，豌豆蛋白水解物對鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌未表現出促生長作用，而對保加利亞乳桿菌和雙歧桿菌等有明顯的促生長作用。玉米蛋白水解物不僅對發酵菌株有一定影響，對發酵產品的品質影響也較大。在較高的CPH 濃度下，發酵液顏色較深，極大地影響了產品的感官品質。綜合考慮，選取CPH 濃度為10%、20%、30% 進行后續響應面優化試驗。

2.1.6 發酵時間對乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物的影響

在菌株YY-15 與YY-16 體積比為3∶1、CPH 濃度20%、接種量4%、果葡糖漿添加量5%、發酵溫度39 ℃的發酵條件下，研究發酵時間對乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的影響，結果如圖6 所示。

圖6 發酵時間對乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的影響Fig.6 Effect of fermentation time on CPH fermented by lactic acid bacteria

發酵時間可以反映乳酸菌發酵的完全程度。發酵時間過短，導致發酵不充分，產品的風味不足；發酵時間過長，乳酸菌大量死亡，乳酸不斷累積，使產品口感刺激、品質下降[27]。由圖6 可以看出，在發酵過程中，乳酸菌在CPH 中長勢良好。乳酸菌活菌數在發酵48 h內，呈不斷上升的趨勢，總酸含量與乳酸菌活菌數表現出一致的變化趨勢。而DPPH 自由基清除能力則在發酵24 h 時達到最大值，為75.73%，之后一直呈下降趨勢。結合感官評分結果綜合考慮，選擇發酵時間24 h進行后續試驗。

2.2 乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物響應面優化試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，以DPPH 自由基清除能力（Y）為響應值，進行四因素三水平的響應面試驗，結果見表3，方差分析見表4。

表3 乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的響應面試驗結果Table 3 Response surface test results of CPH fermented by lactic acid bacteria

表4 回歸響應面模型方差分析Table 4 Variance analysis for regression response surface model

應用Design-Expert version 8.0.6 軟件對表3 數據進行多元回歸擬合，得到的二次多項回歸方程為Y=79.64+0.25X1+0.23X2+0.22X3+0.31X4-0.13X1X2+0.098X1X3+0.83X1X4-0.32X2X3-2.5×105X2X4-0.089X3X4-1.13X12-2.16X22-2.26X32-1.34X42。

由表4 可以看出，該方程的相關系數R2為0.905 5，說明模型擬合程度良好，可用于分析和預測。模型的F值為9.58，P<0.01，極顯著；失擬項P=0.151 0>0.05，不顯著；調整復相關系數R2Adj=0.810 9，說明該模型的回歸方程能夠反映實際情況，可以用回歸方程對試驗結果進行分析和預測。一次項X1（發酵溫度）、X2（接種量）、X3（CPH 濃度）和X4（果葡糖漿添加量）影響不顯著；二次項X12、X22、X32、X42均處于極顯著水平，說明其對響應值的影響較大；交互項X1X4處于顯著水平，說明發酵溫度和果葡糖漿添加量之間存在交互作用，且對DPPH 自由基清除能力的影響較大。

經Design-Expert version 8.0.6 軟件工藝優化，最優發酵工藝參數為發酵溫度39.34 ℃、接種量4.04%、CPH濃度20.45%、果葡糖漿添加量5.16%，模型預測此條件下的DPPH 自由基清除能力可達79.69%。結合實際情況，將優化后的方案適當調整為發酵溫度39.5 ℃、接種量4%、CPH 濃度20.50%、果葡糖漿添加量5%，在此條件下進行驗證試驗，3 次驗證試驗得到的DPPH自由基清除能力為80.89%，總酸含量為55.65 g/L，乳酸菌活菌數為2.66×109CFU/mL，感官評分為89.5，與預測值較為接近，說明模型預測準確度較高，利用響應面分析優化乳酸菌發酵工藝是可行的。

2.3 乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物對氨基酸種類及其含量的影響

氨基酸種類及其含量與成品的風味、營養和感官品質相關。乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物發酵前后的氨基酸含量結果如表5 所示。

表5 乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的氨基酸含量Table 5 Amino acid content of CPH fermented by lactic acid bacteria

由表5 可以看出，乳酸菌協同發酵玉米蛋白水解物發酵前后均檢測到16 種氨基酸，其中發酵前的總氨基酸含量為76.48 g/100 g，發酵后的總氨基酸含量為58.00 g/100 g，經乳酸菌發酵后總氨基酸含量下降了24.16%。大部分乳酸菌具有多種氨基酸營養缺陷性，在發酵過程中，乳酸菌分泌的胞外蛋白酶會水解原料中的蛋白質和多肽，產生氨基酸，滿足乳酸菌的生長代謝，保障發酵的順利進行[28]。蘇能能等[29]利用植物乳桿菌發酵桑葚漿，其游離氨基酸總量下降了78.30%。但雙歧桿菌發酵的果汁中，與發酵前相比，各游離氨基酸含量均有提升[30]，可見游離氨基酸的代謝規律與菌種有著密切的關系。總氨基酸含量的減少還與揮發性成分有關。氨基酸可進一步通過轉氨、脫羧、裂解等轉化為醛類、醇類等風味物質[31]。根據乳酸菌的代謝作用，氨基酸可以形成發酵產品的風味前體物質，從而賦予發酵液特殊的發酵香味。李汴生等[32]研究發現，5 種果蔬汁經發酵后游離氨基酸總量減少，揮發性風味物質種類及醇酯類物質含量增加，說明在發酵過程中發生了氨基酸降解，這也是產生風味物質的重要途徑。

2.4 體外抗氧化能力結果分析

氧化作用是自然界普遍發生的化學反應，在生物體中起著重要作用。生命活動的氧化代謝過程伴隨著自由基的產生，如羥自由基、超氧陰離子自由基等。雖然人體有抗氧化防御系統，但這些系統并不能完全有效地抵御或修復氧化損傷，如果不及時清除自由基，則會對機體造成傷害，引發疾病[33]。因此，具有高抗氧化活性的食品受到人們的高度重視，體外抗氧化能力的測定已成為評價功能食品的重要指標之一。乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的體外抗氧化活性見表6。

表6 乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的體外抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of CPH fermented by lactic acid bacteria in vitro

如表6 所示，乳酸菌發酵玉米蛋白水解物發酵前后均能夠有效清除DPPH 自由基、·OH、·O2-和提高Fe2+螯合能力。發酵前玉米蛋白水解物的DPPH 自由基清除能力、·OH 清除能力、·O2-清除能力、Fe2+螯合能力的IC50值分別為0.460、0.306、13.728、3.165 mg/mL；發酵后的DPPH 自由基清除能力、·OH 清除能力、·O2-清除能力、Fe2+螯合能力的IC50值分別為0.227、0.200、12.851、1.856 mg/mL。 與發酵前相比，分別提高了50.65%、34.64%、6.41%、41.36%，說明玉米蛋白水解物經過乳酸菌發酵相較于發酵前具有更好的抗氧化活性。

崔寧等[34]研究表明，玉米蛋白水解物是良好的供氫體，也是Fe2+螯合劑，能通過抑制芬頓（Fenton）反應而減少羥基的生成，提高對自由基的清除能力，從而消除自由基對機體造成的氧化損傷。乳酸菌在細胞呼吸過程和生存環境中會產生過多的活性氧，而乳酸菌抵抗氧脅迫的能力較弱。過量的活性氧和自由基會攻擊蛋白質、脂肪和核酸，從而加速微生物的衰老和死亡[35]。玉米蛋白水解物具有較強的抗氧化能力和自由基清除能力，可以幫助乳酸菌在發酵過程中抵抗氧脅迫，為其提供良好的生長環境，結果表明，玉米蛋白水解物有利于乳酸菌的生長代謝。

乳酸菌通過螯合Fe2+來阻止脂質過氧化生成·OH，從而降低脂質化合物氧化的速度。Li 等[36]對瑞士乳桿菌的胞外多糖探究，發現其表現出較強的Fe2+螯合能力，IC50值可達1.45 mg/mL。乳酸菌發酵玉米蛋白水解物具有良好的金屬螯合能力，可以減少·OH 的產生，抑制過氧化物的產生。同時，乳酸菌發酵玉米蛋白水解物經過發酵后暴露出能提供電子的氨基酸和小肽，這些小分子化合物更容易與自由基結合，隨著具有抗氧化活性的小分子肽濃度的增加，與自由基結合的機會變大，因此乳酸菌發酵玉米蛋白水解物對自由基的清除能力逐漸提高。乳酸菌在發酵過程中會產生超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）來清除·OH 和H2O2，而SOD 能直接降低活性氧自由基的毒性，并阻止活性氧自由基向·OH轉變[37]。劉洋等[38]對發酵乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌和瑞士乳桿菌4 株乳酸菌的體外抗氧化能力測定發現，乳酸菌清除·OH 的活性物質主要存在于菌體細胞表面以及代謝產物中而非胞內。除此之外，乳酸菌可以分泌阿魏酸酯酶（ferulic acid esterase，FAE），它能夠促進植物細胞壁中阿魏酸（ferulic acid，FA）的生成，FA 是一種強抗氧化劑[39]。總之，乳酸菌發酵玉米蛋白水解物抗氧化能力提升的原因是多種抗氧化物質的綜合作用。

3 結論

本研究利用鼠李糖乳桿菌和發酵乳桿菌協同發酵玉米蛋白水解物，通過單因素和響應面試驗優化其發酵工藝，得到最佳發酵工藝參數為YY-15∶YY-16=3∶1（體積比），CPH 濃度20.50%，接種量4%，果葡糖漿添加量5%，發酵溫度39.5 ℃，發酵時間24 h，在此條件下，乳酸菌發酵玉米蛋白水解物的DPPH 自由基清除能力為80.89%，總酸含量為55.65 g/L，乳酸菌活菌數為2.66×109CFU/mL，感官評分為89.5。在發酵過程中，玉米蛋白水解物能為乳酸菌提供低氧脅迫環境，有利于乳酸菌的生長。并且鼠李糖乳桿菌和發酵乳桿菌混合發酵可以相互促進，菌體增殖效果優于單一菌株發酵。乳酸菌發酵可明顯提升玉米蛋白水解物的抗氧化能力，并可以促進氨基酸的轉化，降低苦味氨基酸的含量，增強了產品的功能性和品質。