基于滲透汽化膜分離技術制備無核白葡萄烈酒原酒的工藝優化及其安全性分析

黎進雪，王丁怡，武運 ，蒲富娟，張文昊，尹麗萍，達菊慶，李寧，黨國芳，方川川

（1.新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.石河子工程職業技術學院，新疆 石河子 832000；3.新疆中信國安葡萄酒業有限公司，新疆 昌吉州 832299）

新疆因其地域、日照等相關原因，葡萄豐饒，其中吐魯番地區90% 以上的葡萄種植品種都為無核白葡萄，在葡萄集中產區中位列全國第一[1]。吐魯番無核白葡萄鮮果糖度很高、口感優質，是鮮食葡萄中的佳品。但其主要銷售渠道為干果及鮮果加工，但干果生蟲率較高，而鮮果掉粒較多，且鮮食葡萄自身有著不耐長途貯運的特性[2]，并且相關產品的可選擇性較多，造成鮮食葡萄在上市期間市場上出現供過于求的現象，從而使得鮮食無核白葡萄產量過剩，出現大幅度浪費，這嚴重制約了吐魯番地區葡萄產業蓬勃向上發展[3]。因此，采用質量較優的無核白葡萄進行釀造研究，不僅是酒類市場新產品的需要，也對提高無核白葡萄附加值及促進吐魯番地區葡萄產業快速發展具有重大意義。

滲透汽化膜分離技術作為近40 年發展起來的一項高新技術[4]，它具有符合現代生產業發展需要的條件，即節能、優質、無污染等。膜是具有選擇性分離功能的材料[5]，利用膜的選擇透過性可代替傳統蒸餾工藝，富集酒精、提高酒度以達到高度酒的生產標準。李天宇等[6]表示，在白酒的基酒處理中，滲透汽化膜將會表現出更多的應用潛力，為酒企業解決實際生產問題。譚淑娟[7]也對滲透汽化膜在發酵酒脫醇過程中的應用進行了研究。曾里等[8]使用新型硅橡膠復合膜分離干紅葡萄酒時，發現滲透汽化膜對乙醇的通透量影響極大，乙酸乙酯、異戊醇等醇類、酯類物質也能較好地通過，這表明膜滲透汽化技術是一項全新的分離葡萄酒方法。

隨著人們生活水平的提高，大眾選擇酒類逐漸從性價比轉換到安全性，故需對高度酒的安全性進行深入研究，葡萄酒中的氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、生物胺（biogenic amines，BA）[9]都制約著葡萄酒行業的健康蓬勃發展，全莉等[10]通過監測葡萄酒釀造及貯藏過程OTA 的變化規律，探究OTA 對新疆葡萄酒品質的影響，結果表明在白葡萄酒釀造過程中OTA 含量呈顯著下降趨勢。鄧玉杰等[11]通過對新疆不同地區生產的葡萄酒中8 種BA 含量進行測定，結果表明和田地區葡萄酒中總生物胺含量最少，為新疆地區葡萄酒中BA 的安全品質控制提供依據。鄒彎等[12]對貯存過程中EC 含量變化進行了研究，并建立了預測貯存過程中EC 含量的方程。

因此，本研究以無核白葡萄為原料，經發酵、富集得到無核白葡萄烈酒，并通過相關安全性檢測試驗，保障無核白葡萄烈酒的安全性，證明滲透汽化膜技術可適用于釀酒行業，以期為無核白葡萄加工發展新途徑、革新釀酒工藝提出科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無核白葡萄（初始糖度219.5 g/L，總酸4.7 g/L）：市售；釀酒酵母、白佳釀酵母：意大利愛賽科有限公司；焦亞硫酸鉀：天津名人生物科技有限公司；果膠酶RF（果膠酶ROHAVIN Flash，酶活力8 600 U/g）：法國拉氟德公司；甲醇、叔戊醇、赭曲霉毒素A（純度均≥99%）、組胺鹽酸鹽、β-苯乙胺鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽、色胺鹽酸鹽（純度均>99%）、腐胺鹽酸鹽、尸胺鹽酸鹽、1，7-二氨基庚烷（純度均>98%）、亞精胺鹽酸鹽、章魚胺鹽酸鹽、精胺鹽酸鹽（純度均>97%）、冰乙酸、乙腈（均為色譜純）：四川省維克奇生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

VELO/DPC-200 氣囊壓榨機：意大利velp 公司；PDMS 商用復合膜：南京九思高科技有限公司；LC40 高效液相色譜儀、GC-2030 氣相色譜儀：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 無核白葡萄凈汁的制備

鮮食無核白葡萄經清洗、除梗、壓榨取汁，分別添加0.02 mL/L 果膠酶RF、0.05 g/L 偏重亞硫酸鉀，低溫澄清24 h，得到鮮食無核白葡萄凈汁，進行后續試驗。

1.3.2 單因素試驗設計

以無核白葡萄為原料，通過單因素試驗分別研究初始糖度、發酵溫度、酵母添加量對無核白葡萄烈酒原酒酒精度的影響。單因素試驗因素及水平見表1。

表1 單因素試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of single factor test

1.3.3 響應面試驗設計

在單因素試驗結果基礎上，進行三因素三水平的響應面試驗，以酒精度為響應值，確定無核白葡萄烈酒原酒的最佳工藝參數。響應面試驗因素與水平見表2。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface test

1.3.4 基本理化指標測定

酒精度根據GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》進行測定[13]；總酸含量根據GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定[14]；微生物檢測參照戴奕杰[15]方法進行測定。

1.3.5 無核白葡萄烈酒的制備

滲透汽化膜生產無核白葡萄烈酒工藝見圖1。

圖1 滲透汽化膜生產無核白葡萄烈酒工藝Fig.1 Process of producing seedless white grape spirit by pervaporation membrane

第一階段：利用分離膜，將無核白葡萄原酒在合適的溫度和分離時間條件下進行分離，酒精、部分水及揮發性香氣成分透過膜富集，在低真空狀態下汽化，通過冷凝收集得到酒精濃度明顯提升的滲透液，即酒精度較高的葡萄烈酒。進料溫度：45 ℃；運行時間：12 h；原料循環泵流量為48 m3/h；膜上游側原料循環系統壓力≤0.3 MPa；膜下游真空系統壓力為5 kPa；載冷劑溫度：-10~-15 ℃。

第二階段：繼續利用分離膜，對第一階段的滲透液進行分離，膜的透過側最終富集得到高酒精度的無核白葡萄烈酒。進料溫度：45 ℃；運行時間：12 h；原料循環泵流量為20 m3/h；膜上游側原料循環系統壓力≤0.3 MPa；膜下游真空系統壓力為2 kPa；載冷劑溫度：-10~-15 ℃。

1.3.6 無核白葡萄烈酒安全性測定

1.3.6.1 甲醇含量的測定

根據GB 5009.266—2016《食品安全國家標準食品中甲醇的測定》[16]中的方法進行測定。

1.3.6.2 重金屬殘留-鐵離子含量的測定

根據GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[14]中的方法進行測定。

1.3.6.3 生物胺含量的測定

根據GB 5009.208—2016《食品安全國家標準食品中生物胺的測定》[17]中的方法進行測定。

1.3.6.4 赭曲霉毒素A 含量的測定

根據GB 5009.96—2016《食品安全國家標準食品中赭曲霉毒素A》[18]中的方法進行測定。

1.3.6.5 氨基甲酸乙酯含量的測定

根據GB 5009.223—2014《食品安全國家標準食品中氨基甲酸乙酯的測定》[19]中的方法進行測定。

1.4 數據處理

采用Excle 2019 進行相關數據統計；運用Origin 95繪制數據圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

不同酵母添加量、初始糖度、發酵溫度對無核白葡萄原酒發酵過程中酒精度的影響見圖2。

圖2 酵母添加量、初始糖度、發酵溫度對無核白葡萄烈酒原酒發酵過程中酒精度的影響Fig.2 Effect of yeast addition，initial sugar content，and fermentation temperature on alcohol content of raw seedless white grape wine during fermentation

由圖2A 可知，酒精度與酵母添加量呈正比，酵母添加量增加，發酵周期則縮短，酒精轉化量增大；若酵母添加量持續增加，酒精轉化量增加不明顯，且酵母整體風味較為明顯，干白特有口感降低，故確定酵母添加量為0.2、0.3、0.4 g/L 進行后續響應面試驗；由圖2B 可知，隨著發酵溫度升高，酒精轉化量增加，且發酵時長縮短，但酒精度上升逐步平緩，16 ℃與20 ℃發酵下的酒精轉換量差異較小，且發酵溫度在20 ℃時，酒體因為溫度過高會損失部分干白的特別香氣，導致風味、口感較差，故確定發酵溫度為14、16、18 ℃進行后續響應面試驗；由圖2C 可知，初始糖度越高，酒精產量越高，糖度在27 °Brix 時酒精度最高，但過高糖度會影響酵母生長，使發酵滯留或暫停發酵，造成發酵周期過長，故確定初始糖度為21、23、25 °Brix 進行后續響應面試驗。

2.2 無核白葡萄烈酒發酵條件的優化

2.2.1 響應面試驗設計與結果

由單因素試驗結果綜合考量，選擇使用酵母添加量（A）、發酵溫度（B）、初始糖度（C）作為自變量，使用無核白葡萄烈酒原酒的酒精度（Y）作為響應值，響應面試驗設計結果見表3。

表3 無核白葡萄發酵條件響應面試驗設計結果Table 3 Response surface design results of seedless white grape fermentation conditions

經多元回歸方程擬合，建立以鮮食無核白葡萄烈酒原酒的酒精度為評價指標的擬合方程：酒精度（Y）=11.82+0.5A+0.48B+0.54C-0.2AB-0.075AC+0.1BC-0.22A2-0.45B2-0.67C2。對該回歸方程進行方差分析，結果見表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

由表4 可以看出，多元回歸模型F=21.99，P<0.01，該模型極顯著；失擬項F=5.83，P>0.05，失擬項不顯著，表明各因素（A、B、C）與響應值（Y）之間存在較為良好的線性關系；決定系數R2=0.965 8，校正系數R2Adj=0.921 9，不能被該回歸方程解釋的變異不到1%，說明回歸方程擬合度較為優異，能夠較為準確地對響應值（酒精度）進行分析預測。對表4 進行結果分析，可以看出模型中一次項A、B、C以及二次項B2、C2影響極顯著（P<0.01），表明三因素與響應值之間存在較為復雜的線性關系，且根據三因素的F值可知，各因素對響應值（酒精度）的影響順序為A>C>B，即酵母添加量對無核白葡萄烈酒原酒的酒精度影響最大，其次是初始糖度，發酵溫度對無核白葡萄烈酒原酒的影響最小。由交互項的F值可以看出，AC及BC影響無核白葡萄烈酒原酒酒精度的交互作用小于AB。

2.2.2 響應面分析

為驗證兩因素交互作用對響應值的影響[20]，各因素間三維響應面及等高線見圖3。

圖3 各試驗因素交互作用的響應面和等高線Fig.3 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors

由圖3 可知，各單因素均對響應值產生影響，且響應值隨著因素水平的上升，呈先上升后逐步下降的趨勢。且發酵溫度和初始糖度的響應面坡度較小，等高線趨于圓形，說明兩者之間的交互作用相對較小，對響應值的影響較小。

2.2.3 響應面驗證試驗

通過使用Design Expert V8.0.6 軟件優化回歸方程中發酵工藝參數，確定無核白葡萄烈酒原酒的最佳工藝：酵母添加量0.4 g/L、初始糖度23.74 °Brix、發酵溫度16.7 ℃。此條件下，預測無核白葡萄烈酒原酒的酒精度為12.318% vol。為保證試驗的可實施性，調整工藝條件為酵母添加量0.4 g/L、發酵溫度17 ℃、初始糖度24 °Brix，并重復試驗3 次，最終得出無核白葡萄烈酒原酒的酒精度為12.2% vol。通過滲透汽化膜分離技術，得到的無核白葡萄烈酒酒精度為53% vol，得出結果與預測結果基本吻合，表明該模型可用于無核白葡萄烈酒原酒發酵工藝參數的預測。

2.2.4 無核白葡萄烈酒的理化指標結果分析

無核白葡萄烈酒各項指標：細菌總數≤40 CFU/mL；大腸桿菌≤3 MPN/100 mL；酒精度53% vol，總酸含量0.28 g/L；未檢出致病菌，符合國家標準。

2.2.5 無核白葡萄烈酒安全性測定結果分析

2.2.5.1 無核白葡萄烈酒中甲醇、Fe3+含量分析

通過對無核白葡萄烈酒原酒，以及滲透汽化膜一次及二次過膜酒樣（無核白葡萄烈酒）中的甲醇及Fe3+進行定量分析和安全性評估，結果如表5 所示。

表5 無核白葡萄烈酒原酒及烈酒中甲醇、Fe3+含量Table 5 Content of methanol and Fe3+ in raw seedless white grape wine and its spirits mg/L

由表5 可知，原酒中的甲醇含量低于無核白葡萄烈酒，表明滲透汽化膜對甲醇分子具有較好的選擇透過性。參考GB 2757—2012《食品安全國家標準蒸餾酒及其配制酒》[21]中相關規定，水果蒸餾酒中的甲醇含量≤2 g/L，即遠大于無核白葡萄烈酒的甲醇含量，故無核白葡萄烈酒原酒及烈酒均符合國家相關限量標準。葡萄酒中含有適量的金屬元素會對人體產生較好的保護機制，過量則會在酒中與其他物質產生絡合反應，讓酒體產生渾濁和沉淀，影響酒的色澤和口感。金屬元素以鐵和銅為主，且鐵所導致的鐵破敗病更容易出現[22]，故葡萄酒中的Fe3+關系著酒體的品質問題。GB/T 15037—2006《葡萄酒》[23]中對Fe3+有明確要求，葡萄酒中Fe3+含量應低于8 mg/L。由表5 可知，無核白葡萄烈酒原酒及烈酒中Fe3+含量均符合國家標準，且通過滲透汽化膜一次富集及二次富集，Fe3+的含量逐步下降，這可能是Fe3+無法通過滲透汽化膜孔徑所導致。

2.2.5.2 無核白葡萄烈酒中生物胺含量分析

對無核白葡萄烈酒原酒、滲透汽化膜一次過膜酒樣及二次過膜酒樣（即無核白葡萄烈酒）中的9 種BA進行定量分析和安全性評估，結果如表6 所示。

表6 無核白葡萄原酒及烈酒中BA 檢測結果Table 6 Test results of BA in raw seedless white grape wine and its spirits mg/L

由表6 可知，尸胺、組胺、酪胺、精胺在3 種酒樣中均為檢出，腐胺只在烈酒原酒中檢出，其余4 種生物胺均有檢出。經過滲透汽化膜一次富集、二次富集后，色胺整體呈小幅增加趨勢，苯乙胺、章魚胺經過一次過膜、二次過膜呈較大幅度的下降趨勢，亞精胺的變化趨勢不明顯，這可能是因為滲透汽化膜對大分子物質的透過性較低。組胺在BA 中毒性最強，多國已經對葡萄酒中的組胺設立了明確的限量標準（法國規定葡萄酒中的組胺含量≤8 mg/L，澳大利亞和瑞士≤10 mg/L）[24]，3 種樣品中均為檢出組胺，故應用滲透汽化膜分離技術釀制無核白葡萄烈酒的安全性較高。

2.2.5.3 無核白葡萄烈酒中赭曲霉毒素A、氨基甲酸乙酯含量分析

對無核白葡萄烈酒原酒、滲透汽化膜一次富集及二次富集（無核白葡萄烈酒）中的OTA、EC 進行定量分析和安全性評估，檢測結果如表7 所示。

表7 無核白葡萄烈酒原酒及烈酒中OTA 及EC 檢測結果Table 7 OTA and EC test results of raw seedless white grape wine and its spirits μg/L

由表6 可知，3 種樣品中無核白葡萄烈酒未檢測出OTA，烈酒原酒及一次過膜酒樣中OTA 含量也較低。國際葡萄與葡萄酒組織（International Organization of Vine and Wine，OIV）規定，葡萄酒中OTA 的限量標準為2.0 μg/kg[25]，在GB 2761—2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》[26]中也有明確規定，OTA 含量不得超過2.0 μg/kg，無核白葡萄烈酒原酒及烈酒中OTA 含量均未超過相關限量標準。3 種樣品中均檢測出EC，且通過滲透汽化膜分離技術制備的無核白葡萄烈酒與烈酒原酒相比，含量下降明顯。加拿大對酒類中的EC 含量做了較為清晰的規定[27]，即葡萄酒中EC 質量濃度<30 μg/L、水果白蘭地EC 質量濃度<500 μg/L，因此，無核白葡萄烈酒原酒及烈酒EC 含量均未超過限量標準。

3 結論

為得到優質的無核白葡萄烈酒原酒以及無核白葡萄烈酒，本文通過單因素及響應面試驗優化鮮食無核白葡萄的發酵工藝，得出發酵無核白葡萄的最優條件為酵母添加量0.4 g/L、發酵溫度17 ℃、初始糖度24 °Brix，其原酒酒精度為12.2% vol。通過滲透汽化膜分離技術富集后，烈酒酒精度為53% vol。同時，對滲透汽化膜分離技術制備的無核白葡萄烈酒進行安全性分析，各指標均未超過相關限量標準，安全性較高。表明滲透汽化膜分離技術可用于高度酒的生產，是較為優秀的綠色工藝。未來應對滲透汽化膜分離技術制備的烈酒進行香氣及感官評價，深入了解此工藝制備的高度酒的品質，為滲透汽化膜分離技術的應用提供參考。