miR-421靶向調控Menin/Caspase-3影響抑郁癥的機制

劉永輝 譚慶晶 陳清 韋理萍 楊俊威 楊侃 高玉廣

廣西中醫藥大學第一附屬醫院 1腦病科，2康復科，4急診科 （南寧 530023）；3廣西中醫藥大學 （南寧 530001）

抑郁癥是臨床常見的精神障礙性疾病，以心境低落、興趣與偷快感喪失、易疲勞等為主要臨床表現。研究顯示，全球共有3.22億人患抑郁癥，占全世界總人口的4.4%，2020年，其疾病負擔占全球疾病負擔的7.5%，僅排在缺血性心臟病之后，居全球非致命性疾病之首［1-2］。目前抑郁癥的臨床治療主要以西藥治療為主，約有1/3的患者西藥治療無效［3］，20%～40%患者不能顯著緩解病情，且調整用藥仍難以奏效，并經歷病情的反復，漸而加重病情，致使部分患者走向自殺的道路［4-5］。微小RNA（microRNA，miRNA）屬于非編碼RNA（non-codingRNA，ncRNA）中的一種［6］，它具有微調多種不同分子過程的潛力［7］，參與了包括神經系統中的炎癥反應、神經細胞凋亡、樹突生長、突觸重塑、膠質細胞增生等多個抑郁癥生物學過程［8-9］。miRNA不僅可以輔助診斷抑郁癥，還可以預測藥物反應和評估疾病的預后［10］。研究表明，miR-421可通過誘導癌細胞凋亡抵抗而使腫瘤消退，而Menin作為miR-421的靶標，過表達Menin可逆轉miR-421的神經凋亡作用［11］。另有研究發現，Menin蛋白及其下游因子Caspase-3在抑郁小鼠海馬組織中為低表達，抑制Menin、Caspase-3的表達會誘導抑郁樣行為的發生［12-13］。由此，推測miR-421可通過調控Menin、Caspase-3的表達而影響抑郁癥的相關機制。為此，本研究擬開展動物實驗，探究miR-421影響抑郁癥的相關機制，為臨床治療抑郁癥提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取等級為SPF級，日齡為2月齡，品種為SD 健康雄性大鼠，共96只（模型組78只，對照組18只），體質量為（200±20）g，實驗動物來源于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（合格證號SCXK（湘）2019-0004），本實驗已通過動物倫理審查（倫理審核編號 DW20210610-088），實驗在廣西中醫藥大學動物實驗中心開展。

1.2 抑郁大鼠模型的建立隨機取78只大鼠構建抑郁模型。本研究采用腹腔注射脂多糖建立抑郁大鼠模型［14］，將脂多糖與生理鹽水配制成濃度為0.5 mg/mL的溶液，單次給予大鼠腹腔注射劑量為0.83 mg/mg，采用糖水偏好度測試和曠場實驗檢測大鼠的抑郁行為。（1）糖水偏好度測試：將大鼠單籠飼養，提前20 h禁食禁水。準備飲用水和蔗糖水各一瓶，并分別稱重。禁食禁水環節結束后，同時將兩瓶液體插在鼠籠上給大鼠飲用。1 h后，將兩瓶液體中的剩余部分分別進行稱量，并計算出前后的差值，即為，用飲用的蔗糖水量除以飲用的的總液體量，得到的值就是大鼠的糖水偏好度。（2）曠場實驗（OFT）：將大鼠置于一大小為50 cm× 50 cm × 40 cm、底部黑色、四壁為白色的塑料測試箱內，利用ANY-MAZE采集軟件采集實驗數據，測試前設定好實驗參數，設定采集時間為5 min，記錄大鼠進入中央區得次數、中央區的逗留時間和大鼠在箱內的總靜止時間。為排除影響實驗結果的干擾因素，每只大鼠結束實驗后，均需要清除其排泄物，且測試箱的箱底和四壁均要使用75%的酒精進行擦拭，待消毒酒精揮發晾干后再進行下一次測試。

1.3 高通量測序隨機取3只抑郁模型大鼠與3只對照組大鼠，使用1 %的戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射進行麻醉，待大鼠完全麻醉后，進行開胸，繼而剪開右心耳，左心室灌注生理鹽水，隨后剪開頭骨，取出腦組織，將腦組織置于冰塊上，快速操作分離出海馬組織，研磨成漿液后，使用TRizol（Thermofish-er，China，item number：1218355）進行處理，接著使用miR-Neasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）分離RNA。將擴增后的miRNA與Illumina表達譜微陣列進行雜交，使用cyanine 3熒光標記引物，再次進行擴增、變性，然后與miRNA微陣列雜交，在45～60 ℃的溫度下孵育，最后用激光激發成像，使用i Scan系統對熒光強度進行定量成像，進行表達分析。測序以P＜0.05，|log2FC| ≥ 1抑郁為篩選條件，以對照組為參照，篩選到差異表達的miRNAs［15］。

1.4 干預和分組將抑郁組剩余的75只大鼠再隨機分為5組，每組15只。分別是∶模型組（腹腔注射脂多糖0.83 mg/mg）、miR-421過表達組、miR-421抑制組、Menin過表達組、Menin抑制組。miR-421抑制組和過表達組采用目的基因重組腺病毒載體（上海齊源生物科技有限公司，No：GMDV0264532）進行干預，用法為每周進行2次干預，一共進行3周，最終使大鼠體內的目的基因發生抑制或者過表達反應。

1.5 各組大鼠體質量變化記錄造模前后各組大鼠的體質量值，并計算兩者的差值，以此來反映大鼠的食欲變化。

1.6 目標miRNA靶基因預測運用TargetScan數據庫（http：//www.targetscan.org/）和miRDB數據庫（http：//mirdb.org/）進行miR-421下游靶基因的預測，以保證后續研究分析的順利進行。

1.7 RNA提取與反轉錄聚合酶鏈反應造模后7 d，處死大鼠，分離出大鼠的海馬組織，部分用4%多聚甲醛保存以進行免疫組化染色，部分使用Trizol研磨以檢測miR-421、Menin、Caspase-3mRNA水平。海馬組織經研磨后，參照qPCR試劑盒說明書進行實驗。反應體系20 μL：cDNA 1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×Mix 10 μL，ddH2O 8.0 μL。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，62 ℃45 s，40個循環［16］。采用2-ΔΔCt法計算miR-421、Menin、Caspase-3mRNA水平。引物序列如下表所示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.8 細胞培養及轉染將PC12細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司，PM150210B）加入含10%胎牛血清，置于DMEM培養基中，在條件為5% CO2和37 ℃的培養箱中進行培養。通過TargetScan數據庫分析得到Menin為miR-421的下游靶點基因之一，使用Lipofectamine 2000轉染試劑盒，將Menin過表達載體或陰性對照序列轉染至神經元細胞中。24 h后，收集各組細胞進行下一步的實驗。

1.9 熒光素酶報告基因實驗通過TargetScan數據庫分析得到Menin為miR-421的下游靶點基因之一，構建插入熒光素酶的野生型與突變型Menin質粒，并將野生型與突變型Menin質粒分別與miR-421模擬物或陰性對照共轉染入PC12細胞中，在加入10 ng海腎熒光素酶測定海腎熒光素酶活性。48 h后，收獲細胞并裂解，最后運用雙熒光素酶報告分析系統（Promega）檢測熒光素酶活性。

1.10 免疫印跡法（Western blot）檢測取大鼠海馬組織置于1.5 mL離心管中，電動組織研磨棒進行組織研磨，進入蛋白裂解液，裂解5 min后于4 ℃，1 000 r/min，離心10 min，去沉淀組織，留取上清液。測出各樣本的蛋白質濃度。然后電泳，分離膠濃度8%，每泳道加入50 μg白樣品。待溴酚藍到達分離膠底部后，進行轉膜。轉膜完成后將PVDF膜后置于含5%脫脂奶封閉液室溫封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜。次日用WB洗滌液洗PVDF膜3次后，加入二抗，室溫孵育1 h。WB洗滌液洗PVDF膜3次后加入3 mL化學發光溶液（ECL），隨即進行光敏膠片顯像。用Imag J圖像分析系統測定信號的灰度值［17］。

1.11 統計學方法采用SPSS 23.0統計軟件進行統計分析，計量資料以（）表示，統計分析前進行數據正態分析及數據方差齊性檢驗，若各組數據為正態分布且各組數據方差齊，則可進行統計分析比較。兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，三組及以上比較采用單因素方差分析；若不符合其中一項，則用非參數檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠的抑郁行為及體質量改變抑郁行為方面，對照組大鼠自主活動正常、精神狀態正常、飲食正常、自由活動正常。造模后，抑郁組大鼠出現表情淡漠、雙眼無神、喜歡獨處、活動減少等抑郁行為。各組大鼠體質量方面，造模前，各組大鼠的體質量差異無統計學意義（P＞0.05）；造模后，與對照組比較，模型組大鼠的體質量顯著減輕（P＜0.001）；與模型組相比，miR-421抑制組、Menin過表達組大鼠體質量顯著升高（P＜0.001），miR-421過表達組、Menin抑制組大鼠體質量明顯減輕（P＜0.001）。見表2。

表2 各組大鼠體質量變化Tab.2 Changes in body mass of rats in each group ±s，g

表2 各組大鼠體質量變化Tab.2 Changes in body mass of rats in each group ±s，g

注：與對照組相比，ΔΔΔP＜0.001；與模型組相比，***P＜0.001

組別對照組模型組miR-421過表達組miR-421抑制組Menin過表達組Menin抑制組造模后227.21±5.57 196.23±5.69ΔΔΔ 186.07±3.78***226.87±5.82***226.91±4.89***186.12±4.51***造模前210.40±6.69 209.83±4.21 210.45±4.12 211.23±5.39 211.14±4.93 209.96±4.62

2.2 miR?421在抑郁大鼠的腦組織中表達上調測序結果顯示，在P＜0.05，|log2FC| ≥ 1的篩選條件下，相對于對照組，在抑郁模型大鼠共有206個差異表達的miRNA，其中上調的miRNA有47個，下調的有159個（圖1A、圖1B）。PCR結果表明，miR-421在抑郁大鼠海馬組織中高表達的（P＜0.001，圖1C）。

圖1 miR-421參與抑郁的發病過程Fig.1 miR-421 is involved in the pathogenesis of depression

2.3 miR?421靶向結合Menin使用TargetScan數據庫分析得知Menin作為miR-421的靶點之一（兩者的結構結合見圖2A）。本研究中，miR-421與Menin的結合關系在雙熒光素酶報告基因實驗中得到了驗證，結果顯示，與miR-421-MUT組相比，Menin可明顯下調miR-421-WT質粒的相對熒光素酶活性（圖2B），提示Menin可與miR-421特異性結合；qPCR結果表明，Menin在抑郁大鼠海馬組織中低表達的（P＜0.001，圖2C），當過表達miR-421時，Menin的表達會被抑制，當抑制miR-421的表達時，Menin的表達會升高（P＜0.001，圖2D、圖2E）。

圖2 miR-421調控Menin的表達Fig.2 miR-421 regulates the expression of Menin

2.4 糖水偏好度測試和曠場實驗結果與對照組比較，模型組大鼠的糖水消耗體積和糖水偏好率均顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，miR-421抑制組和Menin過表達組大鼠的糖水消耗體積、糖水偏好率均顯著升高（P＜0.001），miR-421過表達組和Menin抑制組大鼠的糖水消耗體積、糖水偏好率均顯著降低（P＜0.001）。見表3。曠場實驗中，與對照組比較，模型組的運動總距離、中央區運動距離（%）和中央區停留時間（%）顯著減少（P＜0.001）；與模型組比較，miR-421抑制組和Menin過表達組大鼠的運動總距離、中央區域運動距離（%）和中央區停留時間（%）均顯著增加（P＜0.001），miR-421過表達組和Menin抑制組大鼠的運動總距離、中央區域運動距離（%）均明顯減少（P＜0.01），中央區停留時間（%）減少（P＜0.05）。見表4。

表3 糖水偏好實驗Tab.3 Sugar water preference experiment ±s

表3 糖水偏好實驗Tab.3 Sugar water preference experiment ±s

注：與對照組相比，ΔΔΔP＜0.001；與模型組相比，***P＜0.001

組別對照組模型組miR-421過表達組miR-421抑制組Menin過表達組Menin抑制組糖水偏好率（%）80.16±5.32 36.79±3.94ΔΔΔ 16.53±0.86***70.66±3.72***71.05±3.77***16.65±1.08***糖水消耗體積（mL）14.31±1.12 6.61±0.79ΔΔΔ 3.01±0.50***12.08±0.75***12.24±0.58***3.11±0.37***

表4 曠場實驗Tab.4 Open field test ±s

表4 曠場實驗Tab.4 Open field test ±s

注：與對照組相比，ΔΔΔP＜0.001，與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

組別對照組模型組miR-421過表達組miR-421抑制組Menin過表達組Menin抑制組中央區停留時間（%）3.93±1.40 1.63±0.78ΔΔΔ 0.80±0.24*4.13±1.49***4.61±1.25***0.84±0.44*運動總距離（CM）1 354.80±281.56 678.93±138.28ΔΔΔ 350.42±245.43**1 364.59±428.18***1 477.53±333.41***357.58±240.46**中央區停留時間（%）9.78±2.53 3.63±1.25ΔΔΔ 1.60±0.62**10.19±2.27***10.41±2.59***1.72±0.55**

2.5 Menin是調控Caspase?3信號通路的關鍵因子qPCR檢測提示，Caspase-3、NF-κB在抑郁大鼠模型海馬組織中的表達顯著提高（P＜0.001），IL-1β在抑郁大鼠模型海馬組織中的表達明顯提高（P＜0.01），見圖3A。免疫印跡檢測結果顯示，當過表達Menin時，抑郁大鼠的Caspase-3、IL-1β、NF-κB會被下調，當抑制Menin時，抑郁大鼠的Caspase-3、IL-1β、NF-κB會被上調（P＜0.05，圖3B）。qPCR檢測，也同樣得到上述結果（P＜0.05，圖3C）。

圖3 Menin對Caspase-3信號通路的影響Fig.3 Effect of Menin on Caspase-3 signaling pathway

3 討論

研究證實腹腔注射LPS可誘導神經炎癥反應［14］，抑制神經炎癥反應可減輕抑郁樣行為［18-20］。本研究結果顯示，LPS可致使急性抑郁模型海馬組織中miR-421表達上調，降低Menin表達，提高Caspase-3、IL-1β、NF-κB等促炎細胞因子含量，誘導炎癥反應，提示抑郁動物模型建立完成。進一步研究發現，Menin與miR-421具有負相關的作用，抑制miR-421表達可上調Menin表達，降低LPS誘導的Caspase-3、IL-1β、NF-κB等促炎細胞因子含量，降低神經炎癥反應，從而改善急性抑郁動物模型的抑郁樣行為。

神經炎癥被廣泛認為是抑郁癥發生的病理機制之一，主要是通過激活炎性因子的活性，活化機體的炎癥反應，進而抑制海馬神經的發生，降低海馬突觸的可塑性，影響中樞神經元色氨酸的代謝，增強交感神經的神經活性，由此來參與抑郁癥的發生與發展［21-22］。大量研究表明，miRNA在多條與抑郁癥發病相關的生物途徑中發揮作用，可被作為抑郁癥治療的潛在生物靶點［23-26］。為進一步探究miRNA對LPS誘導的急性抑郁模型的作用機制，本研究發現，LPS誘導的急性抑郁模型Menin表達降低，Caspase-3表達升高；當抑制miR-421表達后，Menin表達升高，Caspase-3表達降低，且抑郁大鼠的食欲、體質量及運動能力得到恢復，提示抑制miR-421表達可上調Menin表達，降低海馬組織中Caspase-3、IL-1β、NF-κB等促炎因子含量，從而發揮抗神經炎癥作用，改善抑郁樣行為。所以，miR-421可調控Menin/Caspase-3通路改善抑郁樣行為，此調控通路可為抑郁癥的治療提供了新的靶點。

綜上所述，腹腔注射LPS可誘導神經炎癥反應發生，從而建立急性抑郁模型。抑制miR-421表達，可升高Menin表達，降低Caspase-3含量，發揮抗神經炎癥作用，恢復抑郁大鼠體重和運動能力，進而改善抑郁癥狀，為臨床治療抑郁癥提供新的方向。但是本研究僅涉及細胞實驗，未進行體內實驗，且抑郁癥機制復雜，神經炎癥反應只是其中一個發生機制；且在臨床上，抑郁癥多為慢性進展，本研究選取急性抑郁動物模型，實驗結果會具有一定的局限性。但本研究的結果為將來探究miR-421在抑郁癥靶向治療中的作用提供了理論依據，為今后挖掘更多的靶向治療信號通路奠定了基礎。